王培培 楊 菲,2

（1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京100069；2首都醫(yī)科大學(xué)人腦保護(hù)高精尖中心，北京100069）

各種類型的神經(jīng)病理性疼痛在慢性疼痛中占據(jù)了相當(dāng)大的比例，但是很多情況下現(xiàn)有鎮(zhèn)痛藥物未能有效緩解神經(jīng)病理性疼痛病人的癥狀。脊髓電刺激 (spinal cord stimulation, SCS) 作為一種非藥物治療手段，對(duì)于一些藥物難于治療的神經(jīng)病理性疼痛，例如腰椎手術(shù)失敗綜合征等具有明顯的治療效果，從而受到國內(nèi)外慢性痛治療和研究領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的廣泛關(guān)注[1～3]。盡管如此，SCS的鎮(zhèn)痛療效仍有很大的提升空間，其中部分原因是其鎮(zhèn)痛機(jī)制尚未完全闡明。在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)50 Hz 的SCS治療可以緩解神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的機(jī)械性痛覺過敏，并且其神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制包括抑制傷害性傳入纖維 （C纖維）在脊髓背角的信息傳遞和整合，例如SCS可以抑制脊髓背角淺層C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的幅度和深層廣動(dòng)力范圍神經(jīng)元C成分的放電數(shù)量[4,5]。此外，有報(bào)道稱SCS可以通過調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)，例如膽堿能[6]、5-羥色胺能[7]和阿片系統(tǒng)[8]達(dá)到鎮(zhèn)痛目的。最近有研究報(bào)道[4]，CB1 (cannabinoid type 1) 受體的拮抗劑AM251可以阻斷SCS對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械性痛敏的緩解，并減弱SCS對(duì)脊髓背角淺層C纖維突觸傳遞的抑制。但是，CB2受體拮抗劑沒有對(duì)SCS產(chǎn)生的傷害性傳遞抑制產(chǎn)生明顯影響。以上結(jié)果說明脊髓節(jié)段的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在SCS對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛中發(fā)揮作用。

內(nèi)源性大麻素作為一類具有生物活性的脂質(zhì)信號(hào)分子，可以參與調(diào)控傷害性信息傳遞和突觸可塑性變化，從而影響痛覺抑制的維持時(shí)間[9]。內(nèi)源性大麻素主要包括N-花生四烯酸氨基乙醇 (anandamide, AEA) 和2-花生四烯酸甘油 (2-arachidonoyl glycerol, 2-AG)，相應(yīng)的作用受體主要是大麻素1型 CB1和 2型 (cannabinoid type 2, CB2) 受體[10]。除了CB1和CB2受體，內(nèi)源性大麻素特別是AEA還可以作用于瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1 (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1) 受體[11]。外周神經(jīng)系統(tǒng)中的TRPV1受體主要作為傷害性感受器感知溫度和化學(xué)刺激，但脊髓的TRPV1受體可以參與C纖維的長時(shí)程突觸可塑性調(diào)節(jié)，而其是否參與SCS對(duì)C纖維突觸傳遞的抑制作用尚不得而知。同時(shí)，SCS對(duì)脊髓背角淺層和深層傷害性信息傳遞的抑制是否具有不同機(jī)制也缺少報(bào)道。因此，本研究通過在體電生理技術(shù)分別記錄脊髓背角淺層 （I-II層）的C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位(C-fiber evoked local field potential, C-LFP) 和深層（III-V層）的廣動(dòng)力范圍 (wide dynamic range, WDR) 神經(jīng)元，使用TRPV1受體拮抗劑AMG9810研究脊髓TRPV1受體是否參與SCS引發(fā)的C纖維傳遞抑制。同時(shí)，通過背根神經(jīng)節(jié)局部注射TRPV1激動(dòng)劑樹膠脂毒素(resiniferatoxin, RTX) 清除外周神經(jīng)系統(tǒng)的TRPV1受體，進(jìn)一步探究脊髓背角突觸前TRPV1受體是否參與了SCS的抑制作用。

方 法

所有程序均由首都醫(yī)科大學(xué)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部 2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》，以確保最小的動(dòng)物使用量并減少其不適。大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，并在隔離籠中保持12 h/12 h晝夜循環(huán)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉 (100～300 mg)處理所有動(dòng)物。

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)中所使用的SPF級(jí)成年雄性250～300 g的Sprague-Dawley大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，均由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買和飼養(yǎng)。

2.儀器設(shè)備

電生理放大器 (World Precision Instruments,DAM80)；鎢絲電極 (FHC)；刺激器 (A-M Systems,Model 2100)；濾波器 (Krohn-hite, Model 3362)；數(shù)據(jù)采集系統(tǒng) (Cambridge Electronic Design Limited,Power1401-3A)。

3.主要藥品

TRPV1受體拮抗劑AMG9810（Tocris，脊髓表面給藥，50 mg/100 μl）；TRPV1受體激動(dòng)劑Resiniferatoxin (RTX, Sigma Aldrich，背根神經(jīng)節(jié)注射，200 ng/10 μl)。

4.L5脊神經(jīng)結(jié)扎 (spinal nerve ligation, SNL)模型

大鼠經(jīng)1.5%～2%的異氟烷麻醉后，暴露并移除左側(cè)椎骨L6節(jié)段的橫突，使用6-0絲線對(duì)左側(cè)L5脊神經(jīng)進(jìn)行緊結(jié)扎，并于結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)心端剪斷神經(jīng)。手術(shù)后監(jiān)測(cè)動(dòng)物是否有傷口感染、食物和水?dāng)z入不足或體重減輕癥狀，直至手術(shù)部位愈合。

5.背根神經(jīng)節(jié)注射

大鼠經(jīng)1.5%～2%的異氟烷麻醉后，于背部左側(cè)中線切開皮膚約3 cm，鈍性分離肌肉，暴露L4到L6節(jié)段椎骨。使用咬骨鉗小心移除L4節(jié)段橫突，暴露L4背根神經(jīng)節(jié)。使用微量注射器緩慢注入10 μl RTX溶液或等量vehicle（1%乙醇溶液）。

6.在體電生理記錄

（1）復(fù)合動(dòng)作電位記錄：使用異氟烷 (1.5%)麻醉大鼠，進(jìn)行氣管切開術(shù)和機(jī)械提供通氣 (Kent Scientific Corporation, Litchfield, CT)。本實(shí)驗(yàn)中將單極銀鉤電極置于左側(cè)坐骨神經(jīng)上以記錄復(fù)合動(dòng)作電位 (compound action potential, CAP)，通過硬膜外電極施加不同強(qiáng)度電刺激誘發(fā)逆行的坐骨神經(jīng)CAP(0.1～5.0 mA，0.2 ms)。在線確定了導(dǎo)致第一個(gè)可檢測(cè)A/波形 (Ab0) 和峰值A(chǔ)/波形 (Ab1)，但不會(huì)產(chǎn)生A或C纖維成分的電流閾值，以此作為參照在接下來的實(shí)驗(yàn)中設(shè)定SCS的刺激強(qiáng)度。

（2）局部場(chǎng)電位記錄：異氟烷麻醉下 (1.5%) 的大鼠暴露L4脊髓節(jié)段，去除硬腦膜，使用微電極推進(jìn)器將鎢絲電極下至左側(cè)脊髓背角淺層200～500 μm。通過電刺激左側(cè)坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角局部場(chǎng)電位 (local field potential, LFP)，采樣頻率寬度設(shè)為1～300 Hz，根據(jù)不同的潛伏期和閾值區(qū)分A纖維和C纖維誘發(fā) (90～130 ms，7～13 V) 成分。使用基于計(jì)算機(jī)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng) (CED Spike 2,UK) 來收集模擬數(shù)據(jù)。在SCS前15 min和SCS后0～30 min，使用坐骨神經(jīng)上的測(cè)試電刺激 (25 V，0.5 ms，每分鐘1個(gè)測(cè)試) 誘發(fā)C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位(C-fiber evoked field potential, C-LFP)。

廣動(dòng)力范圍神經(jīng)元記錄：手術(shù)過程與LFP記錄相同，記錄電極深入脊髓背角深層500～1 000 m，采樣頻率寬度為1～1 kHz。通過機(jī)械刺激左側(cè)足底尋找廣動(dòng)力范圍 (wide dynamic range, WDR) 神經(jīng)元，確定后通過坐骨神經(jīng)電刺激誘發(fā)WDR神經(jīng)元反應(yīng)，并通過興奮閾值和潛伏期區(qū)分其中的A成分和C成分。在SCS前，SCS后15和30 min分別記錄逐漸增加電刺激 (1～10 mA) 誘發(fā)的WDR神經(jīng)元C成分放電數(shù)量，以觀察SCS對(duì)WDR神經(jīng)元傷害性反應(yīng)的抑制作用。

7.實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)中共使用36只SD大鼠用于SNL造模，造模后分成兩組各18只，分別用于C-LFP記錄和WDR神經(jīng)元記錄。每組的18只大鼠在電生理實(shí)驗(yàn)前5天在背根神經(jīng)節(jié)注射溶媒（SCS + vehicle和SCS + AMG9810組，各6只）或RTX（SCS + RTX組，6只）。在電生理記錄當(dāng)天，SCS + vehicle組和SCS + RTX組在脊髓表面給予AMG9810的溶媒。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤()呈現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)方法采用雙因素方差分析和Bonferroni多重比較檢驗(yàn)，P< 0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.在體電生理記錄CAP, C-LFP和WDR神經(jīng)元

為檢測(cè)SCS對(duì)C-LFP和WDR神經(jīng)元反應(yīng)性的抑制作用，在SNL造模后3～4周對(duì)大鼠進(jìn)行在體電生理記錄（見圖1A）。首先，通過雙極電極刺激大鼠左側(cè)T13至L1脊髓節(jié)段的背柱組織，可以在同側(cè)坐骨神經(jīng)記錄到逆行的復(fù)合動(dòng)作電位 (CAP)。根據(jù)潛伏期和刺激強(qiáng)度的不同，CAP可以被分成Aα/β和Aδ成分。將剛剛誘發(fā)出可檢測(cè)的Aα/β成分的電流強(qiáng)度定義為Aβ閾值 (Ab0)，而能夠誘發(fā)出Aα/β成分最大值，同時(shí)沒有激活A(yù)δ和C纖維成分的電流強(qiáng)度被定義為Aβ峰值(Ab1)（見圖1B）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的SCS都將使用5 min，50 Hz，Ab1強(qiáng)度的刺激模式。在確定了SCS刺激強(qiáng)度后，我們通過電刺激坐骨神經(jīng)，在脊髓背角淺層或深層分別尋找LFP或者WDR神經(jīng)元。根據(jù)潛伏期的不同，脊髓LFP（見圖1C）和WDR（見圖1D）神經(jīng)元反應(yīng)可以分為A纖維誘發(fā)的早成分 (A-component) 和C纖維誘發(fā)的晚成分 (C-component)。

2.阻斷或清除TRPV1受體可以減弱或反轉(zhuǎn)SCS對(duì)C-LFP的抑制作用。

在溶媒對(duì)照組中，當(dāng)給予SCS (5 min, 0.2 ms,50 Hz, Ab1)后，C-LFP的曲線下面積出現(xiàn)了即刻的下降，并且在刺激后0～10 min內(nèi)相比于基礎(chǔ)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖2A, B）。而SCS對(duì)C-LFP的抑制作用維持時(shí)間較短，停止刺激15 min后回到了基線水平。而如果在脊髓表面給予AMG9810后15 min再給予相同參數(shù)的SCS，C-LFP曲線下面積的下降程度得以減弱，并且刺激后0～10 min內(nèi)的統(tǒng)計(jì)值和基礎(chǔ)值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖2A, B）。

圖1 電生理記錄模式圖和典型圖Fig.1 Setup and represent figure of Electrophysiological recording

背根神經(jīng)節(jié)局部注射RTX后5天，會(huì)造成外周TRPV1陽性神經(jīng)元死亡，從而清除外周神經(jīng)系統(tǒng)的TRPV1受體。相比于溶媒組（與圖2A中相同），經(jīng)RTX處理過的SNL大鼠在給予SCS后C-LFP的曲線下面積沒有出現(xiàn)縮小，反而逐漸增大，并在10～30 min期間相比于基礎(chǔ)值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖2C, D）。

3.清除外周TRPV1受體可以延長SCS對(duì)WDR神經(jīng)元C成分的抑制。

通過在坐骨神經(jīng)上施加電流強(qiáng)度 (0.1, 0.2, 0.3,0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10 mA)逐漸增大的電刺激，WDR神經(jīng)元的C纖維成分逐漸增多。在溶媒對(duì)照組中，給予SCS后0～15 min內(nèi)，WDR神經(jīng)元的C纖維反應(yīng)受到抑制，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （見圖3A, D）。而刺激后30～45 min內(nèi)，C纖維反應(yīng)逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)值水平。在SCS刺激之前15 min脊髓表面給予AMG9810，并沒有對(duì)SCS后WDR神經(jīng)元C成分抑制的程度和時(shí)程產(chǎn)生顯著影響（見圖3B, D）。而在經(jīng)RTX處理過的大鼠中，SCS的抑制作用甚至得以延長，表現(xiàn)為SCS后0～15和30～45 min時(shí)C纖維反應(yīng)相比于基礎(chǔ)值均有顯著下降（見圖3C, D）。

圖2 TRPV1受體參與SCS對(duì)C-LFP的抑制作用 (n = 6,EM)Fig.2 TRPV1 receptors are involved in the inhibition of C-LFP by SCS (n = 6,EM)

討 論

SCS作為一種行之有效的鎮(zhèn)痛手段，其最初建立就是基于Wall和Melzack在1965年提出的疼痛門控理論(gate control theory, GCT)。因此，闡明脊髓節(jié)段的鎮(zhèn)痛機(jī)制對(duì)于解釋和改進(jìn)SCS的鎮(zhèn)痛效果具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。在之前的一系列研究中，作者已經(jīng)在大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中廣泛證明了50 Hz的SCS可以緩解機(jī)械性痛覺過敏[4,12]。此外，利用在體電生理技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)SCS后神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角的C-LFP和WDR神經(jīng)元C纖維成分的興奮性都受到明顯抑制[13,14]。同時(shí)，脊髓節(jié)段的內(nèi)源性大麻素和CB1受體參與了SCS對(duì)C-LFP的抑制作用。在本研究中，作者針對(duì)內(nèi)源性大麻素的潛在受體TRPV1在SCS對(duì)C-LFP和WDR神經(jīng)元的傷害性傳遞抑制中的作用開展了進(jìn)一步的探索。研究結(jié)果顯示，脊髓節(jié)段局部給予TRPV1受體拮抗劑AMG9810可以減弱給予50 Hz SCS后C-LFP曲線下面積的縮小，但不影響SCS對(duì)WDR神經(jīng)元C成分的抑制。利用TRPV1受體激動(dòng)劑RTX，我們清除了外周的TRPV1受體及其陽性神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RTX處理的神經(jīng)病理性疼痛大鼠中SCS不能抑制C-LFP，但是對(duì)WDR神經(jīng)元C成分的抑制反而被延長。以上的結(jié)果提示，50 Hz SCS對(duì)脊髓背角淺層和深層傷害性信息傳遞抑制具有不同的潛在機(jī)制，而脊髓突觸前TRPV1受體在其中發(fā)揮不同的功能。

圖3 SCS對(duì)WDR神經(jīng)元C成分抑制作用中TRPV1受體的功能 (n = 6,EM)Fig.3 The role of TRPV1 receptors in SCS-induced inhibition of C-component of WDR neuronal responses (n = 6,EM)

TRPV1受體在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，尤其是在外周背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglia, DRG) 神經(jīng)元胞體和纖維上，脊髓中TRPV1受體也主要表達(dá)在DRG神經(jīng)元傳入纖維的末梢端，即突觸前膜上。DRG神經(jīng)元外周端上的TRPV1受體是一種非常重要的傷害性感受器，可以感受熱、化學(xué)等傷害性刺激，并參與慢性痛的病理進(jìn)程[15]。而脊髓突觸前膜上的TRPV1則可以通過通透鈣離子，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。作者之前的研究也顯示，脊髓TRPV1可以參與突觸可塑性，例如參與電刺激或傷害性刺激誘發(fā)的脊髓長時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation,LTP)[16]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，SCS可以誘發(fā)C-LFP和WDR神經(jīng)元C成分反應(yīng)的短時(shí)程抑制，即一種短時(shí)程的突觸可塑性改變。本研究也首次發(fā)現(xiàn)脊髓的TRPV1受體參與這種短時(shí)程的突觸可塑性變化，但這種參與具有脊髓層面的特異性，背后機(jī)制的差異還有待具體研究。

TRPV1受體激動(dòng)劑RTX可以通過過度激活TRPV1受體，引起大量陽離子內(nèi)流，從而殺死TRPV1陽性的外周神經(jīng)元，進(jìn)而清除外周TRPV1受體[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，也利用這一方法，特異性的清除外周DRG神經(jīng)元上的TRPV1受體，來研究脊髓背角突觸前膜上TRPV1受體在SCS中的作用。但由于RTX注射后所剩下的C纖維均為TRPV1陰性，其生理特性與TRPV1陽性C纖維本就不同，例如TRPV1陰性C纖維多為非肽能，而TRPV1陽性纖維多為肽能。因此SCS在RTX處理后大鼠中對(duì)C纖維突觸傳遞的抑制作用變化不能僅僅解釋為TRPV1缺失，也有可能是因?yàn)镃纖維構(gòu)成的改變所導(dǎo)致的，這一點(diǎn)需要在未來的實(shí)驗(yàn)中加以鑒別。