張紀亮，王力軍，謝嘉，洪美玲，丁利，李二超，刁曉平,*

1. 海南師范大學熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，?？?571158 2. 海南大學海洋學院，?？?570228

大數(shù)據(jù)時代的來臨對實驗科學，包括毒理學，產(chǎn)生了重大影響。通過對海量數(shù)據(jù)的研究分析來探索其中的規(guī)律，可以直接提出假設，并有可能為得出可靠的結論提供重要參考依據(jù)。自2004年發(fā)布以來，比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫(CTD)(http://ctdbase.org)已經(jīng)發(fā)展成為一種重要的毒理信息學資源[1]。CTD數(shù)據(jù)庫通過將文獻資料中的信息(如文本、表格、數(shù)字和補充文件等)轉換成為帶注釋的信息，將不同的數(shù)據(jù)標準化并組織成結構化的格式，使其具有內(nèi)聚性、可管理性和可計算性。CTD核心內(nèi)容來自3個綜合模塊：毒理基因組模塊(包含超過170萬個化學物質(zhì)-基因/蛋白質(zhì)相互作用的信息)、疾病模塊(包含超過245 000個化學物質(zhì)-疾病和基因-疾病相互聯(lián)系的信息)、暴露模塊(包含超過111 000個與環(huán)境脅迫、受體、生物標志物和有害結局等相關的描述)[1]。在CTD數(shù)據(jù)庫中，由于詞匯表、基因符號、基因注釋和疾病等信息的標識化，使得這些信息可以被交叉整合，從而獲得新的發(fā)現(xiàn)。因此，通過對CTD數(shù)據(jù)的手動策劃，有可能發(fā)現(xiàn)新的和全面的環(huán)境污染物暴露的毒性效應和分子機制。

尼泊金酯(parabens)，又稱對羥基苯甲酸酯，被廣泛用于藥物和食品保存的抗微生物劑[2]。在這些化合物中，常用的包括尼泊金甲酯(methyl paraben, MeP)、尼泊金乙酯(ethyl paraben, EtP)、尼泊金丙酯(propyl paraben, PrP)、尼泊金丁酯(butyl paraben, BuP)和尼泊金芐酯(benzyl paraben, BzP)。尼泊金酯化合物作為防腐劑，已應用于超過22 000種化妝品中，單一化合物濃度高達0.4%，而多化合物混合濃度高達0.8%[3]。尼泊金酯化合物已經(jīng)在食品中使用了幾十年，濃度高達0.1%，并且包括MeP、PrP和BuP在內(nèi)的幾種尼泊金酯化合物作為調(diào)味劑和佐劑直接添加到食品中[4]。Liao等[5]對我國各類食品中尼泊金酯化合物進行檢測，檢出率高達99%，尼泊金酯總濃度最高達2 530 ng·g-1，尼泊金酯在各類食品中的總平均濃度為39.3 ng·g-1，其中，MeP、EtP和PrP是食品中最主要的尼泊金酯，分別占總濃度的59%、24%和10%。大量研究表明，尼泊金酯類化合物廣泛存在于人體尿液、血清、胎盤、乳腺腫瘤組織和脂肪組織中[6-8]。目前，尼泊金酯化合物在地表水中廣泛存在，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的水平最高分別可達27 500、30 500、52 100、19 900和31.0 ng·L-1[9]。我國黃河表層水中尼泊金酯總濃度為3.31～55.2 ng·L-1，其中，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的平均濃度分別為8.84、0.359、5.44、0.233和0.080 ng·L-1；淮河表層水中尼泊金酯總濃度為15.0～164 ng·L-1，其中，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的平均濃度分別為51.7、0.361、6.48、0.082和0.104 ng·L-1[10]。尼泊金酯類已被確定為新型污染物，其對生態(tài)和人類健康的影響一直備受科學家和公眾的關注。在生物體內(nèi)，許多化學物質(zhì)能夠影響一個以上的生物過程；同時，不同的化學物質(zhì)可能同時影響生物相似的生物過程。因此，在本研究中，擬通過CTD數(shù)據(jù)庫，分析和比較5種常見的不同的尼泊金酯化合物對生物過程影響的機制，以期為之后的相關研究提供啟發(fā)和思路。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究根據(jù)2018年8月CTD更新的數(shù)據(jù)進行分析。更新后共計有38 344 568交互作用信息。核心CTD包括了1 812 207個化學物質(zhì)-基因相互作用信息，24 299 522個基因-疾病聯(lián)系信息，2 507 429個化學物質(zhì)-疾病聯(lián)系信息，以及122 725個化學物質(zhì)暴露信息。

1.2 CTD分析

進入CTD的界面后，應用Set Analyzer能夠分析篩選出與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相互作用的基因。將這些基因的NCBI symbols或IDs輸入CTD的Set Analyzer中，應用Common gene-gene interactions功能，選擇Bonferroni校正P值(默認0.01)，即可進行基因間相互作用網(wǎng)絡分析。

1.3 維恩圖制作

使用Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)軟件，計算不同尼泊金酯類影響基因列表的交集，獲得維恩圖。

1.4 KEGG通路分析

進入DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)后，選擇“Start Analysis”，分別提交在CTD中篩選出的與5種尼泊金酯類相互作用的全部基因，設置校正的Fisher精確檢驗EASE分值為0.2。分析完成后，選擇全部物種和“KEGG _ PATHWAY”，即可得出所需全部通路。

1.5 色階表格制作

將數(shù)據(jù)導入Microsoft Excel后，對數(shù)據(jù)進行平方根化處理，選擇“條件格式-色階-紅白色階”，即得到紅白色階圖。在相關基因表中，表格顏色越深，代表基因出現(xiàn)的頻次越高；在KEGG通路表中，表格顏色越深，代表在該通路上富集的基因數(shù)目越多。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 相關基因分析

通過CTD數(shù)據(jù)庫，獲得與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相關的基因個數(shù)分別為29、17、45、163和14。通過維恩分析，發(fā)現(xiàn)5種尼泊金酯類化合物共同影響的基因7個(表1和圖1)。如表1所示，這7個基因分別是CCAAT增強子結合蛋白(CEBPA)、雌激素受體1(ESR1)、雌激素受體2(ESR2)、雌激素相關受體γ(ESRRG)、瘦素(LEP)、核受體共激活因子2(NCOA2)和過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)。這7個共同影響基因按功能大致可以2類。一類與脂代謝有關，如PPARG和CEBPA是前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的必需分子[11]；LEP則能夠通過與體內(nèi)多個信號分子相互作用，調(diào)控脂肪貯存、能量代謝和攝食行為等[12]。另一類為雌激素受體，雌激素受體在化學物雌激素樣作用過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控和介導作用[13]。另外，需要注意的是，核受體機制可能是尼泊金酯類重要的作用機制。在7個共同影響的基因中，5個基因為核受體(ESR1、ESR2、ESRRG和PPARG)或核受體共激活因子(NCOA2)。

圖1 維恩分析比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫中與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相關的基因Fig. 1 Venn analysis for genes related to MeP, EtP, PrP, BuP and BzP in Comparative Toxicogenomics Database

表1 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP共同作用的7個基因Table 1 Seven genes co-affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

在CTD數(shù)據(jù)庫中，與所有的5種尼泊金酯類相互作用的基因共計190個。為了分析這些基因之間的相互聯(lián)系，筆者進行了基因間相互作用網(wǎng)絡的分析。如圖2所示，除LEP外，其他5個尼泊金酯類共同影響基因(CEBPA、ESR1、ESR2、ESRRG、NCOA2和PPARG)均出現(xiàn)在基因相互作用網(wǎng)絡圖中。在基因相互網(wǎng)絡圖中，綠色圓點的面積越大、顏色越深，表明其代表的基因與其他基因的相互作用越強，越處于中心地位?？梢钥闯觯岵唇瘐ヮ惞餐绊懟蛑械腅SR1和ESR2均擁有較多關聯(lián)基因，處于中心地位(圖2)。這說明，對雌激素受體的干擾作用可能是5種尼泊金酯類化合物共同的重要毒性機制。體外研究表明，尼泊金酯類能夠與ESR1和ESR2結合[14]，屬于環(huán)境化學物的雌激素樣作用的典型作用機制。尼泊金酯類與雌激素受體的親和力比17β-雌二醇(E2)低幾個數(shù)量級；BuP效力最強，比E2低約10 000倍[15]。盡管作用微弱，但由于不同尼泊金酯類在環(huán)境或人體中經(jīng)常同時存在，它們之間還可能存在協(xié)同效應[16]，因此，尼泊金酯類化合物復合暴露風險的評估在今后研究中不容忽視。雌激素受體不管在雌性還是雄性動物的生殖中均具有重要作用。體內(nèi)研究已經(jīng)證實，尼泊金酯類能夠誘導嚙齒類動物子宮增生，干擾子宮組織學，影響雄性動物生殖參數(shù)[2]。

除了ESR1和ESR2，發(fā)現(xiàn)主要卵黃蛋白(MYP)(ID為373376)、腫瘤蛋白p53(TP53)(ID為7157)與神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(NTRK1)(ID為4914)在基因間相互作用網(wǎng)絡中處于較中心的地位。MYP為非哺乳類卵生雌性動物的一種特異性蛋白，又稱卵黃蛋白原(Vtg)[17]，是維持卵母細胞和胚胎發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)。在生態(tài)毒理學中，Vtg已經(jīng)成為一種靈敏的環(huán)境雌激素和類雌激素效應的生物標志物。對MYP的干擾作用最終將影響動物的生殖和胚胎發(fā)育。TP53是一種廣譜腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物為多功能的轉錄調(diào)節(jié)因子，可以發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞生長、細胞凋亡和DNA修復的作用[18]。事實上，尼泊金酯類化合物是在乳腺腫瘤中檢出后，開始引起人們的關注[19]，并已證實，尼泊金酯可以在體外誘導MCF-7人乳腺癌細胞的增殖[20]。NTRK1介導神經(jīng)細胞中神經(jīng)生長因子信號傳導的多個作用，如促進神經(jīng)元的增殖或分化[21]。由于MYP、TP53和NTRK1不屬于尼泊金酯類共同作用基因，無法推斷所有尼泊金酯類是否都能夠通過這3個基因分別介導生殖毒性、致癌性和神經(jīng)毒性。但當所有的尼泊金酯類同時出現(xiàn)在環(huán)境或人體內(nèi)時，可能誘導這些組合效應。

圖2 應用比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫分析與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相關的所有基因間相互作用網(wǎng)絡注：實線圈表示共同作用基因；虛線圈表示非共同作用基因，但處于較中心地位。Fig. 2 Network map of all genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP in Comparative Toxicogenomics DatabaseNote: The solid circles represent co-acting genes; the dotted circles represent non-co-acting genes but locate in more central positions.

基于維恩分析和基因間相互作用網(wǎng)絡分析的結果，尼泊金酯類化合物可能具有弱雌激素效應和干擾脂代謝毒性作用。因此，筆者分別整理了與尼泊金酯類化合物相互作用的與生殖(表2)和脂代謝(表3)相關基因。

表2 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影響的與生殖有關基因Table 2 Reproduction-related genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

表3 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影響的與脂代謝有關基因Table 3 Lipid metabolism-related genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

一般認為尼泊金酯類化合物的雌激素活性隨著烷基鏈的長度(甲基<乙基<丙基<丁基<異丁基)而增加。因此，長鏈尼泊金酯類，如BuP和PrP最受關注[22]。根據(jù)表2的結果，與BuP相互作用的基因數(shù)量和出現(xiàn)頻次均較高，其次是PrP。與BzP相關的基因數(shù)目最少，僅3個。值得注意的是，除雌激素受體外，BuP和PrP均能夠和雄激素受體(AR)相互作用，MeP、BuP和PrP還能夠與G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(GPER1)相互作用。特別是GPER1，屬于膜受體，不同于傳統(tǒng)核受體(如ESR和AR)，其通過非基因組方式介導雌激素效應，可快速且持久地激活細胞內(nèi)不同的雌激素信號通路，進而影響細胞的增殖及功能[23]。這提示，尼泊金酯類化合物通過激素受體介導的毒性機制的復雜性。除了性激素受體介導的毒性機制外，尼泊金酯類化合物還可能影響激素的合成與轉運。MeP、BuP和PrP均能影響細胞色素P45019A1(CYP19A1)，其編碼產(chǎn)物芳香化酶是雄激素轉化為雌激素的限速酶，是雌激素合成的關鍵酶之一[24]；除BuP外，其他尼泊金酯類均能影響SHBG，其能夠特異性地與性激素相結合并參與其轉運，調(diào)控血液中生物活性性激素的水平[25]。

由表3可知，與BuP相互作用的與脂代謝有關基因數(shù)量和出現(xiàn)頻次最高，其次是PrP和BzP。盡管與BzP影響的性激素有關基因數(shù)量和出現(xiàn)頻次較低，但與其脂代謝有關的基因數(shù)量和頻次卻較高(表3)。根據(jù)篩選的脂代謝有關基因，可以推斷，對脂肪細胞分化的影響可能是尼泊金酯類化合物影響脂代謝的主要作用機制。如前所述，共同影響基因PPARG和CEBPA是脂肪前體細胞分化的關鍵轉錄因子；而脂肪酸合成酶(FASN)是機體脂肪酸合成的主要限速酶，脂肪酸結合蛋白(FABP4)能夠參與細胞內(nèi)脂肪酸的轉運和靶向定位，促進脂肪細胞的分化[26]。另外，脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的重要組成部分，也是內(nèi)源性大麻類物質(zhì)的水解酶[27]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)可調(diào)節(jié)脂肪生成和能量穩(wěn)態(tài)[28]，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中的花生四烯酰乙醇酰胺可直接結合PPARG介導的脂肪細胞分化[29-30]。尼泊金酯類還能夠影響脂肪因子的分泌，如LEP和脂聯(lián)素(ADIPOQ)。LEP和ADIPOQ是脂肪組織合成的最豐富的脂肪因子，在能量穩(wěn)態(tài)和食欲調(diào)節(jié)中起重要作用[31]。

2.2 相關KEGG通路分析

通過對富集基因個數(shù)>5的KEGG通路分析，篩選到大量與生殖相關通路，但并未篩選到與脂肪細胞分化相關的通路，如PPAR信號通路。有意思的是，在篩選出的通路中，有大量與神經(jīng)系統(tǒng)或功能相關的通路。與BuP相關的神經(jīng)系統(tǒng)或功能通路最多，還有少量通路與PrP相關。盡管僅發(fā)現(xiàn)BuP和PrP富集到與神經(jīng)系統(tǒng)或功能相關的通路，但其他尼泊金酯類可能對神經(jīng)系統(tǒng)也可能有相似的影響。最近的流行病學調(diào)查研究表明，孕婦尿液MeP和總尼泊金酯類水平與2歲時女童神經(jīng)認知發(fā)育受損有關[32]。動物實驗也表明，0.1 μg·L-1和1 μg·L-1的MeP暴露能夠誘導斑馬魚(Daniorerio)幼魚焦慮行為[33]；孕早期至斷奶期暴露于BuP后，在誘導雄性仔鼠類似于自閉癥VA模型中觀察到的神經(jīng)發(fā)育障礙[34]。最近有研究表明，盡管BuP暴露濃度低于影響生殖的最低可見有害作用水平(LOAEL)，并沒有顯示出雌激素活性和影響性腺發(fā)育和生育能力的效應，但卻能夠影響生殖行為[35]。這提示，神經(jīng)-行為學較生殖相關指標可能對尼泊金酯類的暴露更加敏感。但相較于生殖毒性，尼泊金酯類神經(jīng)毒性的研究還較少。因此，尼泊金酯對神經(jīng)系統(tǒng)或功能的研究在今后應該加強。另外需要注意的是，本研究未篩選出任何通路與BzP相關，這可能與對BzP的毒性開展研究較少有關。在人體和環(huán)境尼泊金酯類調(diào)查研究中，BzP檢出率和濃度相對其他尼泊金酯化合物均較低[6-10]。但最近，Valle-Sistac等[36]通過對志愿者胎盤中尼泊金酯類水平的調(diào)查，第一次發(fā)現(xiàn)BzP在胎盤中普遍存在。與其他尼泊金酯類不同，BzP不僅用作防腐劑，還廣泛用作制藥、印染/農(nóng)藥生產(chǎn)的中間體，這可能增加其暴露途徑和水平。因此，今后應加強BzP毒性研究，為其生態(tài)和健康風險評估提供基礎數(shù)據(jù)。

篩選出與生殖有關的通路(表4)主要包括兩大類：一類與生殖相關激素的合成、分泌及活性有關，如甾類激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、卵巢類固醇生成(ovarian steroidogenesis)、催乳激素信號通路(prolactin signaling pathway)、促性腺激素釋放激素信號通路(GnRH signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、催產(chǎn)素信號通路(oxytocin signaling pathway)；另一類則主要與卵巢發(fā)育有關，如母細胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、孕酮介導的卵母細胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)通路。

在KEGG通路富集分析中，甾類激素生物合成通路、甲狀腺激素信號通路以及催產(chǎn)素信號通路可能都還與脂代謝或肥胖有關。甾類激素生物合成通路不僅與類固醇激素前體有關，還涉及膽固醇生物合成[37]；甲狀腺激素信號通路除了有助于維持垂體-性腺軸的穩(wěn)定，影響生殖功能外，在能量代謝穩(wěn)態(tài)中也起重要作用[38]；而催產(chǎn)素信號通路除了在分娩、哺乳等生殖相關過程中產(chǎn)生功能外，還通過LEP調(diào)控食欲和脂肪代謝[39]。另外，催產(chǎn)素信號通路還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，能夠調(diào)節(jié)動物的親社會行為(如孤獨癥)。因此，催產(chǎn)素信號通路可能介導了尼泊金酯類的多個相關毒性。

在與神經(jīng)系統(tǒng)或功能相關的通路中，多個通路與化學突觸有關，包括谷氨酸能突觸(glutamatergic synapse)、GABA能突觸(GABAergic synapse)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)和多巴胺能神經(jīng)突觸(dopaminergic synapse)。因此，尼泊金酯類可能通過影響化學性神經(jīng)突觸，進而影響突觸信號傳遞及神經(jīng)系統(tǒng)的通訊功能。此外，神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路能夠介導從細胞外環(huán)境到細胞的信號轉導，調(diào)控突觸的可塑性[40]。在逆向內(nèi)源性大麻素神經(jīng)信號轉導通路中，內(nèi)源性大麻素以活動依賴性方式從神經(jīng)元釋放，逆行作用于突觸前CB1大麻素受體，并調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放；這種逆行信號傳導與短期和長期突觸的可塑性有關，并且有助于某些形式的學習和記憶[41]。神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路的功能包括促進神經(jīng)元生長、發(fā)育和分化，保護受損神經(jīng)元細胞免于死亡，促進神經(jīng)元修復和再生，加強突觸間信號轉導[42]；還能夠參與空間學習、認知功能和人格發(fā)展以及各種精神疾病的發(fā)病機制，包括情緒障礙、精神分裂癥和孤獨癥等[34]。軸突導向通路在神經(jīng)網(wǎng)絡形成過程中起到非常重要作用[43]。筆者還篩選出2個與誘發(fā)神經(jīng)性疾病相關的通路，分別是阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)通路和長期異型突觸性抑郁(long-term depression)通路。

表4 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影響的有關KEGG通路Table 4 KEGG pathways affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

隨著尼泊金酯類化合物使用規(guī)模和范圍逐漸擴大，其作為新興污染物對人類健康影響的研究亟需開展，以便對其進行更加全面的健康風險評估。由于其抗微生物作用，尼泊金酯化合物還可能干擾腸道共生微生物與人體構成的“超級共生體”，對人類健康產(chǎn)生間接影響。腸道共生微生物與人體的代謝、營養(yǎng)和免疫，甚至神經(jīng)系統(tǒng)與精神健康等生理功能密切相關，是重要的“微生物器官”[44]。因此，尼泊金酯化合物對生殖、脂代謝以及神經(jīng)系統(tǒng)的潛在影響，是否與其對腸道共生微生物與人體構成的共生體有關，應該在今后的研究中引起關注。