朱翔，陳功,2，萬鵬，劉瑞，李恒,2*

(1.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620036；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，成都 611130；3.四川省川南釀造有限公司，四川 眉山 620030)

泡辣椒是四川泡菜的典型代表之一，以濕態(tài)發(fā)酵方式加工而成，具有色澤紅亮、鮮嫩清脆、酸辣風(fēng)味和營養(yǎng)豐富等特點[1,2]。泡辣椒是由新鮮蔬菜經(jīng)發(fā)酵后成熟，含有多種微生物[3]，使泡辣椒產(chǎn)品在貯運、銷售過程中易發(fā)生脹袋、脹罐、溢汁等不良現(xiàn)象[4]，嚴(yán)重阻礙企業(yè)的發(fā)展。目前，在對醬腌菜中腐敗微生物的控制研究中，王向陽等[5]通過納他霉素、富馬酸和亞硫酸氫鈉來控制發(fā)酵成熟的蘿卜干的貯藏問題；姜紹通等[6]研究脫氫醋酸鈉、Nisin和尼泊金復(fù)合酯鈉3種防腐劑控制腌制蔬菜中的腐敗細菌；Bari M L等[7]研究植酸和Nisin控制蔬菜品種的中李斯特菌的生長，但是針對泡辣椒中產(chǎn)氣微生物的控制研究報道較少。本實驗通過對山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉4種抑菌劑進行研究，采用單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面法，得到最佳的復(fù)合抑菌劑，應(yīng)用于泡辣椒產(chǎn)品中，以延長產(chǎn)品的貨架期，減少食品防腐劑的添加，提升企業(yè)的市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

實驗菌種：從脹袋泡辣椒樣品中篩選出3株產(chǎn)氣微生物，其中2株真菌L1(Kazachstaniaexigua)、L2(Saccharomycescerevisiae)，1株細菌L3(Pseudomonasfluorescens)；山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉：南通醋酸化工股份有限公司；乙二胺四乙酸二鈉：常州德燁化工有限公司；苯甲酸鈉：天津東大化工集團有限公司；葡萄糖(一水)：成都市科龍化工試劑廠；酵母浸粉、麥芽浸粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；L6S紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；TH2-C-1搖床振蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；DHP-9270B智能電熱培養(yǎng)箱 成都瑞昌儀器制造有限公司；MJ-54A高壓滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

1.3.1.1 YM液體培養(yǎng)基

酵母浸粉3 g/L，麥芽浸粉3 g/L，葡萄糖(一水)10 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 6.0～6.4；121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.1.2 PCA液體培養(yǎng)基

胰蛋白胨 5.0 g/L，酵母浸粉 2.5 g/L，葡萄糖(一水)1.0 g/L，pH 7.0±0.1；121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.1.3 泡辣椒液體培養(yǎng)基

泡辣椒水50 mL，泡菜汁50 mL，以泡菜汁和泡辣椒水的質(zhì)量計，添加1.0%蛋白胨，121 ℃高壓滅菌20 min。其中泡菜汁為取發(fā)酵成熟泡辣椒，打碎，以泡辣椒∶蒸餾水為1∶2的比例添加，加熱煮沸10 min，過濾，得泡菜汁。

1.3.2 菌懸液的制備

將0.2 mL L1和L2菌種分別接入10 mL YM液體培養(yǎng)基中，30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)16～18 h，菌懸液保存于冰箱備用；將0.2 mL L3菌種接入10 mL PCA液體培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12～14 h后，菌懸液保存于冰箱備用。

1.3.3 評價抑菌效果的方法

1.3.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取9 mL泡菜汁培養(yǎng)基，接種1 mL各菌株的菌懸液，其中 L1和L2菌種在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)14 h，L3菌種在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h，做空白對照。菌株培養(yǎng)完成后，得到培養(yǎng)后的菌懸液，用無菌生理鹽水進行稀釋，配制菌懸液含量分別為5%、10%、20%、40%、60%、80%，以空白組的培養(yǎng)基作為對照，測定稀釋后的不同濃度的菌懸液在600 nm處的OD值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

1.3.3.2 計算抑菌率的方法

將各培養(yǎng)后的菌懸液接種到泡菜汁培養(yǎng)基中，菌株初始菌量為脹袋泡辣椒樣品的初始菌量左右，其中L1和L2的接種量為5.50×106CFU/mL，L3的接種量為6.70×107CFU/mL。在泡辣椒液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的防腐劑，其中L1和L2菌種在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)14 h，L3菌種在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h，在600 nm下測定其OD 值。將接種相同的菌株，以不添加防腐劑的培養(yǎng)基作為對照組，在相同條件下培養(yǎng)，然后在600 nm下測定吸光值[9]，每次實驗重復(fù)3次。

1.3.4 單一防腐劑對泡菜中產(chǎn)氣微生物抑制效果研究

根據(jù) GB 2760—2014的規(guī)定和相關(guān)文獻記載[10]，選用山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉4種防腐劑作為抑菌劑，對L1、L2和L3 3株產(chǎn)氣微生物進行抑菌實驗，用抑菌率來表示防腐劑的抑菌效果，單一防腐劑的濃度水平見表1。

表1 防腐劑濃度水平Table 1 Concentration levels of preservatives g/L

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計復(fù)合防腐劑對泡菜中產(chǎn)氣微生物抑制作用研究

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇3種抑菌效果較好的防腐劑為試驗因子，以產(chǎn)氣微生物的抑菌率為響應(yīng)值，采取響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化出最佳的對產(chǎn)氣微生物的抑菌效果，抑菌率≥99.0%[11]。試驗結(jié)果采用Design-Expert V8.0.5b軟件中的Box-Behnken 法則進行響應(yīng)面試驗設(shè)計[12-14]。

1.3.6 復(fù)合防腐劑對泡辣椒產(chǎn)氣的驗證

取發(fā)酵成熟的泡辣椒產(chǎn)品，按500 g/袋分裝，121 ℃殺菌15 min。將菌懸液接種到殺菌后的辣椒樣品中，菌株初始菌為1.3.3.2方法中的量，再添加實驗所得的最佳復(fù)配防腐劑方案，30 ℃恒溫放置，觀察是否有脹袋現(xiàn)象，實驗有3個平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 活化后產(chǎn)氣微生物活菌數(shù)測定

分別取1.3.3.1培養(yǎng)后的菌懸液1 mL，測定其活菌數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 3株產(chǎn)氣微生物活化后菌落總數(shù)Table 2 Total number of colonies activated by three aerogens

2.1.2 產(chǎn)氣微生物的線性回歸方程

以3株產(chǎn)氣微生物在600 nm的吸光度測定值為縱坐標(biāo)，以菌懸液的稀釋濃度為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 3株產(chǎn)氣微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curves of three aerogens

通過對3株產(chǎn)氣微生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行線性擬合，得出回歸方程，見表3。其中3株產(chǎn)氣微生物線性回歸方法的R2均大于0.99，說明擬合性較好。

表3 3株產(chǎn)氣微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程Table 3 The linear regression equations of the standard curves of three aerogens

2.2 單一防腐劑對產(chǎn)氣微生物抑菌率結(jié)果

2.2.1 不同濃度山梨酸鉀對產(chǎn)氣微生物抑制效果的影響

圖2 不同濃度山梨酸鉀對產(chǎn)氣微生物的抑制效果Fig.2 Effect of different concentration of potassium sorbate on the inhibition of aerogens

由圖2可知，山梨酸鉀對3株菌均有明顯的抑制效果，隨著山梨酸鉀濃度的逐漸增大，抑菌率逐漸增大。其中山梨酸鉀的濃度為0.2 g/L時，對L1的抑制率為43.99%，對L2的抑制率為35.80%，對L3的抑制率為58.54%；當(dāng)山梨酸鉀的濃度達到0.5 g/L時，對L1、L2和L3的抑菌率均大于70%，分別為80.13%、74.54%和83.52%；當(dāng)山梨酸鉀的濃度達到最大1.1 g/L時，抑制率最大，但均小于99.0%，不能控制產(chǎn)氣微生物。因此可以得出，山梨酸鉀對這3株菌都有著相對較強的抑制作用，綜合考慮，確定山梨酸鉀的添加量為 0.20～0.40 g/L。

2.2.2 不同濃度脫氫乙酸鈉對產(chǎn)氣微生物抑制效果的影響

圖3 不同濃度脫氫乙酸鈉對產(chǎn)氣微生物的抑制效果Fig.3 Effect of different concentration of sodium dehydroacetate on the inhibition of aerogens

由圖3可知，脫氫乙酸鈉對3株菌均有明顯的抑制效果，隨著脫氫乙酸鈉濃度的不斷增加，抑菌率也越來越大。其中當(dāng)脫氫乙酸鈉濃度為0.30 g/L 時，對L1、L2、L3 3株菌的抑制率都達到 80% 以上，抑制率分別為88.87%、86.43%、82.27%。當(dāng)脫氫乙酸鈉濃度為0.50 g/L時，除 L3外，其余2株菌的抑制率達到了90%以上，可見，脫氫乙酸鈉對L3的抑制效果相對較低，脫氫乙酸鈉濃度達到最大1.1 g/L時，抑制率最大，但均小于99.0%，不能控制產(chǎn)氣微生物。因此可以得出，脫氫乙酸鈉對這3株菌都有著較強的抑制作用，綜合考慮，確定脫氫乙酸鈉的添加量為 0.10～0.30 g/L。

2.2.3 不同濃度苯甲酸鈉對產(chǎn)氣微生物抑制效果的影響

圖4 不同濃度苯甲酸鈉對產(chǎn)氣微生物的抑制效果Fig.4 Effect of different concentration of sodium benzoate on the inhibition of aerogens

由圖4可知，隨著苯甲酸鈉濃度的逐漸增加，對3株菌的抑制效果也越來越明顯。其中當(dāng)苯甲酸鈉濃度為0.30 g/L 時，對L1、L2、L3 3株產(chǎn)氣微生物的抑制率都達到70%以上，抑制率分別為71.11%、78.88%、90.31%，其中相同濃度的苯甲酸鈉對L3的抑菌率明顯比L1和L2的抑菌率高，當(dāng)苯甲酸鈉濃度達到最大1.1 g/L時，抑制率最大，但均小于99.0%，不能控制產(chǎn)氣微生物。因此可以得出，苯甲酸鈉對這3株菌都有著較強的抑制作用，綜合考慮，確定苯甲酸鈉的添加量為 0.10～0.30 g/L。

2.2.4 不同濃度乙二胺四乙酸二鈉對產(chǎn)氣微生物抑制效果的影響

圖5 不同濃度乙二胺四乙酸二鈉對產(chǎn)氣微生物的抑制效果Fig.5 Effect of different concentration of EDTA on the inhibition of aerogens

由圖5可知，隨著乙二胺四乙酸二鈉濃度的逐漸增加，對3株菌的抑制效果也在逐漸增強。但當(dāng)乙二胺四乙酸二鈉濃度為0.25 g/L 時，對L1、L2、L3 3株產(chǎn)氣微生物的抑制率都未達到50%，由此可以看出在國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的添加量下，乙二胺四乙酸二鈉不能有效地抑制3株菌的生長繁殖。綜合考慮，乙二胺四乙酸二鈉不作為復(fù)合防腐劑中的一種。

2.2.5 防腐劑對產(chǎn)氣微生物抑菌率的響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.5.1 回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計響應(yīng)面法[15]。因素和水平見表4，試驗結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 4 Design of Box-Behnken experiment g/L

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

續(xù) 表

使用軟件Design-Expert 8.0.6.1，以不同濃度的山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉以及苯甲酸鈉為響應(yīng)變量，同時以抑菌率為指標(biāo)值(響應(yīng)值)，通過二次多項式擬合(非線性)，得到L1抑菌率(Y1)、L2抑菌率(Y2)以及L3抑菌率(Y3) 為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

Y1=99.43+3.61A+2.71B+2.55C+0.68AB+1.91AC-4.02BC-3.13A2-7.12B2-4.08C2，

Y2=99.50-1.09A+13.26B+5.67C-2.23AB-1.71AC-0.078BC-6.37A2-11.06B2-8.30C2，

Y3=99.47-1.07A-0.89B+0.71C-0.55AB-0.34AC+0.85BC-5.31A2-0.84B2-1.44C2。

表6 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface regression model

續(xù) 表

注：“*”表示顯著(0.01

由表6可知，回歸模型的P值均小于 0.0001，達到了極顯著水平，說明該模型顯著回歸，能夠很好地反映L1、L2、L3 3株產(chǎn)氣微生物的抑制率與不同防腐劑之間的相互關(guān)系。該模型的失擬項P值分別為0.0576，0.7592和0.3839，均大于0.05，差異不顯著，說明該回歸模型與實際試驗具有較好擬合性，自變量與抑菌率之間關(guān)系顯著，相關(guān)系數(shù) R2分別為0.9858，0.9987，0.9918，RAdj2分別為0.9676，0.9970，0.9812，表明響應(yīng)面法設(shè)計所得的回歸模型有效，適用于此復(fù)合防腐劑對泡辣椒中產(chǎn)氣微生物的抑制研究提供理論預(yù)測。

2.2.5.2 響應(yīng)面分析

圖6 各因素交互作用對L1抑菌率的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of interaction of various factors on the inhibition rate of L1

由圖6和表6可知，當(dāng)山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和苯甲酸鈉交互作用時，對L1均顯著，對L1的抑菌率隨著山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和苯甲酸鈉添加量的增大均呈先上升后下降的趨勢；由圖7和表6可知，當(dāng)苯甲酸鈉取零點值時，山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉的等高線趨于圓形，交互作用不顯著；由圖8和表6可知，當(dāng)山梨酸鉀取零點值時，脫氫乙酸鈉和苯甲酸鈉的等高線趨于圓形，交互作用不顯著。

圖7 各因素交互作用對L2抑菌率的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of interaction of various factors on the inhibition rate of L2

圖8 各因素交互作用對L3抑菌率的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of interaction of various factors on the inhibition rate of L3

利用Design-Expert軟件，通過對兩個二次回歸方程進行聯(lián)合求解，得出當(dāng)山梨酸鉀添加量為0.29 g/L、脫氫乙酸鈉添加量為0.26 g/L和苯甲酸鈉添加量為0.31 g/L時，對L1的抑菌率達到最大，理論預(yù)測值為99.75%；當(dāng)山梨酸鉀添加量為0.32 g/L、脫氫乙酸鈉添加量為0.22 g/L和苯甲酸鈉添加量為0.30 g/L時，對L2的抑菌率達到最大，理論預(yù)測值為100.326%，當(dāng)山梨酸鉀添加量為0.24 g/L、脫氫乙酸鈉添加量為0.28 g/L和苯甲酸鈉添加量為0.30 g/L時，對L3的抑菌率達到最大，理論預(yù)測值為102.697%，對最佳復(fù)配防腐劑進行驗證研究，結(jié)合實際生產(chǎn)需要，綜合考慮復(fù)配防腐劑對泡辣椒中產(chǎn)氣微生物的抑制研究，將預(yù)測條件校正為山梨酸鉀0.30 g/L，脫氫乙酸鈉0.25 g/L，苯甲酸鈉0.30 g/L。該結(jié)果符合GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，在此研究優(yōu)化工藝條件下，對實驗中的L1、L2、L3 3株產(chǎn)氣微生物的抑制率達到99.50%以上，與模型理論預(yù)測的偏差為0.25%左右，由此可以得出該響應(yīng)面的回歸模型具有可行性。

2.2.6 復(fù)合防腐劑對泡辣椒產(chǎn)氣驗證結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果分析，3種防腐劑對L1、L2、L3 3株產(chǎn)氣微生物的顯著性不同。將按照山梨酸鉀0.30 g/L，脫氫乙酸鈉0.25 g/L，苯甲酸鈉0.30 g/L組合添加到袋裝泡辣椒產(chǎn)品中，30 ℃下放置5 d后，觀察到添加復(fù)合防腐劑的泡辣椒產(chǎn)品無脹袋現(xiàn)象，空白組產(chǎn)品出現(xiàn)嚴(yán)重脹袋現(xiàn)象。由此得出，添加復(fù)合防腐劑對比空白組，有較好的抑菌作用，該復(fù)合防腐劑對產(chǎn)品有很好的保質(zhì)和貯存效果。

3 結(jié)論

通過研究得出，乙二胺四乙酸二鈉作為抑菌劑對產(chǎn)氣微生物的控制效果較差，山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和苯甲酸鈉有較為明顯的抑菌效果，但都不能完全控制住產(chǎn)氣微生物的生長，故通過復(fù)配防腐劑，結(jié)合單因素結(jié)果，采用響應(yīng)面分析方法，考慮實際生產(chǎn)需要，將山梨酸鉀添加量為0.30 g/L，脫氫乙酸鈉添加量為0.25 g/L，苯甲酸鈉添加量為0.30 g/L進行組合，對泡辣椒產(chǎn)品中的L1、L2和L3 3株產(chǎn)氣微生物的抑菌率達到99.50%以上。通過驗證該復(fù)配防腐劑，能控制泡辣椒產(chǎn)品的脹袋問題，延長產(chǎn)品的貨架期。