徐禮臻 朱再生 徐旻

近年來，我國前列腺癌發(fā)病人群日趨年輕化，但關(guān)于前列腺癌的病因仍未完全闡明。癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白5（kinesin-5，Eg5）基因存在于所有真核細胞中，具有ATP酶活性，在有絲分裂過程中對雙極軸的形成和維持起重要作用，參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1-2]，但它在前列腺癌中的作用尚未闡明。本研究對前列腺癌組織及前列腺增生組織中Eg5蛋白表達進行了檢測與比較，同時分析了不同臨床病理特征的前列腺癌患者Eg5蛋白陽性表達率，還分析了Eg5蛋白表達陽性與陰性的前列腺癌患者累計5年進展及生化復(fù)發(fā)情況，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集浙江大學醫(yī)學院附屬金華醫(yī)院2001至2011年手術(shù)治療的前列腺癌65例和前列腺增生38例患者的臨床資料和病理組織標本。65例前列腺癌患者年齡 54～78（65.5±4.5）歲；Gleason 評分＜7 分 32 例，≥7分33例；按照2002年美國癌癥聯(lián)合委員會的TNM臨床分期標準，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期24例；術(shù)前均未接受過放化療和內(nèi)分泌治療。前列腺增生患者年齡53～79（66.2±4.3）歲。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 Eg5蛋白表達的檢測 采用免疫組化SP法。所有標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，使用SP試劑盒、DAB顯色劑（均購自北京中杉生物技術(shù)公司）進行免疫組化染色，二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇水化，加入兔抗人 Eg5 一抗（工作濃度 1：100，規(guī)格：100 μg，批號：abs7431），4 ℃孵育過夜，PBS洗 3次，5 min/次；滴加二抗（生物素標記）室溫孵育0.5 h；PBS洗3次，5 min/次；DAB顯色、蘇木素復(fù)染，封片，在光鏡下觀察。使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：細胞質(zhì)出現(xiàn)褐色顆粒為陽性表達。由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生參照Sulzers表達分級法對實驗結(jié)果進行判斷：幾乎無陽性表達細胞為（-），陽性表達細胞數(shù)＜10%為（+），陽性表達細胞數(shù) 10%～50%為（++），陽性表達細胞數(shù)＞50%為（+++）；其中陽性表達細胞數(shù)≥10%判定為陽性表達。

1.3 相關(guān)標準 臨床進展是指影像學檢查提示局部病灶進展及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目增多；生化復(fù)發(fā)是指血清前列腺特異抗原水平升高，達到0.2 μg/L。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制Kaplan-Meier曲線，采用log-rank法比較Eg5蛋白表達陽性與陰性的前列腺癌患者累計5年進展率及生化復(fù)發(fā)率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺增生組織和前列腺癌組織Eg5蛋白表達的免疫組化染色結(jié)果 Eg5主要表達在細胞質(zhì)，在細胞核中表達較少；前列腺癌組織中Eg5表達高于前列腺增生組織，見圖1（插頁）。

圖1 前列腺增生組織和不同Gleason評分前列腺癌組織中驅(qū)動蛋白5（Eg5）蛋白表達（a：在前列腺增生組織中的表達；b：在Gleason評分7分的前列腺癌組織中的表達；c：在Gleason評分8分的前列腺癌組織中的表達；d：在Gleason評分9分的前列腺癌組織中的表達；免疫組化染色，×100）

2.2 前列腺增生組織與前列腺癌組織中Eg5蛋白陽性表達率比較 前列腺癌組織中Eg5蛋白陽性表達率為69.23%（45/65），明顯高于前列腺增生組織中的陽性表達率15.79%（6/38），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=27.398，P＜0.05）。

2.3 不同臨床病理特征的前列腺癌患者癌組織中Eg5蛋白陽性表達率比較 不同Gleason評分、臨床分期以及有無5年進展、5年生化復(fù)發(fā)的患者前列腺癌組織中Eg5蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中Gleason評分≥7分、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、5年進展、5年生化復(fù)發(fā)的患者Eg5蛋白陽性表達率較高，見表1。

表1 不同臨床病理特征的前列腺癌患者癌組織中Eg5蛋白陽性表達率比較[例（%）]

2.4 Eg5蛋白表達陽性與陰性的前列腺癌患者累計5年進展率及生化復(fù)發(fā)率比較 Eg5蛋白表達陽性患者累計5年進展及生化復(fù)發(fā)率均明顯高于Eg5蛋白表達陰性患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=3.969、4.924，均P＜0.05），見圖 2。

3 討論

圖2 驅(qū)動蛋白5（Eg5）蛋白表達陽性與陰性的前列腺癌患者累計5年進展及5年生化復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線

Eg5在細胞有絲分裂過程中起著重要作用[3]。Eg5是一個對腫瘤有潛在治療作用的靶點基因，體外研究表明抑制Eg5表達可抑制乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌細胞的增殖和遷移[4-6]。由于Eg5抑制劑對ATP不具競爭性抑制，通過與遠離ATP結(jié)合位點結(jié)合而起變構(gòu)抑制劑的作用，不存在與ATP競爭性激酶抑制劑相同的作用機制[7-8]。因此，利用Eg5抑制劑可以明顯增強抑癌基因的作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)Eg5高表達可以增強腫瘤浸潤和腫瘤血管形成，其作用機制可能與Eg5可阻斷CD4+T細胞從而影響腫瘤細胞的周期，進而影響腫瘤的發(fā)生、進展和血管形成有關(guān)[9]。抑制Eg5后，多西紫杉醇的抗癌活性明顯增強，耐藥性降低。研究發(fā)現(xiàn)，Eg5抑制劑對激素難治性前列腺癌以紫杉醇為基礎(chǔ)的化療有明顯療效，與微管靶向藥物相比，可以增強紫杉醇療效且降低其毒性[10]。雖然Eg5基因異常表達對腫瘤的作用機制至今尚未清楚，但有實驗結(jié)果顯示具有E3泛素連接酶活性的Parkin蛋白對Hsp70-JNK-c-Jun信號傳導(dǎo)通路進行負向調(diào)控，Parkin可催化Hsp70泛素化，造成蛋白激酶JNK活性喪失，使c-Jun無法與Eg5啟動子AP1位點結(jié)合，從而下調(diào)Eg5基因表達[11]。因為Eg5在神經(jīng)細胞中不表達，Eg5抑制劑較多西紫杉醇毒副反應(yīng)更小，耐藥性更低[12]。可見，Eg5抑制劑在前列腺癌中有更廣闊的應(yīng)用前景。本研究對Eg5在前列腺癌中的作用方式及作用機制進行研究，具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，Eg5是細胞有絲分裂周期中一個重要的驅(qū)動蛋白，在細胞質(zhì)分裂中紡錘體形成、定位、染色體分離中起重要作用。Liu等[13]采用qPCR法對肝癌組織及癌周正常組織進行Eg5表達檢測與比較，同時對肝癌組織進行免疫組化分析，探討Eg5表達與肝癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示Eg5 mRNA和蛋白在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌周正常組織（P＜0.05），同時Eg5蛋白表達與肝硬化（P=0.038）和肝癌TNM分期（P=0.008）密切相關(guān)；Kaplan-Meier生存曲線分析顯示Eg5蛋白表達與肝硬化（P=0.000）和肝癌TNM分期（P=0.025）密切相關(guān)；Cox回歸模型分析顯示Eg5表達是預(yù)測肝癌患者生存的獨立預(yù)后因素（P=0.001）。陳杰勛等[14]對Eg5在膀胱癌中的表達進行了研究，通過靶向干擾Eg5基因?qū)Π螂装㏕24細胞的生物學功能進行研究，研究發(fā)現(xiàn)靶向干擾Eg5基因后，T24細胞增殖和遷移明顯被抑制，T24細胞凋亡增加。國外相關(guān)文獻報道Eg5在腫瘤中的作用機制與作用于腫瘤細胞遷移和血管生成有關(guān)，其機制可能是參與了免疫調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)翻譯過程；在前列腺癌PC-3細胞中應(yīng)用Eg5抑制劑K858（1,3,4-噻二唑啉類似物、驅(qū)動蛋白Eg5抑制劑）可以抑制PC-3細胞生長，G2/M細胞周期受到阻滯[15]。本研究采用免疫組化染色法檢測了前列腺癌組織與前列腺增生組織中Eg5蛋白表達，結(jié)果顯示前列腺癌組織中Eg5蛋白表達陽性率明顯高于前列腺增生組織；分析不同臨床病理特征的前列腺癌患者癌組織中Eg5蛋白陽性表達率，發(fā)現(xiàn)Gleason評分≥7分、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、5年進展、5年生化復(fù)發(fā)的患者Eg5蛋白陽性表達率較高。進一步繪制Kaplan-Meier曲線，發(fā)現(xiàn)Eg5蛋白表達陽性患者累計5年進展及生化復(fù)發(fā)率均明顯高于Eg5蛋白表達陰性患者，表明Eg5在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

綜上所述，前列腺癌組織中Eg5蛋白呈高表達，其表達與前列腺癌Gleason評分、臨床分期、5年臨床進展和5年生化復(fù)發(fā)有關(guān)。然而，其確切機制尚未闡明，今后可從細胞學水平系統(tǒng)研究Eg5在前列腺癌細胞系中的表達及作用機制，為前列腺癌的治療探尋新途徑。