劉厚先 姚立鋒 江文聰 張棟 胡嘉盛 蔣軍輝 程躍 嚴澤軍

腫瘤靶向性治療是當今醫(yī)學研究的熱點，其基本原理是通過載體使藥物選擇性地在腫瘤組織聚集，增加腫瘤組織中的藥物濃度，同時減少其在非靶向部位的聚集，降低藥物對非靶向部位的毒副反應。前列腺癌（prostatic cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，每年P(guān)Ca的發(fā)病率占男性所有新發(fā)腫瘤的20%[1]。對于早期的局限性病變，可通過根治性前列腺切除術(shù)達到臨床治愈；但是對于中晚期PCa，手術(shù)治療后還要聯(lián)合放療、化療和內(nèi)分泌治療等手段，但這些治療方法存在用藥順應性差、組織選擇性差、毒副反應大、耐藥性較高等一系列問題[2]。因此，亟需找到一種能特異性地抑制PCa生長和轉(zhuǎn)移且很少或幾乎無毒副反應的全新療法。筆者前期研究顯示，前列腺特異性膜抗原（PSMA）適配子a10（PSMA-a10）/磷脂酰肌醇 3- 激酶（PI3K）p110β抑制劑TGX-221納米膠粒具有良好的腫瘤靶向特異性和生物相容性[3-4]。因此，本文就該納米膠粒對PSMA陽性及陰性人PCa細胞株生物學特性的影響以及其對PCa細胞的靶向性及相應機制作進一步探討，為PCa靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI1640（500 ml，180110A）、胰蛋白酶（100 g，170224）購自美國 Sigma公司；FBS（100 ml，180425）購自杭州四季青公司；細胞計數(shù)試劑盒[CCK-8，100 T（1 ml），20180315]、ECL 顯色試劑盒（100 ml，180322）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室（3422，180120）購自美國 Coring公司；聚丙烯乙二醇（PPG，10 g，171027）、TGX-221（2 mg，170907）購自美國Cayman Chemical公司；蛋白質(zhì)提取試劑盒（250 ml，180311）購自美國 Pierce公司；PI3K p110β 兔抗人多克隆抗體（50 μl，171124）購自美國Abcam公司；Bcl-2兔抗人多克隆抗體（0.2 ml，20171029）購自美國Santa Cruz公司；碘化丙啶（10 mg，20170831）、甲基噻唑（MTT）溶液（5 ml，20170805）、細胞凋亡檢查試劑盒（Annexin V/FITC，20 T，171014）、Bcl-2兔抗人多克隆抗體二抗（1 mg/100 mg，20170930）購自武漢谷肽生物公司；PSMA-a10/TGX-221納米膠粒由本課題組合成，合成方法參考文獻[3]。倒置相差顯微鏡（ckx41）購自日本Olympus公司；凝膠成像分析儀（Q550IW）購自德國LEICA公司；酶標儀（Multiskan FC）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng) PSMA陽性的人PCa細胞株LNCaP購自美國典型菌種保藏中心，PSMA陰性的人PCa細胞株P(guān)C-3購自武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心。分別培養(yǎng)于含10%FBS+青霉素100 U/ml+鏈霉素100 mg/L的RPMI1640培養(yǎng)液中，細胞在相對濕度為95%、37℃、5% CO2的環(huán)境中單層生長，每3 d換液傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞抑制率檢測 采用CCK-8法。將LNCaP細胞、PC-3細胞分別按5×103個/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的PSMA-a10/TGX-221 納米膠粒（0、0.1、1.0、2.0、4.0、8.0 和 16.0 μM）和裸露 TGX221（0、0.1、1.0、2.0、4.0、8.0 和 16.0 μM），每孔加入100 μl，每種濃度各設(shè)置3個復孔，對照組加入等體積的PPG，分別干預24 h。每孔再加入10 μl的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測各組細胞在450 nm處的吸光度（A450），細胞抑制率=[1-實驗組A450/對照組A450]×100%，繪制細胞抑制率曲線，計算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50），以 PSMA-a10/TGX221 IC50的1/2為最合適的干預濃度用于后續(xù)實驗。本實驗重復3次。

1.4 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期的LNCaP細胞、PC-3細胞，細胞密度均調(diào)整為1×108個/L，接種于6孔板，待細胞貼壁。2種細胞分別設(shè)置 3個藥物干預組（100 μl/孔），即 PSMA-a10/TGX221組、TGX221組、PPG組；LNCaP細胞中給藥濃度為1.5 μM，而PC-3細胞中給藥濃度為7.0 μM。收集懸浮細胞，4℃預冷的PBS漂洗2次，用預先稀釋好的結(jié)合緩沖液制成濃度為1×106個/ml的單細胞懸液，然后取 100 μl置于 5 ml流式管中，加入 Annexin V/FITC、10 mg/L碘化丙啶各5 μl，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應管中加入稀釋后的結(jié)合緩沖液400 μl，應用流式細胞術(shù)檢測1×104個細胞，再采用Cell Quest軟件分析各組細胞凋亡情況。本實驗重復3次。

1.5 細胞生長指數(shù)檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期的LNCaP細胞、PC-3細胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整為濃度1×103個/ml的單細胞懸液，按 150 μl/孔接種至 96 孔培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁。藥物干預方式及分組同1.4所述。每天各組取3孔，采用MTT比色法進行檢測（參照波長630 nm、檢測波長570 nm），根據(jù)測定的吸光度（A）繪制細胞生長曲線。A值越小，表示細胞生長速度越慢。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室法。藥物干預方式及分組同1.4所述。2種細胞經(jīng)藥物處理24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為2×105個/ml。然后以無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel膠，并鋪到Transwell上室，37℃孵育5 h制作基底膜。上室加入各組細胞500 μl，下室加入含有5 g/ml纖維粘連蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，棄上室液體，用棉簽擦盡上室上層未穿過Matrigel膠的細胞，加入95%甲醇固定30 min并風干，0.1%結(jié)晶紫37℃染色30 min。在100倍光鏡下隨機取5個視野計數(shù)并取均值，即腫瘤細胞侵襲數(shù)，侵襲數(shù)越大表示細胞侵襲能力越強。每個標本檢測3次。

1.7 PI3K p110β、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blot法。藥物干預方式及分組同1.4所述。2種細胞經(jīng)藥物處理24 h后，使用M-PERTM哺乳動物蛋白提取試劑盒提取總蛋白，12 000 g離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)管，置于-80℃凍存。8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為30 μg總蛋白。電泳完畢后，使用電轉(zhuǎn)移儀將樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入PI3K p110β 抗體和 Bcl-2抗體（均為 1∶1 000）、β-actin抗體（1∶2 000）4 ℃過夜，第 2天用 TBST清洗 5 min×3次。洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（工作濃度 1∶1 000），室溫下作用2 h。再次清洗5 min×3次，洗膜，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶的灰度值。使用圖像分析儀測定各條帶的積分吸光度（IA），IA=平均吸光度×面積。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PSMA-a10/TGX-221納米膠粒及TXG221的IC50比較 PSMA-a10/TGX221、TGX221作用于LNCaP細胞24 h 的 IC50分別為（3.1±0.7）、（4.9±1.1）μM，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），細胞抑制率曲線見圖1a；兩者作用于PC-3細胞的IC50均為（13.5±2.3）μM，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），細胞抑制率曲線見圖1b。以PSMA-a10/TGX221 IC50的1/2為最合適的干預濃度，后續(xù)實驗中LNCaP細胞的PSMA-a10/TGX221、TGX221給藥濃度均為 1.5 μM，PC-3 細胞的 PSMA-a10/TGX221、TGX221的給藥濃度均為7.0 μM。

圖1 不同濃度PSMA-a10/TGX221和TGX221作用于LNCaP、PC-3細胞24 h后的細胞抑制率曲線（a：LNCaP細胞；b：PC-3細胞；PSMA-a10為前列腺特異性膜抗原適配子a10）

2.2 不同藥物干預組細胞凋亡率比較 LNCaP細胞中，3組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯高于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組又明顯高于TGX221組（P＜0.05）；PC-3細胞中，3組細胞凋亡率比較，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯高于PPG組（均P＜0.05），但PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表 1。

2.3 不同藥物干預組細胞生長指數(shù)比較 LNCaP細胞中，常規(guī)培養(yǎng)第1～3天3組細胞生長指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；第4～7天TGX221組、PSMA-a10/TGX221組細胞生長指數(shù)均低于PPG組（均P＜0.05）；第 5～7天 PSMA-a10/TGX221組細胞生長指數(shù)明顯低于TGX221組（均P＜0.05）。PC-3細胞中，常規(guī)培養(yǎng)第1～4天3組細胞生長指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；第 5～7天 TGX221組、PSMA-a10/TGX221組細胞生長指數(shù)均低于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表1 不同藥物干預組細胞凋亡率比較（%）

2.4 不同藥物干預組細胞侵襲數(shù)比較 LNCaP細胞中，3組細胞侵襲數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組又明顯低于TGX221組（P＜0.05）；PC-3細胞中，3組細胞侵襲數(shù)比較，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于 PPG組（均P＜0.05），但PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3和圖2（插頁）。

圖2 不同藥物干預后LNCaP細胞、PC-3細胞的侵襲實驗結(jié)果（PPG為聚丙烯乙二醇，PSMA-a10為前列腺特異性膜抗原適配子a10；a：LNCaP 細胞；b：PC-3 細胞；×100）

2.5 不同藥物干預組PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較 LNCaP細胞中，3組PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組又明顯低于TGX221組（均P＜0.05）；PC-3細胞中，3組 PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異亦均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中 TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于PPG組（均P＜0.05），但PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表4和圖3。

3 討論

研究表明，PI3K的亞型p110β在PCa組織和細胞株中超高表達，在雄激素刺激的細胞增殖和雄激素受體介導的基因表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。Bcl-2蛋白是一種“存活”蛋白，在細胞正常增殖的情況下，Bcl-2過度表達能抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，促進細胞生存，從而引起細胞異常積累，增加細胞其他基因突變機會或使突變基因在細胞內(nèi)集聚，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化。另一方面，Bcl-2通過抑制細胞凋亡，增加腫瘤細胞數(shù)，導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。Bcl-2在PCa中高表達，抑制Bcl-2的表達可以抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡，延緩腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。有研究證實，p110β和Bcl-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用，兩者的表達水平密切相關(guān)[7]。由于TGX221難溶于水，當靜脈注射時需要有機溶劑PPG，而PPG有明顯的心臟毒性，使TGX221在臨床上的應用受到了限制[8]。本課題組合成的納米膠粒載體能增加目標分子的水溶性，且不含潛在有害的表面活化劑及輔藥如二甲基亞砜、PPG等，在安全定向運輸抗癌藥方面具有較高的應用價值[9]。

表2 不同藥物干預組細胞生長指數(shù)比較

表3 不同藥物干預組細胞侵襲數(shù)比較（個）

表4 不同藥物干預組PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較

圖3 不同藥物干預后LNCaP細胞、PC-3細胞PI3K p110β及Bcl-2蛋白表達的電泳圖（PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶，PSMA-a10為前列腺特異性膜抗原適配子a10，PPG為聚丙烯乙二醇；a：LNCaP細胞；b：PC-3細胞）

PSMA是一種特異性地表達于前列腺上皮細胞表面（腦、唾液腺和小腸等組織中極少量表達）的抗原，且表達不受激素分泌的影響。在晚期PCa和轉(zhuǎn)移性PCa中，PSMA表達升高尤為明顯。目前PSMA已被用于分子顯像診斷、腫瘤疫苗開發(fā)和靶向藥物傳遞等PCa診斷和治療的靶點[10-12]。尤其是以PSMA為靶點、RNA合成的適配子的成功開發(fā)，使得PSMA的應用前景更加廣闊[13]。核酸配體或適體是一種RNA或DNA分子，此分子通過核酸堿基間的互補配對，折疊出序列特異性的獨特構(gòu)象，然后通過表面電荷和構(gòu)象特征與特定蛋白靶點結(jié)合。適配子是短的單鏈寡核苷酸，沒有免疫原性及毒性，一旦適配子序列確定，即能大批量合成，并可以整合到其他微粒上，使之具備靶向特異性的藥物傳遞特征[14]。PSMA-a10的氨基末端能進行化學鏈接，且不影響其活性。

本研究應用PSMA-a10/TGX221納米膠粒作用于PSMA陽性及陰性的人PCa細胞株（LNCaP細胞、PC-3細胞），并與TGX221、PPG干預結(jié)果進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PSMA陽性的LNCaP細胞株中，與TGX221相比，PSMA-a10/TGX221的IC50更低，誘導細胞凋亡的能力更強，同時也能更好地抑制癌細胞增殖和侵襲。然而，在PSMA陰性的PC-3細胞株中，雖然PSMA-a10/TGX221和TGX221都能抑制腫瘤細胞的不良生物學行為，但這種抑制效應差異不明顯。Western blot檢測結(jié)果顯示，與PPG組、TGX221組相比，PSMA-a10/TGX221組LNCaP細胞中p110β、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低；而在PC-3細胞中，與PPG組相比，PSMA-a10/TGX221組、TGX221組p110β、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，但PSMA-a10/TGX221組和TGX221組比較差異無統(tǒng)計學意義。因為TGX221是一種對p110β具有高度特異性的小分子抑制劑，所以細胞中p110β的表達水平可以間接反映TGX221在細胞中的濃度。以上結(jié)果提示PSMA-a10/TGX221只對PSMA陽性的PCa細胞具有靶向性。

綜上所述，PSMA-a10/TGX221納米膠粒對PSMA陽性的PCa細胞具有靶向特異性，可能通過抑制p110β的活性、降低Bcl-2表達來抑制癌細胞的不良生物學行為。