李美玲,彭健玲,江海都,柴勝豐,朱成豪,熊忠臣

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541006；3.桂林理工大學(xué)旅游與風(fēng)景園林學(xué)院，廣西桂林 541006)

0 引言

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品與試劑

樣品：不同種類的金花茶花(經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所韋霄研究員鑒定，樣品保存在該單位特色經(jīng)濟(jì)植物研究中心)。

試劑：鄰二氮菲，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，無水乙醇，F(xiàn)eSO4，鄰苯三酚，H2O2，DPPH，Tris-HCl，鐵氰化鉀，HCl，NaNO2，三氯乙酸，NaOH，F(xiàn)eCl3，Al(NO3)3，福林酚試劑，Na2CO3，香草醛，冰醋酸，硫酸均為分析純；蘆丁對照品(MUST-12040302，中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn))，沒食子酸對照品(B20851-20mg，上海源葉生物有限公司生產(chǎn))，人參皂苷Rg1對照品(B21057-20mg，上海源葉生物有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn))，萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn))，HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn))，DL-720E智能超聲波清洗器(上海五相儀器儀表有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

在開花期采集不同種類的金花茶盛開花朵(表1)，將采集的金花茶花洗凈，置于微波爐里殺青5 min，然后在60℃烘箱內(nèi)烘24 h，粉碎，過60目篩，備用。精密稱取0.1 g金花茶花粉末，置10 mL離心管中。按原料∶提取劑=1∶45 (g·mL-1)的比例在試管中加入20%乙醇溶液，然后在300 W超聲條件下提取，提取溫度為70℃，提取53 min[8]。過濾得上清液，再用20%乙醇溶液定容到100 mL，搖勻，得1 mg·mL-1樣品提取液，待用。每個樣品做3個重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 金花茶花對·OH去除能力測定

取11組干燥潔凈的試管(每組3支試管做平行)編號為A—K，分別加入2 mL pH值為7.45的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，1 mL 0.75 mmol·L-1鄰二氮菲溶液和1 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4溶液，充分混勻。往A組3支試管中各加入2 mL無菌蒸餾水，B組3支試管中各加入1 mL 0.01% H2O2溶液和1 mL無菌蒸餾水，剩下的9組試管分別添加1 mL 0.01% H2O2溶液和9種金花茶花樣品提取液1 mL。將各組試管內(nèi)溶液充分混勻后于37℃恒溫條件水浴60 min[20]，取出冷卻后采用紫外可見分光光度計(jì)在536 nm 處測定溶液的吸光值。A組試管的吸光值記為Ab，B組試管的吸光值記為Ap，剩余9組試管的吸光值則記為As，按公式(1)計(jì)算9種金花茶花對·OH的清除率。

·OH清除率(%)=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100%。

(1)

表1 金花茶樣品

1.2.3 金花茶花對DPPH·去除能力測定

精密稱取0.004 0 g的DPPH結(jié)晶，加入100 mL無水乙醇，配成濃度為0.04 mg·mL-1的溶液，避光保存。取2 mL不同種金花茶花樣品提取液分別與2 mL 0.04 mg·mL-1DPPH溶液進(jìn)行等體積混合，在暗處靜置30 min[21]，然后采用紫外可見分光光度計(jì)在517 nm 處測定吸光值，記為A1。取2 mL不同種金花茶花樣品提取液與2 mL無水乙醇溶液進(jìn)行等體積混合，在暗處靜置30 min后在517 nm 處測定吸光值，記為A2。取2 mL 0.04 mg·mL-1DPPH溶液與2 mL無水乙醇溶液混合，在暗處靜置30 min后在517 nm 處測定吸光值，記為A0。按公式(2)計(jì)算9種金花茶花對DPPH·的清除率。

DPPH·清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

(2)

(3)

1.2.5 金花茶花總還原力測定

取9組試管分別編號為1—9(每組有3支試管做重復(fù)試驗(yàn))，用移液槍分別取9種金花茶花的樣品提取液2.5 mL置于各組試管中，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻；再加入2.5 mL 0.2 mol·L-1PBS，充分振蕩后在50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)完畢后取出，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，隨后在3 000 r·min-1離心0.1 h。用移液槍取5 mL上清液于干凈試管中，加入4 mL無菌蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3溶液，充分混勻，靜置反應(yīng)6 min，然后用紫外可見分光光度計(jì)測定其在700 nm處吸光值A(chǔ)700[23]。溶液的A700越大，表示其還原能力越強(qiáng),即抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.6 總黃酮含量測定

總黃酮含量測定參照文獻(xiàn)[24]的方法，分別取9種金花茶花樣品提取液1 mL進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.2.7 茶多酚含量測定

茶多酚含量測定參照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的測定方法》(GB/T 8313—2008)[25]進(jìn)行，分別取9種金花茶花樣品提取液1 mL進(jìn)行測定，計(jì)算樣品中茶多酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)合功效系數(shù)法及距離法[26]綜合評價9種金花茶花抗氧化活性的大小，功效系數(shù)的計(jì)算方法如公式(4)所示，距離法的計(jì)算公式如公式(5)所示。

(4)

式中,di表示第i個參評指標(biāo)的功效系數(shù)，xi表示第i個參評指標(biāo)的值，xhi表示參評指標(biāo)的上限閾值，xsi表示參評指標(biāo)的下限閾值。

(5)

式中,Sj表示第j個參評金花茶的綜合評分值，dij表示第j個參評金花茶花第i個參評指標(biāo)的功效系數(shù)。

采用SPSS 23.0軟件對9種金花茶花抗氧化活性及其總黃酮、茶多酚含量進(jìn)行方差分析和多重比較(Duncan法)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性測定結(jié)果

2.1.1 對·OH去除能力

由圖1可知，9種金花茶花對·OH的去除能力差異顯著(P<0.05)，其中中東金花茶對·OH的清除率最高，為(92.89±0.35)%；東興金花茶對·OH的清除率最低，為(16.26±0.70)%。龍州金花茶和毛瓣金花茶對·OH的去除能力無顯著性差異(P>0.05)，崇左金花茶和普通金花茶對·OH的去除能力也無顯著性差異(P>0.05)。

2.1.2 對DPPH·去除能力

由圖2可知，9種金花茶花對DPPH·的清除率幾乎都達(dá)90% 以上，可見金花茶花對DPPH·的去除效果都比較好，但是不同種類金花茶花對DPPH·的去除能力有顯著性差異(P<0.05)。其中崇左金花茶對DPPH·的去除作用最強(qiáng)，清除率為(94.70±0.10)%；天峨金花茶花對DPPH·的去除作用最弱，清除率為(89.52±0.21)%。

不同字母表示差異顯著，P<0.05

不同字母表示差異顯著,P<0.05

不同字母表示差異顯著,P<0.05

2.1.4 總還原力測定結(jié)果

由圖4可知，9種金花茶花總還原力差異顯著(P<0.05)，其中中東金花茶吸光值最大(1.55)，說明其總還原力最強(qiáng)；東興金花茶吸光值最小(0.57)，說明其總還原能力最弱。龍州金花茶和凹脈金花茶的總還原力無顯著性差異(P>0.05)，崇左金花茶花和普通金花茶的總還原力也無顯著性差異(P>0.05)。

不同字母表示差異顯著,P<0.05

2.1.5 抗氧化活性綜合評價結(jié)果

不同測定方法得到的抗氧化活性結(jié)果有一定的差異，所以不能用單一的指標(biāo)來進(jìn)行評判。本文結(jié)合功效系數(shù)法和距離法計(jì)算出不同金花茶花抗氧化活性的綜合評分值(總距離)，數(shù)值越小代表抗氧化活性越強(qiáng)。9種金花茶花抗氧化活性由強(qiáng)到弱依次為凹脈金花茶>毛瓣金花茶>中東金花茶>武鳴金花茶>崇左金花茶>龍州金花茶>普通金花茶>天峨金花茶>東興金花茶(表2)。

表2 不同金花茶花抗氧化活性的綜合評價

2.2 主要活性成分含量

2.2.1 總黃酮含量

由圖5可知，9種金花茶花總黃酮含量差異顯著(P<0.05)。中東金花茶總黃酮含量(24.71%)最高，其次是龍州金花茶(21.60%)，而東興金花茶含量(2.42%)最低。凹脈金花茶與毛瓣金花茶、普通金花茶與崇左金花茶、普通金花茶與天峨金花茶的總黃酮含量都無顯著性差異(P>0.05)。

不同字母表示差異顯著，P<0.05

2.2.2 茶多酚含量

如圖6所示，9種金花茶花茶多酚含量差異顯著(P<0.05)。中東金花茶花茶多酚含量(10.21%)最高，其次是龍州金花茶(8.74%)，東興金花茶含量(1.03%)最低。龍州金花茶、凹脈金花茶和毛瓣金花茶三者間茶多酚含量無顯著性差異(P>0.05)，天峨金花茶和武鳴金花茶也無顯著性差異(P>0.05)。

不同字母表示差異顯著，P<0.05

2.3 抗氧化活性與主要活性物質(zhì)含量相關(guān)性分析

表3列出9種金花茶花抗氧化活性與總黃酮、

表3 抗氧化活性與總黃酮、茶多酚含量相關(guān)性分析

3 討論

金花茶花抗氧化活性的大小及其主要活性成分含量的高低是衡量其開發(fā)利用價值的重要指標(biāo)。不同種類的金花茶花抗氧化活性存在顯著差異(P<0.05)。本研究9種金花茶花去除DPPH·的效果均較好，幾乎都在90%以上，原因可能是本實(shí)驗(yàn)樣品溶液的濃度為1 mg·mL-1，處于對DPPH·去除效果較理想的濃度范圍內(nèi)[2]，因此對DPPH·去除率均較高，總黃酮和茶多酚含量的高低與其對DPPH·的清除能力無顯著相關(guān)關(guān)系。

金花茶花對·OH的去除能力和總還原力均與活性成分總黃酮、茶多酚含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明總黃酮和茶多酚這兩種活性成分是金花茶花抗氧化能力的部分物質(zhì)基礎(chǔ)。但是金花茶花中還含有其他的重要生理保健物質(zhì)[29]和營養(yǎng)成分如總多糖、總皂苷和微量的礦物質(zhì)元素Fe、Mn、Zn等，它們可能相互協(xié)調(diào)，對金花茶花的抗氧化能力起到一定的促進(jìn)作用。為更好地深入探討金花茶花的抗氧化活性，后期還需要對這些生理活性物質(zhì)、營養(yǎng)成分以及微量礦質(zhì)元素等進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

通過對9種金花茶花抗氧化活性及總黃酮、茶多酚含量的測定與分析，結(jié)果表明金花茶花抗氧化活性由強(qiáng)到弱依次為凹脈金花茶>毛瓣金花茶>中東金花茶>武鳴金花茶>崇左金花茶>龍州金花茶>普通金花茶>天峨金花茶>東興金花茶；金花茶花對·OH的去除能力和總還原力與其總黃酮、茶多酚含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。本研究對金花茶藥用價值和生理保健功能的進(jìn)一步研究具有積極意義，亦可為開發(fā)優(yōu)質(zhì)金花茶產(chǎn)品提供參考。