程玉華,連麗麗,董紅梅*，丁 璐

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.胃腸及營(yíng)養(yǎng)外科;2.神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130041)

胃癌是一種較為常見(jiàn)的消化道腫瘤疾病，其發(fā)病率和死亡率分別位居第4位和低2位[1]。目前CA199、CA724等血清標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷有提示作用，但是胃癌的診斷主要依據(jù)胃鏡檢查。早期胃癌經(jīng)手術(shù)切除后生存率可達(dá)90%以上，而進(jìn)展期胃癌生存率僅為30%[2]。故更加簡(jiǎn)單和廉價(jià)且快速的診斷方式能夠使胃癌患者在早期得到治療。非編碼RNA作為在轉(zhuǎn)錄水平起調(diào)控作用的一種特殊RNA，已被證實(shí)參與到許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中，其能控制細(xì)胞的增殖凋亡，甚至具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[3]。因此被認(rèn)為具備傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物無(wú)法比擬的對(duì)疾病的診斷、預(yù)后甚至潛在治療的作用。非編碼RNA MEG3被認(rèn)為是一種具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的基因[4]，其在組織中的低表達(dá)和腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著潛在的關(guān)系。但是否其在所有的胃癌患者組織中均能呈現(xiàn)低表達(dá)以及是否能成為血清診斷標(biāo)志物目前尚不明確。故本文通過(guò)組織標(biāo)本驗(yàn)證MEG3對(duì)胃癌的診斷價(jià)值并分析其低表達(dá)對(duì)患者遠(yuǎn)期生存率的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2011年1月—2014年12月因確診為胃癌而就診于吉林大學(xué)第二醫(yī)院的胃腸及營(yíng)養(yǎng)外科患者89例。全部患者均行手術(shù)治療，癌旁正常組織為距離癌組織邊緣5 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前進(jìn)行輔助放化療及靶向治療。②腫瘤合并大范圍遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。③多器官功能衰竭病例。④在院死亡病人或失訪(fǎng)患者。其中男57例，女32例，平均年齡56.9±5.5歲。全部患者一般基本資料詳見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)中組織取自的患者知情同意并簽署相應(yīng)文件，本項(xiàng)目經(jīng)吉林大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1全部標(biāo)本均術(shù)中獲得，包括胃癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織，組織類(lèi)型由病理科醫(yī)生證實(shí)為癌組織及正常胃組織。所有標(biāo)本自手術(shù)取下后迅速放入液氮封存并轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。組織RNA提取使用TRIZOL試劑，并進(jìn)行RNA濃度及純度的檢測(cè)，OD260/OD280選擇在1.8-2.0之間的RNA。然后將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分兩步進(jìn)行并使用All In One cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)定量PCR采用All In One PCR試劑盒，每組樣品均設(shè)3 個(gè)重復(fù)。引物設(shè)計(jì)根據(jù)Primer-Blast設(shè)計(jì)，并經(jīng)Oligo驗(yàn)證后由華大基因公司輔助合成，具體序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量引物表

1.2.2高通量生物信息分析方法 長(zhǎng)鏈非編碼RNA芯片GSE105476來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。其中GSE105476包含5例胃癌組織組織和5例癌旁正常組織。通過(guò)GEO2R軟件進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析，差異表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)為(差異倍數(shù)在2倍以上及P<0.05)。Graphpad prism 7進(jìn)行差異基因的火山圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 MEG3對(duì)胃癌患者年齡、性別、組織大小、分化程度的診斷價(jià)值MEG3在胃癌組織中呈現(xiàn)相對(duì)低表達(dá)水平，診斷陽(yáng)性率可達(dá)100%。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示胃癌組織表達(dá)水平(7.47±0.35)較正常組織(9.68±0.42)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中MEG3在腫瘤的分化程度上呈現(xiàn)差異性表達(dá)，但在年齡、性別、腫瘤大小方面無(wú)明顯差異，詳見(jiàn)表2。

2.2芯片分析結(jié)果顯示總共對(duì)13055個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，其中11013個(gè)基因無(wú)明顯變化，626個(gè)上調(diào)差異性表達(dá)的基因，1416個(gè)下調(diào)差異性表達(dá)的基因。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行火山圖差異表達(dá)基因繪制，其中圓圈代表無(wú)明顯差異基因，菱形代表差異上調(diào)基因，星號(hào)代表差異下調(diào)基因，顯示如圖1。

表2 2組患者一般資料及表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

*P<0.05，表中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或例表示

2.3 MEG3表達(dá)量對(duì)胃癌患者預(yù)后的診斷價(jià)值Kaplan Meier曲線(xiàn)顯示MEG3低表達(dá)病人預(yù)后較高表達(dá)病人預(yù)后差，中位生存時(shí)間分別為24.7個(gè)月和32.3個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示MEG3在胃癌患者年齡和性別方面表達(dá)無(wú)明顯差異(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1 胃癌組織與癌旁正常組織差異表達(dá)基因火山圖

菱形◇代表差異上調(diào)基因，星號(hào)?代表差異下調(diào)基因，圓圈●代表無(wú)差異表達(dá)基因。

圖2 Kaplan Meier曲線(xiàn)顯示MEG3高低表達(dá)病人預(yù)后

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示MEG3差異性表達(dá)病人無(wú)病生存率

3 討論

胃癌作為較為普遍的一種消化道腫瘤，如何能夠在疾病早期進(jìn)行快速的診斷是目前研究熱點(diǎn)。胃鏡檢查因價(jià)格較貴且檢查費(fèi)時(shí)費(fèi)力，患者感覺(jué)痛苦顯然不適合大量的人口普查。血清診斷標(biāo)志物能夠快速準(zhǔn)確的提供疾病的診斷信息，而且檢查方便價(jià)格低廉適合大量人口普查[5]。目前消化道腫瘤血清診斷標(biāo)志物種類(lèi)較多，包括CA125、CEA、CA199、CA724等，但是診斷特異性較低，需要聯(lián)合檢查或輔助其他檢查手段。非編碼RNA[6]的發(fā)現(xiàn)給疾病的早期診斷甚至治療提供了新的新思路，特別是非編碼RNA在腫瘤組織中的廣泛存在并參與腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)及凋亡，可能在編碼RNA發(fā)生改變前即發(fā)生差異性改變，而且非編碼RNA在體液中廣泛存在，具備血清標(biāo)志物的潛能。

既往研究報(bào)道，胃癌組織及患者血液中會(huì)產(chǎn)生大量差異性表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其中LncRNA ncRuPAR[7]對(duì)胃癌組織的診斷率達(dá)到81.2%，LncRNA HMlincRNA717也在胃癌組織中發(fā)生下調(diào)表達(dá)，LncRNA FER1L4和LncRNA FENDRR均在胃癌組織中差異表達(dá)。本文選擇MEG3不僅是因?yàn)槠湟呀?jīng)證實(shí)在胃癌組織中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，更是因?yàn)镸EG3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具備抑制腫瘤生長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈非編碼基因，其可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA21抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生癌變，也可以通過(guò)調(diào)控DNA甲基化從而影響胃癌細(xì)胞的增生和凋亡。像較為著名的P53抑癌基因，MEG3也被證實(shí)可能通過(guò)調(diào)控P53的活性進(jìn)而發(fā)揮抑癌功能[8]，從而有望成為胃癌診斷的血清腫瘤標(biāo)志物。

本文通過(guò)RT-PCR對(duì)胃癌組織中MEG3的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)幾乎全部的胃癌組織中均低表達(dá)此基因。而且低表達(dá)此基因的患者預(yù)后均較差。前人研究發(fā)現(xiàn)MEG3的低表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的分化程度及轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，和本文研究相一致，說(shuō)明對(duì)MEG3的檢測(cè)可以作為胃癌的血清診斷標(biāo)志物。而既往研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組MEG3患者的遠(yuǎn)期存活率也較低。本文通過(guò)生存曲線(xiàn)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果，因此說(shuō)明對(duì)MEG3的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)胃癌術(shù)后患者的遠(yuǎn)期生存率，從而可以更加積極的在術(shù)后行輔助性放療或化療，從而提高患者遠(yuǎn)期生存率。MEG3作為首個(gè)具有抑癌作用的非編碼RNA，其與P53途徑、Rb途徑及影響血管生成均有關(guān)，說(shuō)明MEG3可能是胃癌發(fā)生的首要變化基因，針對(duì)此基因進(jìn)行干擾如研發(fā)靶向治療藥物可能會(huì)發(fā)揮治療及改善胃癌術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后的效果。

總之，本文研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中過(guò)低表達(dá)的MEG3可能是胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一種重要改變，并可通過(guò)對(duì)MEG3的檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)患者胃癌的分化程度及遠(yuǎn)期生存率，針對(duì)MEG3的檢測(cè)可能在早期為胃癌提供診斷信息。