郝家欣 方 昕 夏 熒

骨肉瘤是1種原發(fā)性惡性骨腫瘤，常發(fā)生在青少年的干骺端。由于其惡性程度極高，因此簡(jiǎn)單的手術(shù)切除通常治療效果不佳[1]。盡管近幾十年經(jīng)過國內(nèi)外研究人員的研究，在骨肉瘤的診斷和治療方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但骨肉瘤患者的總體存活率并未發(fā)生顯著變化[2]。原發(fā)性骨肉瘤向鄰近組織和器官的轉(zhuǎn)移一直是導(dǎo)致骨肉瘤患者治療失敗和存活率低的主要問題[3]。因此，了解骨肉瘤轉(zhuǎn)移中涉及的機(jī)制一直是研究的重要內(nèi)容。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移主要涉及細(xì)胞粘附、遷移、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的過程[4]。越來越多的證據(jù)表明腫瘤微環(huán)境中的許多組分參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，包括一些炎癥因子[5]。因此，它們?cè)谀[瘤侵襲中的作用值得進(jìn)一步研究。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的組分，也是腫瘤微環(huán)境中的重要因子[6]，其可通過激活細(xì)胞表面上的Toll樣受體來影響腫瘤侵襲[7]。但是LPS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲的作用機(jī)制還未徹底闡明。因此本研究采用LPS干預(yù)人MG-63骨肉瘤細(xì)胞模擬腫瘤炎癥微環(huán)境，探討LPS對(duì)MG-63細(xì)胞遷移及侵襲的影響及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人MG-63骨肉瘤細(xì)胞系購自美國ATCC細(xì)胞中心。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組和LPS組。

1.2 干預(yù)方式

將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度種植于96孔板，依照分組，每組6孔。培養(yǎng)24 h后，LPS組細(xì)胞用10 g/ml的LPS干預(yù)24 h，對(duì)照組用生理鹽水干預(yù)。干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3 ELISA

分別采用上海碧云天公司提供的人TNF-α、IL-1和IL-6ELISA試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)基中促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的釋放水平。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲分析

采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的遷移及侵襲水平。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：首先，將5 μl的Matrigel平鋪于Transwell 24孔板的上室中。然后將收集的兩組細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度重懸于無血清的培養(yǎng)基中，取500 μl的細(xì)胞懸浮液種植于每個(gè)上室中，并將500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入至下室中。于37 ℃、5% CO2孵育24 h后，用4%多聚甲醛固定侵入底室的細(xì)胞20 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。最后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)染色的細(xì)胞，隨機(jī)選取8個(gè)視野(×200)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的侵襲細(xì)胞數(shù)，取平均值。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：除不預(yù)鋪Matrigel膠外，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western Blot

采用RIPA試劑提取兩組細(xì)胞中的總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白定量分析。取20 g總蛋白加入上樣緩沖液中，用10%SDS-PAGE膠分離總蛋白，將總蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%胎牛血清封閉45 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次，ECL暗室發(fā)光。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，GAPDH為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)MG-63細(xì)胞培養(yǎng)基中炎癥因子釋放的影響

與對(duì)照組相比，LPS組培養(yǎng)基中促炎因子TNF-、IL-1和IL-6的釋放水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組促炎因子對(duì)比[(±s)，(pg·ml-1)]

表1 兩組促炎因子對(duì)比[(±s)，(pg·ml-1)]

組別TNF-αIL-1βIL-6對(duì)照組24.83±4.7751.35±9.9486.60±17.49LPS組165.19±8.52472.91±28.072362.59±74.43t35.21134.67772.917P0.0010.0010.001

2.2 LPS對(duì)MG-63細(xì)胞遷移和侵襲的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，LPS組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組細(xì)胞遷移和侵襲對(duì)比[(±s)，視野]

表2 兩組細(xì)胞遷移和侵襲對(duì)比[(±s)，視野]

組別遷移細(xì)胞數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)對(duì)照組182.69±11.3563.28±9.43LPS組370.24±26.72147.39±15.85t15.82511.171P0.0010.001

2.3 LPS對(duì)MG-63細(xì)胞EMT的影響

與對(duì)照組相比，LPS組中E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而N-cadherin、-SMA和波形蛋白的表達(dá)水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組EMT相關(guān)蛋白對(duì)比(±s)

表3 兩組EMT相關(guān)蛋白對(duì)比(±s)

組別E-cadherinN-cadherinα-SMA波形蛋白對(duì)照組0.93±0.150.31±0.080.40±0.110.49±0.10LPS組0.25±0.090.66±0.171.27±0.291.42±0.37t9.5224.5636.8715.944P0.0010.0020.0010.001

2.4 LPS對(duì)MG-63細(xì)胞TLR4/HOTAIR通路的影響

如表4所示，與對(duì)照組相比，LPS組TLR4和HOTAIR的表達(dá)均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組TLR4/HOTAIR通路相關(guān)分子對(duì)比

3 討論

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞表型的過程，它是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的分子基礎(chǔ)。研究表明，腫瘤細(xì)胞上皮表型中E-cadherin的下調(diào)或缺失是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志，間質(zhì)表型標(biāo)志物如N-cadherin、波形蛋白和-SMA的上調(diào)也是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志[8]。隨著對(duì)EMT的深入研究，越來越多的證據(jù)表明腫瘤微環(huán)境中的物質(zhì)可促進(jìn)EMT的發(fā)生，如LPS和TGF-1[9]。因此，LPS可作為1種激動(dòng)劑，在體外誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)以刺激炎癥因子的分泌，用來研究腫瘤微環(huán)境組分對(duì)EMT、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。由于原發(fā)性骨肉瘤向鄰近組織和器官的轉(zhuǎn)移是限制骨肉瘤治療的主要問題，因此了解微環(huán)境在骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用將為臨床治療提供重要依據(jù)。

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要成分，存在于腫瘤環(huán)境中，可通過特異性識(shí)別TLR4受體在腫瘤增殖、侵襲中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，LPS可通過TLR4/JNK途徑促進(jìn)肝癌中EMT的發(fā)生[10]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與LPS誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[11]。還有，LPS可通過調(diào)控lncRNA在炎癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[12]。這些研究意味著lncRNA在LPS發(fā)揮其作用的機(jī)制中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Li等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1可促進(jìn)骨肉瘤的增殖和侵襲。Sun等[14]也證實(shí)lncRNA EWSAT1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和發(fā)育。Ye[15]和他的同事證明了lncRNA GAS5可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和EMT發(fā)生。這些研究進(jìn)一步表明lncRNA在骨肉瘤腫瘤發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

在本研究中，我們探討了LPS在骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。首先，我們采用10 g/ml 的LPS干預(yù)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63以驗(yàn)證LPS對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用。結(jié)果表明，LPS干預(yù)24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-、IL-1和IL-6這些促炎因子的水平顯著增加，提示LPS可有效引發(fā)炎癥環(huán)境，且LPS干預(yù)后導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增加，這與朱的研究結(jié)果一致[16]。由于EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)，因此我們進(jìn)一步分析了LPS在骨肉瘤細(xì)胞EMT中的作用，以闡明LPS促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。Western blot證實(shí)LPS可下調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、波形蛋白和-SMA的表達(dá)。這些結(jié)果顯示LPS可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中的EMT，這與Li[10]的結(jié)果一致。研究表明，創(chuàng)傷或感染等應(yīng)激下導(dǎo)致的局部炎癥反應(yīng)可啟動(dòng)骨再生，主要是通過動(dòng)員造血干細(xì)胞和間葉干細(xì)胞分化形成血管網(wǎng)絡(luò)、軟骨和骨[9]。因此我們推測(cè)，腫瘤炎癥環(huán)境也可誘導(dǎo)骨腫瘤干細(xì)胞分化增殖，這可能是經(jīng)手術(shù)切除治療的骨肉瘤患者易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的潛在原因。

TLR4是LPS的受體，我們的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，LPS干預(yù)24 h后可顯著增加TLR4的表達(dá)，提示TLR4可能參與LPS誘導(dǎo)的EMT發(fā)生。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，LPS干預(yù)24 h后，lncRNA HOTAIR的表達(dá)顯著增加，這與Obaid等[17]的研究結(jié)果一致。因此推測(cè)HOTAIR可能是TLR4的下游調(diào)節(jié)分子，TLR4直接或間接促進(jìn)HOTAIR的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT發(fā)生，導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。但是TLR4調(diào)控的HOTAIR的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。雖然已有研究證實(shí)HOTAIR可通過調(diào)控組蛋白H3賴氨酸的乙?；蚣谆D(zhuǎn)化來促進(jìn)胃癌中EMT的發(fā)生[18]，但HOTAIR促進(jìn)骨肉瘤EMT發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制還有待研究。

總之，LPS誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制與TLR4/HOTAIR途徑介導(dǎo)的EMT過程的發(fā)生有密切關(guān)系。本研究結(jié)果揭示了LPS在腫瘤微環(huán)境中對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并提出了調(diào)節(jié)這些作用的潛在機(jī)制，為骨肉瘤的治療及預(yù)防提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。