劉 杰 , 聶鴻濤 , 姜坤銀 , 王政興 , 孫曉彤 , 霍忠明 , 閆喜武

(1. 大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院, 大連 116023; 2. 大連海洋大學 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是我國重要水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類。2017年我國蛤仔年產(chǎn)量約為4 177 913萬噸, 在貝類養(yǎng)殖中有著重要地位[1]。然而近年來, 弧菌病成為威脅養(yǎng)殖業(yè)的主要原因之一[2]。例如, 鰻弧菌和燦爛弧菌是我國海水養(yǎng)殖所面臨的重要致病菌, 嚴重威脅經(jīng)濟貝類的養(yǎng)殖安全[3-4]。菲律賓蛤仔免疫與病害防治一直是菲律賓蛤仔養(yǎng)殖的重中之重。蛤仔的免疫力強弱即抵抗外來病原體脅迫能力的強弱直接決定著蛤仔的存活率。因此, 開展蛤仔免疫相關(guān)基因研究對提高蛤仔產(chǎn)量及經(jīng)濟效益有著重要意義。

酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)(E.C.1.14.18.1)是一種含銅元素氧化還原酶, 屬于3型銅蛋白家族, 酪氨酸酶屬于酚氧化酶的一種[5-6]。酪氨酸酶催化黑色素生物合成過程中的前兩個反應(yīng), 包括從酪氨酸中產(chǎn)生的真黑色素和非黑色素, 即將酪氨酸羥基化為二羥基-L-苯丙氨酸(DOPA), 然后將DOPA氧化為多巴胺[7-8]。其參與生物體色素合成, 在軟體動物中, 一些頭足類動物被用作研究墨囊中黑色素生物合成的生化特性的良好模型[9-11]。在長牡蠣幼蟲發(fā)育中酪氨酸酶參與了殼形成[12]。同時, 酪氨酸酶也是一種重要的免疫相關(guān)酶[13]。目前已發(fā)現(xiàn)其在多種海洋生物中參與免疫應(yīng)答, 在無脊椎動物的先天免疫中也起著關(guān)鍵作用[13-15]。在貝類中, 長牡蠣和櫛孔扇貝中含有酪氨酸酶, 它的活性被認為與長牡蠣和櫛孔扇貝的免疫力有關(guān)[13,16-19]。例如, LPS刺激后在櫛孔扇貝血淋巴中TYR基因表達水平先顯著下調(diào)后顯著上調(diào)(P<0.05), 在LPS刺激后3h, 血淋巴對大腸桿菌的抗菌活性也顯著增加, 但在用TYR抑制劑處理血淋巴后, 其抗菌活性顯著降低[20]。在翡翠貽貝中也有酪氨酸酶基因參與免疫應(yīng)答的研究報道[21]。然而, 在蛤仔中對酪氨酸酶基因與免疫的潛在關(guān)聯(lián)研究很少。

LPS是革蘭氏染色陰性菌細胞壁上的脂多糖, 在許多雙殼類免疫相關(guān)文獻中記錄了革蘭氏染色陰性菌是影響雙殼類存活的主要病原體[16]。在雙殼類中, 鰓是與外界海水連續(xù)交換的器官, 是蛤仔第一道天然屏障, 因此容易受到病原體感染, 肝胰腺是貝類的重要的免疫器官[22-23]。本實驗選取鰓和肝胰腺兩個組織探究了TYR基因?qū)Ψ坡少e蛤仔的免疫應(yīng)答, 利用熒光定量PCR分析了LPS脅迫下蛤仔TYR6和TYR10基因的表達特性。為深入探究菲律賓蛤仔免疫作用與TYR基因之間的關(guān)系提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源

用來進行實驗的五個菲律賓蛤仔群體: 野生群體(Wild Population)、養(yǎng)殖群體(Cultured Population)、斑馬蛤(Zebra clam)、白斑馬蛤(White Zebra clam)、白蛤(White clam)。斑馬蛤由福建莆田野生菲律賓蛤仔群體選育而來, 白斑馬蛤通過大連野生群體白蛤和斑馬蛤雜交而來, 白蛤和養(yǎng)殖菲律賓蛤仔來自莆田群體, 上述四種實驗蛤仔均來自莊河養(yǎng)殖場2齡貝, 殼長22.2±1.02 mm, 濕重5.4±0.8 g。野生群體采自大連金石灘。實驗開始前將實驗樣品置于20 L水槽中22℃暫養(yǎng)一周, 每天換水一次, 適量投喂螺旋藻粉。

1.2 LPS脅迫及組織獲取

將五個群體菲律賓蛤仔, 隨機分為兩組, 每個群體每個時間點各隨機抽取三個個體進行實驗。一組為LPS脅迫組, 注射50 μL(濃度為100 μg/mL)的LPS。另一組設(shè)為PBS對照組, 注射50 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)。每個群體進行生物學重復隨機選取3個個體進行注射脅迫, 于0、3、6、12、24、48 h, 6個時間點解剖獲得實驗蛤仔的鰓和肝胰腺組織, 液氮冷凍后存于–80℃冰箱用于提取樣品總RNA。

1.3 RNA提取及序列分析

取30mg組織使用TRIzol法獲得實驗用蛤仔鰓組織及肝胰腺組織總RNA。用NanoDrop 2000c UV核酸定量儀進行RNA濃度檢測。用TaKaRa Primer ScriptTMRT reage-nt Kit(TaKaRa, 大連)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。從本實驗室菲律賓蛤仔基因組中選取核心序列TYR6(>evm.model.xfSc0000366.24)、TYR10(>evm.model. xfSc0000339.13), 將蛋白序列上傳到 NCBI, 在NCBI中進行TYR蛋白序列比對分析, 將同源性高的物種的氨基酸序列下載下來, 使用Clustal X進一步對序列進行分析, 找到6個組氨酸殘基[24]; 使用線上軟件ExPASy(htps: //www.expasy.org/)研究物種序列二級結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系[25]。通過MEGA X軟件研究菲律賓蛤仔與不同物種間遺傳進化關(guān)系, 并以發(fā)育樹進行展示Bootstrap 1000次(Neighbor-Joining, NJ)[26-27]。

1.4 TYR基因熒光定量PCR分析

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計標準用Premier 5.0設(shè)計特異性熒光引物(表1), 交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物, 引物退火溫度 60℃, 以β-actin為內(nèi)參基因。檢測TYR基因在鰓和肝胰腺中不同時間的表達情況。使用SYBR?Premix Ex試劑盒(TaKaRa, 大連)在 LightCycler?480 定量 PCR 儀(Roche, 上海)進行序列擴增, 20 μL體系, 每組進行三次重復(表2)。實驗用兩步法熒光定量PCR程序:循環(huán)40次。將所得結(jié)果用 2–ΔΔCt法計算分析比較, 并進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 用SPSS22.0 進行數(shù)據(jù)處理。設(shè)置P<0.05為表達量差異顯著性水平。

表1 熒光定量引物 Tab. 1 Primers for real-time PCR

表2 實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系 Tab. 2 Quantitative real-time PCR detecting system

2 結(jié)果

2.1 菲律賓蛤仔TYR蛋白序列多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用線上軟件ExPASy對序列進行二級結(jié)構(gòu)分析, 得到2個銅離子結(jié)合位點, 和6個組氨酸殘基(圖1)。

五個群體菲律賓蛤仔的TYR6、TYR10基因的氨基酸序列與其他物種TYR基因在Clustal X上多序列比對, 其TYR6與長牡蠣(Crassostrea gigas)同源性最高為39.43%, 在進化樹中最先聚為一支, 與蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)同源性為36.02%, 其次與三角帆蚌同源性為35%。TYR10與大珠母貝(Pinctada maxima)同源性最高為51.04%, 與加勒比珠母貝(Pinctada imbricata)同源性為49.31%, 因此TYR10和大珠母貝(Pinctada maxima)、加勒比珠母貝(Pinctada imbricata)最先聚為一支, 其次與金烏賊(Sepia officinalis)聚為一支, 再與其他貝類聚成一支, 最后才與脊椎動物聚為一大支(圖2)。

圖1 TYR氨基酸多序列比對 Fig. 1 Multiple alignment of TYR amino acid sequences.

圖2 TYR基因系統(tǒng)進化樹 Fig. 2 Phylogenetic tree of TYR genes

2.2 TYR 基因在五個群體蛤仔鰓和肝胰腺組織中的表達模式

注射LPS后TYR6基因在養(yǎng)殖群體鰓組織中隨時間增加表達量有顯著變化(P<0.05), 3h時表達量開始上調(diào), 6 h、12 h與0 h相比差異顯著, 分別是對照組的9.19和8.64倍(P<0.05), 且6 h表達量達到最高, 隨時間推移24 h表達量下調(diào), 48 h表達量趨于初始水平(圖3); 在肝胰腺中6h表達量顯著上調(diào), 是對照組的21.88倍(P<0.05), 隨后表達量下調(diào)。TYR6基因在白蛤鰓組織中3 h、6 h、12 h表達量顯著上調(diào), 分別是對照組的3.22倍、5.16倍和3.51倍(P<0.05), 且在6 h表達量達到峰值, 在24 h表達量下調(diào)趨近于初始水平(圖3); 在肝胰腺中, 6 h表達量顯著上調(diào)是對照組的15.99倍(P<0.05), 隨后表達量下調(diào)。在24 h表達量達到另一峰值是對照組的7.24倍(P<0.05)(圖4)。TYR6基因在白斑馬蛤鰓組織中, 3 h、6 h、12 h均有顯著上調(diào), 在6 h表達量達到峰值是對照組的3.19倍(P<0.05), 24 h表達量下調(diào)趨于初始水平(圖3); 在肝胰腺中6 h顯著上調(diào)達到峰值是對照組的27.17倍(P<0.05), 12 h下調(diào)至初始水平(圖4)。TYR6基因在野生群體鰓組織中, 3 h表達量顯著上調(diào)達到峰值, 是對照組的6.46倍(P<0.05), 之后下調(diào)至初始水平(圖3); 在肝胰腺中3 h表達量顯著上調(diào)達到峰值, 是對照組的4.87倍(P<0.05)(圖4)。TYR6基因在斑馬蛤鰓組織中3 h、 6h表達量顯著上調(diào), 分別是對照組的 7.1倍和2.72倍(P<0.05), 并于3 h達到峰值, 6 h表達量開始下調(diào); 在肝胰腺中3 h表達量顯著上調(diào)達到峰值, 是對照組的8.12倍(P<0.05), 隨后開始下調(diào)于48 h趨于初始水平。

圖3 LPS脅迫下菲律賓蛤仔鰓組織TYR6基因在不同時間點的表達模式 Fig. 3 Expression patterns of TYR6 gene in the gill of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

圖4 LPS脅迫下菲律賓蛤仔肝胰腺TYR6基因在不同時間點的表達模式 Fig. 4 Expression patterns of TYR6 gene in the hepatopancreas of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

注射LPS后, TYR10基因在養(yǎng)殖群體鰓組織中3 h、6 h表達量顯著上調(diào), 分別是對照組的6.35倍和14.74倍(P<0.05), 在6h表達量達到峰值, 隨后表達量下調(diào)到初始水平(圖5); 在肝胰腺中, 6 h表達量顯著上調(diào)達到峰值是對照組的7.55倍(P<0.05)(圖6)。TYR10基因在白蛤鰓組織中3 h表達量顯著上調(diào)達到峰值是對照組的4.23倍(P<0.05), 隨后下調(diào)至初始水平; 在肝胰腺中3 h顯著上調(diào)并達到峰值, 是對照組的2.63倍(P<0.05)。TYR10基因在白斑馬群體鰓組織中3h表達量顯著上調(diào)達到峰值, 是對照組的5.88倍(P<0.05)(圖5); 在肝胰腺中6 h表達量顯著上調(diào)達到峰值是對照組的19.85倍(P<0.05), 隨后下調(diào)至初始水平(圖6)。TYR10基因在野生群體鰓組織中3h表達量顯著上調(diào)并達到峰值, 是對照組的6.7倍(P<0.05) (圖5); 在肝胰腺中3 h、6 h、12 h表達量均有顯著上調(diào), 分別是對照組的9.22倍、20.32倍和10.51倍(P<0.05), 在6 h表達量達到峰值(圖6)。TYR10基因在斑馬蛤鰓組織中3 h、12 h表達量顯著上調(diào), 分別是對照組的6.89倍和4.74倍(P<0.05), 3 h表達量達到峰值(圖5); 在肝胰腺中6 h顯著上調(diào)達到峰值是對照組的21.08倍(圖6)。

圖5 LPS脅迫下菲律賓蛤仔鰓TYR10基因在不同時間點的表達模式 Fig. 5 Expression patterns of TYR10 gene in the gill of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

圖6 LPS脅迫下菲律賓蛤仔肝胰腺TYR10基因在不同時間點的表達模式 Fig. 6 Expression patterns of TYR10 gene in the hepatopancreas of Ruditapes philippinarum after LPS injection at different time points

3 討論

近年來的研究表明, 酪氨酸酶參與了軟體動物的許多生物學功能, 包括免疫應(yīng)答、卵囊形成、足絲、殼基質(zhì)蛋白和角質(zhì)層形成等[28-29,12]。本實驗中, 在LPS注射后TYR6、TYR10基因在五個蛤仔群體中鰓組織和肝胰腺組織中均有差異性表達, 從表達量結(jié)果來進行分析, TYR6白斑馬鰓組織中的表達量在3h、6h、12h均有顯著上調(diào)(P<0.05)。TYR10在五個群體菲律賓蛤仔中斑馬蛤肝胰腺中表達量最高(圖6), 可能跟斑馬蛤本身的抗逆性強有關(guān)[30]。除TYR6在養(yǎng)殖群體鰓組織中未有顯著上調(diào), TYR基因在四個群體鰓組織中3h表達量均有顯著上調(diào)(P<0.05), 比在肝胰腺中顯著上調(diào)時間出現(xiàn)要早, 推測菲律賓蛤仔在受到LPS注射后鰓組織較肝胰腺組織更為敏感。雙殼類的鰓不僅是呼吸器官, 也是重要的免疫器官, 其與外界海水連續(xù)交換, 易被病原體感染[9]。推測TYR基因有可能在鰓組織中參與了免疫反應(yīng)。TYR基因在蛤仔肝胰腺中的表達水平普遍要高于在鰓中的表達水平, LPS脅迫后TYR基因的高表達表明TYR基因可能在肝胰腺中參與了蛤仔的免疫應(yīng)答反應(yīng), 在其他物種中也有類似的報道[22-24]。

Mu?oz等[31]研究發(fā)現(xiàn), 在雙殼類血淋巴和血細胞中, 寄生蟲侵染可以使酪氨酸酶活性顯著上調(diào)。周智等[23]研究發(fā)現(xiàn)TYR基因在櫛孔扇貝血淋巴中的表達水平?jīng)Q定血淋巴抗菌活性的強弱, 證明了酪氨酸酶參與了貝類天然免疫反應(yīng)。Rishan[32]等研究表明, 在菲律賓蛤仔血淋巴中只含有一種酚氧化酶, 屬于一種酪氨酸酶型酚氧化酶。酚氧化酶是無脊椎動物非特異性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分, 是絲氨酸蛋白酶復合酶級聯(lián)的末端組成部分。

綜上, 本實驗通過熒光定量PCR分析了LPS脅迫下TYR基因在菲律賓蛤仔5種群體的鰓和肝胰腺中的表達水平。查明了TYR基因在LPS脅迫下的鰓組織和肝胰腺組織中的表達模式, 同時推測了TYR基因在蛤仔鰓和肝胰腺中表達與免疫的關(guān)系, 從TYR基因免疫應(yīng)答水平上看, 不同群體TYR表達的高低與蛤仔免疫力表達有一定聯(lián)系, TYR6、TYR10基因在斑馬蛤鰓組織和肝胰腺組織中均有較高表達, 推測與斑馬蛤是抗逆性強品系, 抗病能力要強于其他群體有關(guān)。為進一步對菲律賓蛤仔免疫學的研究提供基礎(chǔ)。