夏恩慶

（遼寧省錦州市義縣疾病預(yù)防控制中心 遼寧錦州 121100）

1 前言

志賀菌發(fā)現(xiàn)于1896 年，具有高致病性，不僅關(guān)系到國(guó)內(nèi)日常食品和進(jìn)出口食材的安全，更關(guān)系到國(guó)民健康[1]，在這種背景下國(guó)家衛(wèi)計(jì)委適時(shí)修訂并頒布了GB 4789.5—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)》[2]。 隨著我國(guó)食品檢驗(yàn)檢疫試驗(yàn)技術(shù)能力的發(fā)展和提升[3]，志賀菌的檢測(cè)鑒定技術(shù)不再是科學(xué)難題，本次試驗(yàn)為了保證實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果的正確性，確保數(shù)據(jù)的針對(duì)性，做了大量研究。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

材料：志賀菌樣品（山東省出入境檢驗(yàn)檢疫局）；福氏志賀菌（山西安琪微生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；麥康凱（MAC）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂、志賀菌增菌肉湯-新生霉素、志賀菌診斷血清（江天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司）。

儀器：生物安全柜（BSCb1500HA2bX，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；智能厭氧系統(tǒng)（Anoxob mat Mark U，荷蘭MART 微生物公司）。

2.2 方法

準(zhǔn)備樣品：凍干粉樣品1（含有待測(cè)菌志賀菌的可能性），送達(dá)后立即放在2℃～6℃實(shí)驗(yàn)室冰箱中保存。打開樣品包立即（1 min 內(nèi)）加入少量（2～4 mL）磷酸緩沖液稀釋液或者生理鹽水稀釋液，進(jìn)行水化和再融化，合計(jì)40 mL 稀釋液放入無菌瓶中，然后反復(fù)清洗瓶?jī)?nèi)壁，最后回收清洗液，此溶液即待測(cè)樣品原液，整個(gè)過程時(shí)間控制在15～20 min 內(nèi)，具體過程詳見圖1。

圖1 樣品準(zhǔn)備流程圖

3 檢驗(yàn)方法及結(jié)果

依據(jù)GB 4789.5—2012 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)檢測(cè)，同時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)菌株作對(duì)照[4]。

3.1 增菌試驗(yàn)

具體操作方法如下：取原液24 mL 進(jìn)行無菌操作，取滅菌后的226 mL 志賀菌增菌肉湯，振蕩后搖勻，厭氧培養(yǎng)16～20 h，分離并觀察增菌，劃線接種瓊脂平板和志賀菌培養(yǎng)基平板，在（36±1）℃下培養(yǎng)20～24 h，觀察平板菌落形態(tài)，增菌結(jié)果詳見表1。

表1 增菌結(jié)果

3.2 初步生化鑒定

從MAC 瓊脂平板中挑取A 菌和B 菌， 從XLD瓊脂平板中選取C 菌和D 菌[5]，從顯色培養(yǎng)基上選取標(biāo)準(zhǔn)菌株，4 種菌類分別接種于三糖鐵瓊脂、半固體瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，置于（35±1）℃條件下培養(yǎng)20～24 h，分別觀察結(jié)果，詳見表2。

3.3 生化試驗(yàn)及結(jié)果

生化試驗(yàn)用結(jié)果詳見表3。 志賀菌屬、不活潑大腸埃希菌和A～D 菌詳見表4。 通過生化試驗(yàn)結(jié)果比較4 種菌類的生化反應(yīng)，最后結(jié)果顯示均不符合志賀菌屬的生化特征[6]。 需要說明的是，由于部分志賀菌需培養(yǎng)48～72 h，發(fā)育遲緩，靛基質(zhì)可延遲至48 h。

3.4 血清學(xué)鑒定

挑取一環(huán)待測(cè)菌，選取2 個(gè)1 cm×2 cm 的玻片區(qū)域，各放一半待測(cè)菌環(huán)于玻片上，再用無菌接種環(huán)將區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液，在右邊區(qū)域加1 滴志賀菌（4 種多價(jià)）屬診斷血清，在左邊區(qū)域加入1 滴生理鹽水作為對(duì)照。 標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生凝集反應(yīng)，為陽性。將玻片傾斜搖動(dòng)混合觀察A、B、C、D 菌均沒有發(fā)生凝集反應(yīng)，為陰性，詳見表5。

表2 初步生化鑒定結(jié)果

表3 可疑志賀菌菌落的生化試驗(yàn)結(jié)果

表4 志賀菌屬和不活潑大腸埃希菌、A～D 菌的生化特性區(qū)別

表5 血清學(xué)鑒定試驗(yàn)及其附加試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

結(jié)果表明，樣品中未檢出志賀菌。通過此次能力驗(yàn)證，遼寧省錦州市義縣疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力得到了極大地提高，同時(shí)積累了大量的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。 試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了許多不足之處：（1）通過志賀菌檢測(cè)能力驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)棉子糖和靛基質(zhì)生化反應(yīng)不明顯[7]。 試驗(yàn)人員通過與其他實(shí)驗(yàn)室交流，發(fā)現(xiàn)很多地方都發(fā)生過類似現(xiàn)象，因此決定在今后的試驗(yàn)中使用API 試紙條。 API 試紙條雖然價(jià)格昂貴但是其穩(wěn)定、方便，可以進(jìn)行非常標(biāo)準(zhǔn)化的微量鑒定生化管的生化試驗(yàn)，已經(jīng)成為我國(guó)檢測(cè)檢疫界公認(rèn)的微生物生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)用紙和判定依據(jù)。 （2）本次試驗(yàn)配備志賀菌屬多價(jià)血清，雖然沒有血清學(xué)分型，但結(jié)合生化反應(yīng)結(jié)果同時(shí)配齊了各群的多價(jià)血清，更能增加本次試驗(yàn)檢測(cè)的可信度。 （3）本次試驗(yàn)過程中沒有做氧化酶試驗(yàn)和革蘭染色檢查，但是其作為篩査指標(biāo)，可以增加試驗(yàn)結(jié)果的確定性。