劉志平，趙致維，張金華

武漢市漢口醫(yī)院 消化內(nèi)科，武漢 430012

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病率逐年攀升，已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。胰島素抵抗(IR)、氧化應(yīng)激、炎癥和遺傳傾向等多個(gè)因素參與了NAFLD的發(fā)生和發(fā)展，NAFLD與2型糖尿病、肥胖、血脂紊亂等多種代謝性疾病存在密切相關(guān)性[1]。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide, GLP)1類(lèi)似物艾塞那肽治療肥胖性2型糖尿病患者的同時(shí)，還可以降低患者肝細(xì)胞的脂質(zhì)含量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4]亦發(fā)現(xiàn)，GLP-1類(lèi)似物利那魯肽可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟中的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)水平。近年來(lái)關(guān)于腸道菌群失調(diào)與2型糖尿病、NAFLD的研究逐漸成為熱點(diǎn)，GLP-1作為一種腸促胰素，被發(fā)現(xiàn)與腸道菌群之間亦存在千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。對(duì)無(wú)菌小鼠進(jìn)行糞菌移植后可減少其胃腸道GLP-1受體的表達(dá)并促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，提示腸道菌群可能影響GLP-1生物學(xué)作用的發(fā)揮[5]。然而腸道菌群是否對(duì)GLP-1的分泌水平存在直接的影響尚不清楚。本研究通過(guò)觀察NAFLD患者血清GLP-1水平及腸道菌群的變化，探討NAFLD患者血清GLP-1水平的變化及其與腸道菌群失調(diào)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年1月-2018年12月期間在本院就診的NAFLD患者116例，NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并酒精性肝病者、病毒性肝炎者、自身免疫性肝病者、肝豆?fàn)詈俗冃哉?、藥物性肝病者；合并?yán)重高血壓者；合并明確的糖尿病者；合并嚴(yán)重心、腎功能不全者；合并肝臟惡性腫瘤、感染或膽道疾病者；所有病因不能確定的肝功能異常者。另外選取在本院體檢的96例健康體檢者作為對(duì)照組。本研究方案經(jīng)由武漢市漢口醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：2018022601)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 資料收集及指標(biāo)檢測(cè) 收集所有患者的性別、年齡、既往病史等臨床資料，安排專(zhuān)人測(cè)量其身高、體質(zhì)量，并計(jì)算BMI。所有受試者禁食10 h后于次晨抽取靜脈血標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)指標(biāo)。空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)測(cè)定采用氧化酶法；血清空腹胰島素(fasting insulin, FINS)檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光法(試劑盒產(chǎn)自德國(guó)羅氏公司)；血清GLP-l測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒產(chǎn)自美國(guó)R&D公司)。穩(wěn)態(tài)模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù):HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5。

1.3 腸道菌群檢測(cè) 采集所有患者的新鮮糞便標(biāo)本1.0 g左右置入無(wú)菌密閉便盒送檢。取糞便標(biāo)本0.1 g加入裝有0.9 ml生理鹽水的無(wú)菌試管內(nèi)，按連續(xù)10倍稀釋法稀釋后分別接種于不同的培養(yǎng)基上。腸桿菌、腸球菌和葡萄球菌等需氧菌置于37 ℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；雙歧桿菌、乳酸桿菌和擬桿菌置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。觀察培養(yǎng)結(jié)果，計(jì)數(shù)以每克濕糞中菌落形成單位的對(duì)數(shù)值表示(log cfu/g)。同時(shí)計(jì)算雙歧桿菌與腸桿菌數(shù)值之比(B/E比值)評(píng)估腸道菌群定植抗力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料2組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析和偏相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 NAFLD組BMI、TG、TC、LDL-C、FINS、HOMA-IR水平高于對(duì)照組，而血清GLP-1水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 2組一般資料及生化指標(biāo)比較

2.2 腸道菌群數(shù)量及B/E比值比較 與對(duì)照組比較，NAFLD組雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌數(shù)量及B/E比值降低，而腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌數(shù)量則顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 2組腸道細(xì)菌數(shù)量及B/E值比較

2.3 血清GLP-1水平的影響因素分析 Pearson相關(guān)分析顯示，血清GLP-1水平與B/E比值呈正相關(guān)(r=0.604，P=0.008)，而與BMI(r=-0.551，P=0.013)、TG(r=-0.424，P=0.035)、TC(r=-0.386，P=0.041)、LDL-C(r=-0.445，P=0.011)、HOMA-IR(r=-0.503，P=0.021)呈負(fù)相關(guān)?？刂艬MI、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR等因素后，GLP-1與B/E比值仍然呈正相關(guān)(r=0.576，P=0.015)。

3 討論

NAFLD病理特征表現(xiàn)為肝臟脂肪含量增多、彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，它不僅導(dǎo)致肝臟的損害，還與IR、糖尿病、肥胖、血脂紊亂等代謝綜合征存在明顯的相關(guān)性，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腸-肝軸在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目前已知腸道菌群作為一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其數(shù)量龐大、品種繁多，某些種類(lèi)細(xì)菌對(duì)人體是有益的，而某些種類(lèi)的細(xì)菌卻影響身體健康，還有一些種類(lèi)的細(xì)菌目前作用尚不明確。在腸道內(nèi)這些細(xì)菌按一定比例組合成一個(gè)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)，在維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起到了至關(guān)重要的作用。不論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是人體研究均發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展均存在密切相關(guān)性[7]。與正常人群相比，肥胖和NAFLD患者，不同種類(lèi)的腸道細(xì)菌在數(shù)量上有著顯著差異，而且限制脂肪的飲食方式可以改變腸道菌群的數(shù)量[8]。本研究中亦有相似的發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者與健康人群相比，雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌數(shù)量降低，而腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌數(shù)量則顯著升高。Boursier等[9]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者中，腸道菌群數(shù)量的變化與非酒精性脂肪性肝炎及肝臟纖維化評(píng)分之間存在顯著的相關(guān)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中，腸道優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁桿菌的小鼠出現(xiàn)了血糖升高與炎性因子增加，而將其盲腸內(nèi)細(xì)菌接種到高脂飲食的無(wú)菌小鼠體內(nèi)后則發(fā)現(xiàn)，小鼠肝細(xì)胞TG沉積嚴(yán)重，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性?？偠灾壳坝谐浞值淖C據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)與NAFLD存在密切關(guān)聯(lián)。而且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充腸道益生菌制劑能夠緩解NAFLD病情。一項(xiàng)針對(duì)NAFLD兒童患者進(jìn)行的雙盲隨機(jī)臨床試驗(yàn)[11]發(fā)現(xiàn)，服用VSL#3(益生菌制劑)可有效改善兒童NAFLD病情。王薇等[12]發(fā)現(xiàn)，以雙歧三聯(lián)活菌、枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌等益生菌治療NAFLD患者，在改善NAFLD患者腸道微生態(tài)失衡的同時(shí)，還能降低血清TNFα水平，提升脂聯(lián)素水平，降低血糖、血脂及轉(zhuǎn)氨酶水平，減輕脂肪肝病變程度。因此，腸道菌群在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色，腸道菌群失調(diào)參與NAFLD的機(jī)制可能涉及肝臟能量代謝及炎癥因子激活等多條途徑，目前尚有待進(jìn)一步研究。

GLP-1是由位于腸道的L細(xì)胞分泌的一種強(qiáng)效腸促胰素，GLP-1依賴(lài)血糖水平調(diào)節(jié)胰島素分泌，在改善血糖的同時(shí)又能防止低血糖的發(fā)生，在維持機(jī)體血糖穩(wěn)定中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。近年來(lái)，臨床上GLP-1類(lèi)似物已經(jīng)被廣泛用于2型糖尿病的治療，不僅在控制血糖方面獲得了良好的效果，還可以減輕體質(zhì)量、改善血脂代謝紊亂。不僅如此，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1在治療2型糖尿病的同時(shí)，還可以緩解NAFLD。侯洪濤等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽可能通過(guò)下調(diào)肝組織細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C的mRNA表達(dá)，改善高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠的IR，減少肝臟TG沉積。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清GLP-1水平降低，而且與BMI、TG、TC、LDL-C及IR存在負(fù)相關(guān)，提示內(nèi)源性GLP-1水平不足與體質(zhì)量增加、血脂代謝紊亂及IR等多個(gè)NAFLD危險(xiǎn)因素存在關(guān)聯(lián)。這一結(jié)果為GLP-1緩解NAFLD的相關(guān)理論[15]提供了進(jìn)一步的依據(jù)。近年來(lái)關(guān)于腸道菌群與GLP-1的關(guān)系開(kāi)始逐漸受到關(guān)注。目前已有研究[16]發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸、次級(jí)膽汁酸等可能參與了調(diào)控腸道L細(xì)胞分泌GLP-1，另外腸道菌群失調(diào)還可能與GLP-1抵抗有關(guān)。本研究對(duì)比了NAFLD組與健康對(duì)照組之后發(fā)現(xiàn)，NAFLD組存在雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌數(shù)量及B/E比值降低，而腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌數(shù)量則顯著高于健康對(duì)照組，而且血清GLP-1水平與B/E比值之間存在正相關(guān)，提示GLP-1水平降低與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。因此，腸道菌群對(duì)GLP-1的影響可能涉及多條途徑，不僅能調(diào)控其分泌，還可能影響其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。

總之，NAFLD患者體質(zhì)量增加、血脂紊亂及IR可能與腸道GLP-1分泌不足有關(guān)，而腸道菌群紊亂可能通過(guò)某些尚不明確的途徑參與了GLP-1的分泌調(diào)控過(guò)程。進(jìn)一步研究腸道菌群相關(guān)代謝產(chǎn)物影響腸道L細(xì)胞GLP-1分泌的具體機(jī)制，將有助于明確腸道菌群參與NAFLD發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)途徑，為臨床應(yīng)用益生菌防治NAFLD提供更多的理論依據(jù)和治療措施。