莊娟，張佳琪，湯瀟，馬心如，張麗婭，李夢秋

1. 江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，淮陰師范學(xué)院，淮安 223300 2. 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，淮安 223300 3. 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇師范大學(xué)，徐州 221116

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)，是一種重要的阻燃劑，在化工、建材和電子等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。因PBDEs只添加于產(chǎn)品中，很容易釋放到環(huán)境，成為全球性污染[1]。PBDEs具有化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物蓄積性強(qiáng)的特點(diǎn)，可經(jīng)食物鏈逐級放大后進(jìn)入人體[2]。最受關(guān)注的是PBDEs對神經(jīng)系統(tǒng)的危害性。研究表明，PBDEs對兒童具有潛在的神經(jīng)發(fā)育毒性，可影響兒童智力[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PBDEs對神經(jīng)系統(tǒng)的危害[4-5]。頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織都與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)[6-8]。眾多的研究表明，PBDEs可影響海馬組織[9]，但對頂葉皮質(zhì)和丘腦的影響尚不清楚。2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)是生物體內(nèi)含量最多、毒性最強(qiáng)的PBDEs之一。筆者之前的研究已證實(shí)，BDE-47慢性暴露可導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降[5,10]。本研究主要探究BDE-47慢性暴露對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)——頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織的影響及作用機(jī)制，為進(jìn)一步探明BDE-47神經(jīng)毒機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只7周齡C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)溫度(22±1) ℃，濕度50%±10%，光照時(shí)間7:30—19:30。自由進(jìn)水和進(jìn)食。

1.2 主要試劑和儀器

BDE-47購自Chem. Service公司(美國)，純度>99%；異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司(中國)；尼氏(Nissl)染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(中國)；抗NLRP3和Iba1抗體購自Novus公司(美國)；In Situ Cell Death Detection Kit細(xì)胞死亡試劑盒購自Roche公司(美國)；Trizol試劑盒購自Invitroge公司(美國)；Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR預(yù)混Ex Taq購自寶生物工程(大連)有限公司(中國)。

CM1850冰凍切片機(jī)購自Leica公司(德國)；IX71熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司(日本)；ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自Steponeplus公司(美國)。

1.3 小鼠染毒處理

筆者之前的實(shí)驗(yàn)表明，20 mg·kg-1BDE-47處理8周可導(dǎo)致小鼠海馬組織損傷和學(xué)習(xí)記憶能力下降[5,10]。本實(shí)驗(yàn)BDE-47暴露劑量和暴露方法按照筆者之前報(bào)道的方法進(jìn)行[10]。BDE-47溶解于玉米油，配制濃度為20 mg·kg-1。小鼠分2組，每組10只，分別用玉米油和BDE-47灌胃，每日處理一次，共處理8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食過夜后用異氟烷深度麻醉，取出腦組織，多聚甲醛4 ℃固定2 h。蔗糖梯度脫水后，腦組織進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為12 μm，獲取相應(yīng)區(qū)域的腦片。

1.4 尼氏染色

腦組織切片尼氏染色在室溫下進(jìn)行，染色5 min，去離子水洗3 min，無水乙醇蘸過后用二甲苯透明5 min，蓋上蓋玻片后用于觀察。

1.5 免疫熒光染色

免疫熒光染色按照筆者之前報(bào)道的方法進(jìn)行[5]。切片用含10%驢血清的封閉液室溫封閉1 h。用抗NLRP3(1∶300)或Iba1(1∶500)抗體，4 ℃孵育過夜。二抗于室溫下孵育1 h后，DAPI染核；熒光顯微觀察，挑取典型區(qū)域進(jìn)行圖像采集。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

用Trizol試劑盒提取相應(yīng)腦組織總RNA，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以1 μg RNA為模板用于反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA。用Takara SYBR預(yù)混的Ex Taq進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。IL-1β引物(5’-3’)：AAATACCTGTGGCCTTGGGC，引物(3’-5’)：CTTGGGATCCACACTCTCCAG。IL-6引物(5’-3’)：GTCCTTCCTACCCCAATTTCCAA，引物(3’-5’)：GAATGTCCACAAACTGATATGCTTAGG。GAPDH為內(nèi)參，檢測目的mRNA含量。

1.7 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色

腦切片先用胰蛋白酶37 ℃處理10 min。然后采用TUNEL反應(yīng)混合液(Roche公司，美國)于37 ℃作用1 h，DAPI核染；熒光顯微觀察，凋亡細(xì)胞在520 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光，挑取典型區(qū)域進(jìn)行圖像采集。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析和Tukey’s顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 尼氏染色

腦組織經(jīng)尼氏染色后，顯微鏡下選取與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和丘腦組織進(jìn)行觀察并獲取照片，結(jié)果如圖1和圖2所示。玉米油對照組小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織神經(jīng)元形態(tài)飽滿，細(xì)胞質(zhì)較多，體積大，染色均勻，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊有序；BDE-47暴露小鼠相應(yīng)區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)固縮不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞胞體小，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列散亂不規(guī)則。

2.2 NLRP3免疫熒光染色結(jié)果

腦組織經(jīng)NLRP3特異性免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下對頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和丘腦組織NLRP3的表達(dá)情況進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果表明，在小鼠腦組織內(nèi)，NLRP3在頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層和丘腦區(qū)域都有表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。與對照組相比，BDE-47處理組小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞和丘腦區(qū)域NLRP3表達(dá)均增強(qiáng)(圖3～圖5)。

圖1 小鼠頂葉皮質(zhì)和海馬顯微結(jié)構(gòu)圖(焦油紫染色)Fig. 1 The representative images of the parietal cortex and hippocampus regions of mice (stained with crystal violet)

圖2 小鼠丘腦組織顯微結(jié)構(gòu)圖(焦油紫染色)Fig. 2 The representative images of the thalamus region of mice (stained with crystal violet)

圖3 小鼠頂葉皮質(zhì)NLRP3免疫熒光染色結(jié)果Fig. 3 The representative images of NLRP3 immunofluorescence staining in the parietal cortex region of mice

圖4 小鼠海馬組織NLRP3免疫熒光染色結(jié)果Fig. 4 The representative images of NLRP3 immunofluorescence staining in the hippocampus region of mice

圖5 小鼠丘腦組織NLRP3免疫熒光染色結(jié)果Fig. 5 The representative images of NLRP3 immunofluorescence staining in the thalamus region of mice

2.3 Iba1免疫熒光染色結(jié)果

Iba1是神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。腦組織經(jīng)Iba1特異性免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下對頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和丘腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和分布進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果表明，在對照組小鼠腦組織內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞多呈短棒狀，胞體較小，在頂葉皮質(zhì)內(nèi)分布較多，在海馬CA1區(qū)次之，在丘腦內(nèi)分布稀少。慢性BDE-47暴露后，小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和丘腦內(nèi)Iba1信號增強(qiáng)；小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞體增大(圖6～圖8)。這些結(jié)果表明，BDE-47可激活小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞。

圖6 小鼠頂葉皮質(zhì)Iba1免疫熒光染色結(jié)果Fig. 6 The representative images of Iba1 immunofluorescence staining in the parietal cortex region of mice

圖7 小鼠海馬組織Iba1免疫熒光染色結(jié)果Fig. 7 The representative images of Iba1 immunofluorescence staining in the hippocampus region of mice

圖8 小鼠丘腦組織Iba1免疫熒光染色結(jié)果Fig. 8 The representative images of Iba1 immunofluorescence staining in the thalamus region of mice

2.4 炎癥因子表達(dá)情況

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果如圖9所示，與對照組相比，BDE-47暴露顯著促進(jìn)了小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織炎癥因子IL-1β(頂葉皮質(zhì)P<0.01；海馬P<0.05，丘腦P<0.05)和IL-6 (頂葉皮質(zhì)P<0.01；海馬P<0.05，丘腦P<0.05)基因的表達(dá)。

圖9 BDE-47對小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織IL-1β和IL-6基因表達(dá)的影響(n=3)注：與對照組相比，*P<0.05、**P<0.01。Fig. 9 BDE-47 enhances the mRNA expression of IL-1β and IL-6 in the parietal cortex, hippocampus and thalamus of mice (n=3)Note: *P<0.05, **P<0.01 versus the control group.

2.5 TUNEL染色結(jié)果

腦組織TUNEL染色后，在熒光顯微鏡下對頂葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)和丘腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果如圖10所示，對照組小鼠的相應(yīng)腦區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞很少。經(jīng)BDE-47暴露后的小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬CA1錐體細(xì)胞層和丘腦組織TUNEL陽性細(xì)胞增多。

圖10 小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織TUNEL染色結(jié)果注：(a)和(b)為對照組頂葉皮質(zhì)；(c)和(d)為BDE-47組頂葉皮質(zhì)；(e)和(f)為對照組海馬組織；(g)和(h)為BDE-47組海馬組織；(i)和(j)為對照組丘腦組織；(k)和(l)為BDE-47組丘腦組織。Fig. 10 Representative images of the fragmented DNA (TUNEL assay) in the parietal cortex, hippocampus and thalamus regions of miceNote: (a) and (b) show parietal cortex of control mice; (c) and (d) show parietal cortex of BDE-47-treated mice; (e) and (f) show hippocampus of control mice; (g) and (h) show hippocampus of BDE-47-treated mice; (i) and (j) show thalamus region of control mice; (k) and (l) show thalamus region of BDE-47-treated mice.

3 討論(Discussion)

神經(jīng)毒性是PBDEs影響人類健康的重要方面。發(fā)育期遭受PBDEs暴露的嬰幼兒表現(xiàn)為智力和行為異常[3]。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，PBDEs暴露導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降與海馬組織受損有關(guān)[9]。頂葉皮質(zhì)在學(xué)習(xí)及記憶提取過程中具有重要作用[6]。以往的研究表明，BDE-71[11]和BDE-99[12]可影響大腦皮質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，BDE-209暴露可改變小鼠大腦皮質(zhì)的氧化狀態(tài)[13]。但BDE-47暴露是否影響皮質(zhì)尚不清楚。此外，丘腦也是參與認(rèn)知功能的重要腦區(qū)[8]，但PBDEs是否對丘腦有損傷尚未知曉。筆者之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BDE-47慢性暴露可引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。本實(shí)驗(yàn)用尼氏染色法檢測學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)——頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織的組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明，成年小鼠經(jīng)慢性BDE-47暴露后，學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)——海馬組織的CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元皺縮變小。此外，其頂葉皮質(zhì)和丘腦組織神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)少，胞體變小，形態(tài)固縮不規(guī)則，這表明，慢性BDE-47暴露不僅影響海馬組織，還可損傷頂葉皮質(zhì)和丘腦組織。

慢性神經(jīng)炎癥是造成神經(jīng)元功能損傷的重要原因[14]，而NLRP3炎癥體與慢性神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[15]。NLRP3通過與ASC-caspase-1結(jié)合形成促炎平臺(tái)，產(chǎn)生IL-1β和IL-18炎癥因子。筆者之前的研究結(jié)果表明，慢性BDE-47暴露導(dǎo)致的小鼠海馬組織損傷與NLRP3炎癥體激活有關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期結(jié)果相一致，慢性BDE-47暴露促使小鼠海馬CA1區(qū)NLRP3熒光信號增強(qiáng)。同時(shí)，炎癥因子IL-1β和IL-6基因表達(dá)水平相應(yīng)上升。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，BDE-47暴露后，小鼠頂葉皮質(zhì)和丘腦組織也出現(xiàn)NLRP3熒光信號變強(qiáng)以及IL-1β和IL-6基因表達(dá)升高的現(xiàn)象。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的內(nèi)源性免疫反應(yīng)[16]。當(dāng)腦神經(jīng)系統(tǒng)紊亂或發(fā)生炎癥時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，表現(xiàn)為胞體增大，細(xì)胞呈圓形或桿狀。Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活時(shí)，Iba1的表達(dá)量上調(diào)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BDE-47可導(dǎo)致小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織Iba1免疫熒光信號上調(diào)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。這些結(jié)果表明，NLRP3炎癥體活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能與BDE-47暴露致小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬及丘腦組織損傷有關(guān)。

筆者和其他學(xué)者均發(fā)現(xiàn)，BDE-47的神經(jīng)毒作用機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞凋亡異常增強(qiáng)有關(guān)[10,18]。眾多的研究證據(jù)表明，NLRP3炎癥體激活介導(dǎo)的慢性炎癥是促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素[19]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，雖然對照組小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織也存在TUNEL陽性細(xì)胞，但數(shù)量很少。BDE-47暴露導(dǎo)致小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織TUNEL陽性細(xì)胞增多，這說明，BDE-47通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織損傷。

總之，本研究結(jié)果提示，慢性BDE-47暴露可損傷小鼠頂葉皮質(zhì)、海馬和丘腦組織，其毒性機(jī)制可能與NLRP3炎癥體激活介導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。