張會(huì)敏，孟雅靜，王艷麗，李安軍，劉國(guó)英，袁志強(qiáng)，張 嚴(yán)，邢新會(huì)

（1.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽 亳州 236820；2.清華大學(xué)化工系，北京 100084）

中國(guó)濃香型白酒發(fā)酵是重要的微生物發(fā)酵研究領(lǐng)域，老窖池窖泥豐富的菌群對(duì)提高白酒發(fā)酵質(zhì)量具有重要作用。目前，很多研究著眼于不同窖齡的窖泥菌群組成差異[1-4]。已知，隨著窖齡增加，窖泥菌群豐度增加，窖泥逐漸老熟。窖泥的老熟本質(zhì)上是窖泥菌群的老熟，窖泥菌群老熟過(guò)程中，受酒醅菌群的影響，即“萬(wàn)年糟”的作用。Wang Xueshan等[5]發(fā)現(xiàn)酒醅中的厭氧菌主要來(lái)自窖泥，即酒醅菌群也受窖泥菌群的影響。窖泥菌群和酒醅菌群具有相互影響的關(guān)系，黃水對(duì)維系兩個(gè)固體菌群的相互關(guān)系具有重要作用。黃水又稱黃漿水，是白酒發(fā)酵過(guò)程中原材料經(jīng)微生物分解代謝形成的游離水，其與各種有機(jī)物和微生物一起沉降于窖池底部。黃水被認(rèn)為含有窖池發(fā)酵過(guò)程中馴化的所有微生物菌種[6]，一方面，黃水對(duì)窖泥的影響類(lèi)似于降雨/灌溉對(duì)土壤的影響，黃水菌群隨黃水滲入窖泥，對(duì)窖泥菌群產(chǎn)生影響；另一方面，窖泥菌群中帶有鞭毛的厭氧菌隨黃水游弋到酒醅中影響酒醅菌群，如梭菌、瘤菌等。因黃水又被稱為“液體窖泥”，是“萬(wàn)年糟”作用的執(zhí)行者。

目前，黃水菌群的研究方法有傳統(tǒng)的純化培養(yǎng)方法、非培養(yǎng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）方法和磷脂分析法[7-9]。韓永勝等[10]通過(guò)純培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)，隨著窖齡增加，黃水的總酸、總酯等有機(jī)物含量和微生物數(shù)量有增加趨勢(shì)。王傳榮等[11]進(jìn)一步通過(guò)純化培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)黃水中的優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌、丁酸菌和己酸菌。李可等[7]通過(guò)純培養(yǎng)并構(gòu)建克隆文庫(kù)的方法發(fā)現(xiàn)黃水中的優(yōu)勢(shì)菌群為梭菌屬、乳酸菌屬和沙雷氏菌屬，并檢測(cè)到了甲烷菌的存在。Li Hui等[8]通過(guò)非培養(yǎng)的PCR-DGGE方法，發(fā)現(xiàn)黃水中的菌群組成主要有乳酸桿菌（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）和沉積菌屬（Sedimentibacter）。外，醋酸桿菌屬（A c e t o b a c t e r）、蛋白桿菌屬（Proteiniphilum）、喜熱菌屬（Caloramator）和甲烷菌也在黃水中檢測(cè)到[8-9]。而目前傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果為可以培養(yǎng)的菌屬，PCR-DGGE方法也不能給出菌屬的具體定量結(jié)果。因，基于自然界中未知菌/未培養(yǎng)菌占多數(shù)的情況[12]，需要相對(duì)更準(zhǔn)確的免培養(yǎng)方法全面解析黃水中的菌群組成。已知Clostridium、Sedimentibacter、Proteiniphilum和Caloramator是老窖泥中常見(jiàn)的厭氧菌屬，而甲烷菌的存在被認(rèn)為是濃香型窖泥老熟的標(biāo)志[13]。 可知，黃水菌群中含有老窖泥中典型的厭氧菌。與黃水相比，窖泥給菌群提供了一個(gè)相對(duì)封閉、穩(wěn)定、厭氧的生存環(huán)境。已知窖泥菌多數(shù)為厭氧菌[4]，因，黃水菌群中的厭氧菌有可能對(duì)窖泥菌群的老熟起重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤DNA提取試劑盒（D5625） 美國(guó)Omega Bio公司；AP-GX-50凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen 公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

2018年10月，選取兩組窖齡不同而發(fā)酵工藝相同的新老窖池，發(fā)酵結(jié)束時(shí)抽取黃水本。取6 個(gè)新窖池（窖齡6 a）新鮮黃水本，標(biāo)記為YN-1～YN-6；6 個(gè)老窖池（窖齡≥50 a）新鮮黃水本，標(biāo)記為YO-1～YO-6。另外取3 個(gè)老窖池黃水本封閉靜置培養(yǎng)5 個(gè)月，標(biāo)記為YO5-1～YO5-3；另外取3 個(gè)新窖池黃水本封閉靜置培養(yǎng)5 個(gè)月，標(biāo)記為YN5-1～YN5-3。以上18 個(gè)黃水本用于提取基因組后高通量測(cè)序。

1.3.2 理化性質(zhì)分析

采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)銨態(tài)氮含量；采用酸堿中和法測(cè)定酸度；采用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液反滴定法檢測(cè)淀粉和還原糖含量[14]；采用GB 11893ü 1989《水質(zhì) 總磷的測(cè)定》鉬酸銨分光光度法檢測(cè)黃水中的總磷。

KH2PO4（0.02 mol/L），柱流速0.1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm，柱箱溫度30 ℃。

1.3.3 DNA提取與Illumina高通量測(cè)序

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先將原始序列優(yōu)化得到用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。即：去掉長(zhǎng)度小于150 bp或者大于300 bp、模糊堿基數(shù)大于1、同聚堿基數(shù)目大于8、引物錯(cuò)配大于1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；雙向拼接（FLASH軟件v1.2.7）序列，剔除嵌合體（USEARCH，v5.2.236）序列。UCLUST聚類(lèi)（97%相似度）優(yōu)質(zhì)序列得到各可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU），認(rèn)定各OTU中豐度最高的序列為其代表序列。在80%可信度水平，使用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132）注釋各代表序列即為代表OTU的注釋結(jié)果，并形成OTU列表。去除OTU列表中序列數(shù)目少于總測(cè)序量0.001%的OTU。然后將OTU列表進(jìn)行100 次抽平，取平均，對(duì)取平均后的序列數(shù)進(jìn)行四舍五入取整，得到新的OTU列表。對(duì)抽平取后的OTU列表，使用Qiime軟件（v1.8.0）計(jì)其Shannon指數(shù)、Chao 1指數(shù)等微生物群落多性指數(shù)。使用Qiime軟件，對(duì)Weighted UniFrac距離矩陣分別進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，并使用R軟件（R3.3.2）進(jìn)行可視化。黃水本理化因子之間的差異顯著性分析通過(guò)SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）實(shí)現(xiàn)。黃水理化因子與其菌群組成之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）通過(guò)Canoco 5實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水本的理化性質(zhì)

新老窖池的新鮮黃水相比較，兩者的淀粉、還原糖、丙酸、乳酸、乙醇含量不具有顯著性差異，說(shuō)明新老窖池發(fā)酵糧食（淀粉）產(chǎn)生乙醇的主體過(guò)程無(wú)差異。如表1所示，與新窖池的新鮮黃水相比，老窖池的新鮮黃水中，丁酸、己酸、戊酸、乙酸、銨態(tài)氮的值偏高，而酸度略低。說(shuō)明：1）與新窖池相比，老窖池發(fā)酵過(guò)程中代謝形成的各種酸等風(fēng)味物質(zhì)較豐富，可能與老窖池發(fā)酵過(guò)程中己酸菌與甲烷菌之間存在良性的氫傳遞，更容易促進(jìn)己酸和丁酸等風(fēng)味物質(zhì)的合成有關(guān)[15]； 2）老窖池發(fā)酵過(guò)程中，銨態(tài)氮含量比較高，可能與老窖池中降解氨基酸的菌含量比較高有關(guān)，比如胺桿菌屬（Aminobacterium）；3）老窖池的新鮮黃水酸度略低，一方面與其中銨態(tài)氮含量較高有關(guān)，另一方面與乳酸含量略低（盡管兩者不具有顯著性差異）有關(guān)，因?yàn)閹追N有機(jī)酸中，乳酸的含量最大，且其pKa值最小，其對(duì)酸度的貢獻(xiàn)最大。

表 1 4 組黃水樣本的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of 4 groups of HS samples

新老窖池黃水經(jīng)過(guò)5 個(gè)月的封閉靜置培養(yǎng)后，丙酸、乳酸值無(wú)顯著變化，淀粉、還原糖、酸度值不同程度地降低，而銨態(tài)氮有所增加。說(shuō)明靜置培養(yǎng)過(guò)程黃水中的菌群生長(zhǎng)消耗了其中的淀粉、還原糖，同時(shí)生成了銨態(tài)氮（降解氨基酸的菌），如Aminobacterium[16-18]。最終黃水酸度有所下降。新老窖池黃水培養(yǎng)后的不同之處在于：老窖池黃水經(jīng)培養(yǎng)后，己酸和戊酸的值顯著降低；新窖池黃水培養(yǎng)后乙醇含量顯著降低，丁酸和乙酸的值顯著增加。目前已知，在窖泥中存在以乙醇[19-20]和乳酸[21]為前體生成丁酸/己酸的菌種。新窖池黃水經(jīng)過(guò)封閉靜置培養(yǎng)后，乙醇減少，同時(shí)丁酸和乙酸增加，很可能與其中存在以乙醇為前體的丁酸/己酸菌的代謝功能有關(guān)。相比較而言，老窖池黃水中的丁酸/己酸菌在封閉靜置培養(yǎng)期間似乎并不活躍。

2.2 黃水原核微生物群落的α多性

通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序，得到673 738 條平均長(zhǎng)度為207 bp的優(yōu)質(zhì)序列，平均30 182～53 152 條/本。對(duì)所有本10 次抽平（subsample）取平均四舍五入后，得到序列26 931～26 981 條/本，進(jìn)行后續(xù)分析。OTU聚類(lèi)（97%相似度）得到4 886 個(gè)OTU，平均77～580 個(gè)/本。每個(gè)本的測(cè)序覆蓋率大于99%，說(shuō)明測(cè)序數(shù)目足夠，測(cè)序序列可以代表其菌群組成。得到注釋（門(mén)、綱、目、科、屬）的序列大于99.9%，無(wú)法得到注釋的序列僅12 條序列，說(shuō)明對(duì)窖泥中大量的未培養(yǎng)菌也充分實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)分類(lèi)。如表2所示，新老窖池的新鮮黃水相比較，兩者微生物群落的OTU數(shù)目、Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)都不具有顯著性差異，經(jīng)過(guò)封閉靜置培養(yǎng)5 個(gè)月后，3 個(gè)微生物群落參數(shù)值均顯著升高，說(shuō)明靜置培養(yǎng)后黃水中的菌群豐度和多性增加。

表 2 4 組黃水樣本的細(xì)菌群落豐度和多樣性參數(shù)Table 2 Bacterial community richness and diversity indices of 4 groups of HS samples

2.3 黃水原核微生物群落的β多性

圖 1 4 組黃水樣本中15 個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)的相對(duì)豐度Fig. 1 Relative abundances of the 15 dominant phyla in 4 groups of HS samples

對(duì)OTU注釋，總共得到35 個(gè)門(mén)，其中32 個(gè)細(xì)菌門(mén)，3 個(gè)古菌門(mén)。在門(mén)的水平上，在新老窖池新鮮黃水中，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，分別占新老窖池新鮮黃水本的98.46%和95.72%。將相對(duì)豐度超過(guò)0.1%的門(mén)定義為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（圖1）。除Firmicutes外，其余4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在新老窖池新鮮黃水中的相對(duì)豐度依次為：變形菌門(mén)（Proteobacteria，1.0%和2.0%）、放線菌（Actinobacteria，0.11%和1.0%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，0.1%和0.36%）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi，0.03%和0.45%）。Firmicutes在黃水中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)情況也存在于窖泥中[1-2]，但在黃水中占的比例更大。

經(jīng)過(guò)封閉靜置培養(yǎng)5 個(gè)月后，新老窖池的黃水中的菌群組成發(fā)生變化。新老窖池黃水中Firmicutes的相對(duì)豐度分別下降為63.14%和79.59%；Proteobacteria在兩者中的豐度分別大幅上升至20.86%和12.88%；Bacteroidetes則分別上升至6.21%和1.74%；Actinobacteria分別上升至0.63%和2.79%；Chloroflexi分別上升至1.32%和0.47%。外，經(jīng)過(guò)靜置培養(yǎng)后，互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）在老窖池黃水中的相對(duì)豐度上升幅度很大（由0.06%變?yōu)?.11%），而在新窖池黃水中變化幅度相對(duì)較?。ㄓ?.02%變?yōu)?.46%）。通過(guò)靜置培養(yǎng)，黃水菌群與窖泥菌群中的組成更接近了，比如Firmicutes與窖泥中的菌群組成更接近。

圖 2 4 組黃水樣本中8 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundances of the 8 dominant genera in 4 groups of HS

圖 3 18 個(gè)黃水樣本菌群Weighted Unifrac Distance聚類(lèi)圖Fig. 3 Cluster analysis of the 18 HS samples based on Weighted Unifrac Distance

對(duì)O T U 注釋，共得到6 6 4 個(gè)屬，注釋度為97.81%，其余序列只能不同程度地注釋到門(mén)、綱、目、科等級(jí)別。注釋度之所以如高，因?yàn)辄S水本中的屬種非常集中，Lactobacillus占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。除Lactobacillus，黃水本中相對(duì)豐度超過(guò)1%的優(yōu)勢(shì)菌屬還有：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、雙歧黃色高溫菌屬（Thermoflavimicrobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、產(chǎn)己酸菌屬（Caproiciproducens）和Aminobacterium（圖2）。

圖 4 4 組黃水樣本中8 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度 Fig. 4 Relative abundance of the 8 dominant genera in 4 groups of HS samples

深入分析黃水中優(yōu)勢(shì)菌屬在封閉靜置培養(yǎng)前后的變化（圖4）可知，經(jīng)過(guò)封閉靜置培養(yǎng)后，新老窖池黃水本中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬Lactobacillus的相對(duì)豐度分別降低至52.5%和68.55%。推測(cè)很可能與封閉靜置培養(yǎng)條件下的缺氧環(huán)境不利于兼性厭氧菌Lactobacillus的增殖有一定關(guān)系。外，黃水中的其余7 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度都顯著性增加。

除上述提到的Caproiciproducens和Aminobacterium，窖泥中還存在很多功能菌[1,3]， 如棒狀桿菌（Caldicoprobacter）[31]、貪銅菌屬（Cupriavidus）[32]、 甲烷囊菌屬（M e t h a n o c u l l e u s）[2]、瘤梭菌（Ruminiclostridium）[33]、Sedimentibacter[2]和互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）[2]，其對(duì)窖泥的老熟具有很重要的作用。圖5為這些菌屬在4 組黃水中的相對(duì)豐度。經(jīng)過(guò)封閉靜置培養(yǎng)后，6 株菌在新老窖池黃水中的相對(duì)豐度都有不同程度的升高。與新窖池黃水相比，老窖池黃水經(jīng)過(guò)封閉靜置培養(yǎng)Methanoculleus、Sedimentibacter、Syntrophomonas的相對(duì)豐度增加更多。說(shuō)明黃水中含有大量促進(jìn)窖泥老熟的菌種，且黃水可以提供這些菌種在厭氧條件下生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖 5 6 個(gè)窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬在4 組黃水樣本中的相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of 6 PM-dominant genera in 4 groups of HS samples

2.4 黃水本理化性質(zhì)與菌群之間的RDA

圖 6 黃水的理化因子與其菌群之間的RDAFig. 6 Redundancy analysis of the physicochemical factors and HS prokaryotic communities

如圖6所示，2 個(gè)主成分的總解釋度為87.49%，但是兩個(gè)坐標(biāo)軸上的解釋度相差懸殊，主要集中在RDA1（86.16%）。以橫軸為分界點(diǎn)，封閉靜置培養(yǎng)前的新鮮黃水本集中在左側(cè)，靜置培養(yǎng)后的黃水本散布在右側(cè)。由也可得知，與窖池的窖齡相比，是否靜置培養(yǎng)對(duì)黃水本的菌群組成影響更大，與圖3結(jié)論一致。圖6中還原糖、淀粉、酸度和乙醇與新鮮黃水本菌群呈強(qiáng)烈正相關(guān)，銨態(tài)氮與靜置培養(yǎng)黃水呈正相關(guān)，表明新鮮黃水中還原糖、淀粉、酸度和乙醇的值偏高，靜置培養(yǎng)后的黃水銨態(tài)氮升高。使用互動(dòng)向前選擇程序驗(yàn)收11 個(gè)理化因子，發(fā)現(xiàn)參數(shù)還原糖的解釋度最高65%（P＜0.01）。外，其余理化指標(biāo)的貢獻(xiàn)率都不具有顯著性，指標(biāo)（解釋度）分別為：己酸（6.2%）、乳酸（5.9%）、銨態(tài)氮（2.7%）、乙酸（2.2%）、丁酸（1.7%）、酸度（1.4%）、淀粉（1.2%）、乙醇（0.9%）、戊酸（0.3%）、丙酸（0.2%）。

3 討 論

新老窖池新鮮黃水中淀粉、還原糖、丙酸、乳酸、乙醇的含量不具有顯著性差異。與新窖池相比，老窖池新鮮黃水中，即老窖池酒醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的丁酸、己酸、戊酸、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)含量較豐富，同時(shí)產(chǎn)生的銨態(tài)氮的含量較高。己酸是生成濃香型白酒特色風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯的前體物質(zhì)，與“窖池越老，酒質(zhì)越好”的結(jié)論一致。銨態(tài)氮是菌群生長(zhǎng)的氮源，老窖池黃水中銨態(tài)氮含量高與老窖池中菌群含量更豐富有關(guān)系。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序分析黃水中的原核菌群組成，證明靜置培養(yǎng)有利于窖泥老熟菌屬的增加，尤其是老黃水中，窖泥老熟菌屬的增加更明顯，比如Aminobacterium相對(duì)豐度從0.47%升到1.97%，已知優(yōu)質(zhì)老窖泥中Aminobacterium相對(duì)豐度顯著高于新窖泥[4]。Methanoculleus相對(duì)豐度從接近于0%上升到0.24%，已知新窖泥中的Methanoculleus相對(duì)豐度為0.16%，25 a窖齡窖泥中的相對(duì)豐度上升到1.56%[2]。靜置培養(yǎng)后的老黃水中Methanoculleus的相對(duì)豐度盡管沒(méi)有達(dá)到老窖泥中的豐度，但說(shuō)明黃水中天然有促進(jìn)窖泥老熟的菌種存在，為將來(lái)通過(guò)自然培養(yǎng)黃水改良窖泥提供了一種思路。而考慮到黃水環(huán)境與窖泥環(huán)境的差異，需要進(jìn)一步摸索適宜黃水中窖泥老熟菌種生存繁殖的條件。實(shí)現(xiàn)對(duì)黃水的自然培養(yǎng)并應(yīng)用于促進(jìn)窖泥老熟的養(yǎng)護(hù)，不但有利于促進(jìn)窖泥老熟，對(duì)黃水的處理也有重要意義。因?yàn)辄S水的化學(xué)需氧量值很高，排放會(huì)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家允許的廢水排放指標(biāo)[34]。目前，有研究直接將黃水蒸餾制成低度黃 水酒[35]，但只是將黃水中的乙醇進(jìn)行回收利用；有研究通過(guò)超臨界CO2萃取技術(shù)從黃水中提取風(fēng)味物質(zhì)[36]，但成本太高。外，柴玉強(qiáng)等[37]提出將黃水進(jìn)行次發(fā)酵再蒸餾酒的方法。本研究嘗試了直接靜置厭氧培養(yǎng)黃水的方法，可能解決黃水的處理問(wèn)題，將黃水變廢為寶，用于窖泥改良，將來(lái)還需要對(duì)黃水作為“液體窖泥”的培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步研究。