張 巖 ，班允澤，蔡宏飛*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胸外科,吉林 長春130021;2.梅河口市中心醫(yī)院 骨科，吉林 梅河口135000)

近50年來，食管癌發(fā)病率有了明顯的增長，食管鱗狀細(xì)胞癌是我國最常見的食管癌類型。目前，食管癌的首選治療方法是手術(shù)完全切除病變和局部淋巴結(jié)。然而，手術(shù)治療方法具有并發(fā)癥較高的缺點(diǎn)[1,2]，其中吻合口狹窄是食管切除術(shù)的主要并發(fā)癥之一[3,4]。大多數(shù)良性狹窄發(fā)生在術(shù)后前幾個(gè)月內(nèi)，吞咽困難往往是出現(xiàn)狹窄的第一癥狀，給患者帶來極大的痛苦[5]。盡管隨著手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，吻合口狹窄的發(fā)生率有所下降，但仍有20%-30%患者存在這一情況，其發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于預(yù)期，且一旦吻合口狹窄發(fā)生，沒有非常有效的治療手段。擴(kuò)張和藥物治療是最常見的干預(yù)措施，但復(fù)發(fā)率仍然很高[1,2]。顯然了解吻合口狹窄的機(jī)制對(duì)于食管癌外科治療是非常重要的，但目前關(guān)于其機(jī)制的研究和報(bào)道較少。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，由Sen和Baltimore于1986年首次提出。NF-κB的激活與各種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[6,7]，尤其與腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。NF-κB的信號(hào)通路具有抗凋亡作用，可被炎癥、自身免疫性疾病、感染和癌癥激活[8]。當(dāng)患者接受食管切除術(shù)時(shí)，吻合口會(huì)暴露于酸、炎癥等因素，這些因素會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路。梅薩迪的論文報(bào)道了瘢痕成纖維細(xì)胞中活化的NF-κB的表達(dá)水平明顯高于健康皮膚[9]。

然而目前很少有文獻(xiàn)研究NF-κB表達(dá)對(duì)食管癌根治術(shù)后吻合口狹窄的影響。因此，本研究旨在探討NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)與吻合口狹窄的關(guān)系，尤其是p65、bcl-2和ciap-1與吻合口狹窄的關(guān)系，為食管吻合口狹窄的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象基本資料

本研究經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。收集2014年9月至2015年12月，于吉林大學(xué)第一醫(yī)院行Ivor-Lewis食管切除術(shù)的82例食管鱗癌患者(男78例，女4例)入選本研究，患者均為在我院進(jìn)行了首次手術(shù)治療，未出現(xiàn)吻合口滲漏，且無明顯并發(fā)癥者。術(shù)后未接受放療。研究對(duì)象平均年齡為59.3±6.7歲。其中，中段食管癌51例，下段食管癌31例，復(fù)發(fā)性良性吻合口狹窄32例。吞咽困難的嚴(yán)重程度根據(jù)斯圖勒評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估。一級(jí)被定義為參與者可以吃軟食品；二級(jí)被定義為參與者可以吃半流質(zhì)食品；三級(jí)被定義為參與者可以吃流質(zhì)食品；四級(jí)被定義為參與者不能自己進(jìn)食。其中，2級(jí)狹窄有17例(中食道13例，下食道4例)，3級(jí)狹窄對(duì)象12例(中食道9例，下食道3例)，4級(jí)3例(均為中食道)。所有患者均通過內(nèi)窺鏡檢查診斷。同時(shí)，50例食管切除術(shù)后無吞咽困難的患者納入對(duì)照組。

1.2 組織樣本

本研究所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。術(shù)前對(duì)患者進(jìn)行胃鏡檢查，檢查其黏膜組織是否正常。手術(shù)后，若患者出現(xiàn)吞咽困難，我們首先進(jìn)行胃涂片食管造影診斷吻合口狹窄，然后胃鏡檢查以確定診斷，然后用活檢鉗采集吻合口狹窄區(qū)和吻合口旁的組織樣本，大小約為1 cm。在用40 g/L中性福爾馬林固定所有樣品后，將樣品脫水并嵌入石蠟中。同時(shí)，將每個(gè)樣品的一部分快速冷凍并儲(chǔ)存在液氮中，用于隨后的定量RT-PCR分析。

1.3 免疫組化(IHC)

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析(western blot)

p56、bcl-2和ciap-1抗體購自abcam公司(Cambridge,Massachusetts)。將重量為200 mg的樣品切成小塊，用1 ml的利帕溶解緩沖液(Roche Applied Science)和10 μl的PMSF(Roche Applied Science)緩沖液溶解，用BCA試劑盒(Beyotime，Shanghai，China)測定蛋白質(zhì)濃度，采用SDS-PAGE法分離等量的總蛋白。用5%脫脂牛奶阻斷后，添加一級(jí)抗體并在4℃下培養(yǎng)過夜。24 h后將蛋白轉(zhuǎn)移到濾紙膜上，后加入兔抗人抗體p56、bcl-2和ciap-1。將濾紙膜置于封閉4℃緩沖液(0.1 ml/cm2)，于振動(dòng)篩上培養(yǎng)。然后，加入在封閉緩沖液中稀釋的HRP結(jié)合二級(jí)抗體，并在室溫下與細(xì)胞膜一起孵育1-2小時(shí)后，用PBST沖洗膜4次，每次持續(xù)5 min。

1.5 RT-PCR法提取和擴(kuò)增RNA

本研究使用三唑試劑從組織中分離出RNA。通過檢查260/280 nm的吸光度來檢測RNA的質(zhì)量，核酸純度合格標(biāo)準(zhǔn)：比率在1.8-2.1范圍之內(nèi)。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(日本Takara)將0.5 μg總RNA擴(kuò)增至最終cDNA(42℃)，持續(xù)50 min。將PCR循環(huán)設(shè)定為：95℃，持續(xù)3 min，然后在以下條件下設(shè)定35個(gè)循環(huán)：50 s，94℃；30 s，55℃；60 s，72℃。之后將最終混合物在72℃下培養(yǎng)3 min。質(zhì)粒的合成和純化采用Takara(中國大連)。最后計(jì)算了uvpro彩色圖像分析系統(tǒng)的密度比。

bcl-2(F,5′-GGATCCAGGATAACGGAGGC-3′;R,5′-GGGCCAAACTGAGCAGAGTC-3′),cIAP-1(F,5′-GGCCGTATCTCCTTGTCGG-3′;R,5′-TGCAGGGGGACAAAATAGGG-3′),p56(F,5′-AACTAAGAGCACTGGGAGGCAT-3′;R,5′-GTGCAAGAGCATCATCCAGTT-3′).

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)、Wilcoxon雙樣本檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者基本信息如表1所示，有32例患者出現(xiàn)食管狹窄，50例無狹窄對(duì)照。就兩組患者的一般特征：年齡、性別和癌癥部位差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。17例為吞咽困難2級(jí)，12例分為吞咽困難3級(jí)。3例吞咽困難4級(jí)。食管吻合口狹窄多發(fā)于病理三期。

2.2 IHC檢測p56、bcl-2和ciap-1蛋白水平

免疫組化檢測組織中p56、bcl-2和ciap-1蛋白表達(dá)。p56、bcl-2和ciap-1蛋白在吻合口旁組織中表達(dá)較低(如圖1所示)，而在食管狹窄組織中p56、bcl-2和ciap-1蛋白水平顯著升高(P<0.05)。這些蛋白質(zhì)大部分位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞中p56、bcl-2和ciap-1的陽性表達(dá)標(biāo)記為棕黃色顆粒，如表2所示。

表1 本研究患者一般情況

2.3 吻合口組織和吻合口旁P56,bcl-2和 cIAP-1的mRNA表達(dá)水平

我們通過RT-PCR進(jìn)一步評(píng)估p56、bcl-2和ciap-1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，與吻合旁組織相比，狹窄組織中p56、bcl-2和ciap-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。同時(shí)，3級(jí)吞咽困難患者組織的mRNA水平明顯高于1級(jí)和2級(jí)吞咽困難樣本(P<0.05)。同時(shí)，狹窄患者正常食管上皮細(xì)胞中p56、bcl-2和ciap-1的mRNA水平較無狹窄患者明顯升高。

2.4 Western blot對(duì)P56,bcl-2,and cIAP-1蛋白表達(dá)的測定

Western blot對(duì)P56,bcl-2,and cIAP-1蛋白表達(dá)的測定，如圖2所示，與吻合旁組織相比，狹窄組織中p56、bcl-2和ciap-1蛋白水平表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表2 p56、bcl-2和ciap-1在狹窄組織和吻合口旁組織中的表達(dá)

圖1 狹窄組織和吻合旁組織中p56、bcl-2和ciap-1的蛋白質(zhì)表達(dá) (IHC ×200)

3 討論

吻合口狹窄是食管癌外科治療的主要并發(fā)癥?；颊呖梢蛲萄世щy而出現(xiàn)嚴(yán)重營養(yǎng)不良或體重減輕[10]。通過既往文獻(xiàn)報(bào)道，我們了解到導(dǎo)致吻合口狹窄的主要因素有以下兩種：一種由張力導(dǎo)致：位于吻合口上的張力越大，發(fā)生狹窄的風(fēng)險(xiǎn)越高；另一種是炎癥導(dǎo)致：刺激吻合口的炎癥因素越多，發(fā)生狹窄的風(fēng)險(xiǎn)越高[11-13]。目前，食管狹窄的一級(jí)預(yù)防和治療方法主要有：先進(jìn)的吻合技術(shù)、樹枝狀擴(kuò)張、球囊擴(kuò)張、類固醇注射、絲裂霉素C切口和支架[14]。但是上述方法均無法完全治愈食管吻合口狹窄，且有高達(dá)40%的患者在治療后幾個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)狹窄，從而導(dǎo)致重復(fù)治療[15]。吻合口狹窄是病理性增生的過程，若能在基因和分子水平上找到對(duì)應(yīng)的治療靶點(diǎn)，那么在吻合口狹窄的治療上，將會(huì)有很大進(jìn)展。

NF-κB是一種參與細(xì)胞增殖、自身免疫疾病和癌癥發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子[7]。同時(shí)，NF-κB在纖維增生過程中起著重要作用。既往研究在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中檢測到了NF-κB的過度表達(dá)，并且異常激活的NF-κB與許多炎癥性疾病、感染和癌癥有關(guān)[16]。通過文獻(xiàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路與成纖維細(xì)胞增生有關(guān)[17]，[18]，過度表達(dá)高表達(dá)的NF-κB能激活抗凋亡基因，從而抵抗細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致吻合纖維增生和狹窄[19]。因此，我們深入研究了NF-κB信號(hào)通路在食管癌術(shù)后吻合口狹窄形成中的作用。

眾所周知，NF-κB誘導(dǎo)各種抗凋亡基因的激活。在本研究中，我們檢測了Bcl-2和CIAP-1的蛋白和miRNA以驗(yàn)證通路的激活。bcl-2基因在抑制多組織和細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其主要機(jī)制包括：(1)拮抗凋亡基因bax；(2)抑制線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的凋亡細(xì)胞色素c；(3)阻止細(xì)胞色素c激活細(xì)胞質(zhì)中的衣殼蛋白基因；(4)抗氧化和維持細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[20]。同時(shí)我們也了解到Bcl-2在許多癌癥中過度表達(dá)，并被NF-κB激活，因此Bcl-2可能是預(yù)防和治療食管癌和術(shù)后吻合口狹窄的理想靶點(diǎn)。CIAP-1基因在抑制細(xì)胞凋亡中也起著重要作用，可以通過NF-κB調(diào)控，其抑制細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制包括：(1)IAP能直接抑制衣殼3,7,9的活化；(2)IAP能通過特殊蛋白酶促進(jìn)衣殼的降解[21]。研究人員ISSEI報(bào)道，CIAP-1表達(dá)過多，可能是由于細(xì)胞凋亡引起的。在食管鱗癌細(xì)胞中，messadi報(bào)道[9]，在瘢痕疙瘩的發(fā)育過程中，CIAP-1在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。因此，在本研究中，它與bcl-2具有相同的作用。因此，阻止NF-κB活化的作用可能不局限于成纖維細(xì)胞。

圖2 p56、bcl-2和ciap-1蛋白在吻合口旁組織和狹窄組織中的表達(dá)

與吻合口旁組織相比，吻合口狹窄組織中p56、bcl-2、ciap-1表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)，吻合口狹窄患者正常組織中的p56、bcl-2和ciap-1高于非狹窄患者，提示狹窄的發(fā)展與NF-κB水平有關(guān)，抑制NF-κB下游基因和蛋白的表達(dá)或激活可能有利于降低術(shù)后發(fā)生率。眾所周知，炎癥可以激活NF-κB信號(hào)通路，加快吻合口增生的進(jìn)程。因此提示術(shù)者在外科治療食管癌患者時(shí)，應(yīng)盡可能控制吻合口周圍的炎癥，如改進(jìn)吻合技術(shù)，減少吻合口滲漏，術(shù)后定期進(jìn)行抑酸治療等。