殷 政， 中西秀樹， 李子杰， 張慧杰， 藤田盛久*， 高曉冬

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞同為真核生物，二者具有很多相似的結(jié)構(gòu)，將酵母作為研究人類基因的工具具有巨大的優(yōu)勢。 酵母細(xì)胞遺傳背景清晰、培養(yǎng)簡單、基因操作技術(shù)成熟完備，極大降低了哺乳動(dòng)物細(xì)胞各種復(fù)雜的生理過程對蛋白質(zhì)研究的干擾。1987 年，Lee 和Nurse[1]在裂殖酵母中表達(dá)了人類cDNA， 篩選得到能回補(bǔ)裂殖酵母cdc2Δ 缺陷的直系同源蛋白質(zhì)，證明人類細(xì)胞中具有與真菌細(xì)胞周期基因CDC2 相同功能的基因。該實(shí)驗(yàn)表明，利用酵母作為篩選人類基因的工具并對基因功能進(jìn)行研究具有廣泛的應(yīng)用前景及巨大的研究價(jià)值。 此外，實(shí)驗(yàn)室之前的研究[2]將酵母SSO1 的SNARE 區(qū)域替換為人源syntaxin1A， 通過突變分析得到回補(bǔ)產(chǎn)孢的突變體， 發(fā)現(xiàn)218 位谷氨酸殘基為SSO1 產(chǎn)孢功能所必須，并且為篩選與syntaxin1A 作用的蛋白質(zhì)或藥物提供了更為簡便的方法，同時(shí)表明人類的某些基因確實(shí)可以參與產(chǎn)孢過程中的某些環(huán)節(jié)并對其產(chǎn)生影響，并且可以對該基因功能研究和對酵母產(chǎn)孢過程的徹底研究帶來新的進(jìn)展和突破。

釀酒酵母二倍體細(xì)胞在缺乏氮源且存在非發(fā)酵型碳源的條件下， 為了應(yīng)對營養(yǎng)匱乏的不利環(huán)境，營養(yǎng)細(xì)胞停止生長[3]，進(jìn)入減數(shù)分裂過程并產(chǎn)生4 個(gè)單倍體細(xì)胞核[4-5]。 隨后細(xì)胞質(zhì)膜通過高爾基體分泌囊泡（post-Golgi secretory vesicles）重新定位在紡錘體極體 （spindle pole bodies）， 形成前孢子膜（prospore membrane）且不斷延伸，最后前孢子膜閉合形成未成熟的孢子[6-8]。 接著在前孢子膜的表面進(jìn)行孢子壁的組裝，孢子壁組裝完成標(biāo)志著成熟孢子的形成。 孢子壁具有四層結(jié)構(gòu)，從里到外分別是甘露糖層、β-葡聚糖層[9]、殼聚糖層和二酪氨酸層[10]，其中二酪氨酸層作為孢子形成過程的最后一環(huán)，同時(shí)賦予孢子抵御外界環(huán)境壓力的能力[11-13]。 由于二酪氨酸層的存在，孢子在10%的氨水緩沖液下使用UV 照射具有自熒光特性[12]。

釀酒酵母的產(chǎn)孢過程雖然并不存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，但該過程中發(fā)生的很多細(xì)胞活動(dòng)在真核細(xì)胞中都存在保守性。 基因組測序表明，酵母有大量的基因與人類同源[14]，尤其是基本細(xì)胞代謝及分裂有關(guān)的基因存在著高度的基因保守性[15-17]。 人體中重要的蛋白質(zhì)很多都是在酵母中先被發(fā)現(xiàn)其同源物，其中包括有關(guān)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)、信號(hào)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)加工酶等[18]。

本研究建立了一個(gè)篩選特異性抑制釀酒酵母產(chǎn)孢過程的人類基因的方法，使用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的帶有人類基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS426-TEFprgeneX，在二倍體釀酒酵母中表達(dá)單獨(dú)的人類基因。利用二酪氨酸層具有自熒光特性，通過實(shí)驗(yàn)證明孢子的相對熒光強(qiáng)弱可以直接反映產(chǎn)孢率的高低，將相對野生型孢子的熒光強(qiáng)弱作為釀酒酵母產(chǎn)孢過程是否發(fā)生抑制的判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出不影響酵母營養(yǎng)細(xì)胞生長的同時(shí)能特異性抑制產(chǎn)孢過程的人類基因，并進(jìn)行初步的研究。 篩選獲得的候選基因極大可能涉及細(xì)胞營養(yǎng)敏感性、減數(shù)分裂以及膜運(yùn)輸重組這些產(chǎn)孢過程中發(fā)生的細(xì)胞活動(dòng)，同時(shí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中這些相關(guān)的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚，具有極大的研究價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒釀酒酵母AN120 野生型菌株、dit1Δ 缺陷型菌株、AN117-4B 野生型菌株、 大腸桿菌T1 噬菌體抗性菌株、 大腸桿菌DH5α 以及質(zhì)粒相關(guān)信息見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，純化瓊脂粉20 g（固體培養(yǎng)基）， 用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min后使用。

SD-Ura 培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源（YNB） 6.7 g，純化瓊脂粉20 g（固體培養(yǎng)基），用去離子水定容至900 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，使用前分別加入2 g 缺少尿嘧啶（Uracil）的氨基酸混合物與100 mL 已滅菌的20%的葡萄糖溶液。

YPAD 培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨A 20 g，腺嘌呤硫酸鹽30 mg， 用去離子水定容至900 mL，121 ℃高壓滅菌20 min， 使用前加入100 mL 已滅菌的20%的葡萄糖溶液。

YPACe 培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨A 20 g，醋酸鉀20 g，腺嘌呤硫酸鹽30 mg，用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：醋酸鉀20 g，純化瓊脂粉20 g（固體培養(yǎng)基），用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min 后使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pENT221 entry vector 提取在提前滅菌過的10 mL 離心管中加入2 mL 含有Kan 抗性的LB液體培養(yǎng)基， 將保存有人cDNA 文庫的96 孔板從-80 ℃冰箱中取出， 冰上靜置10 min， 每孔吸取10 μL 菌液接入含有Kan 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)。 離心收集所有菌體，使用生工購買的SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并于-20 ℃下保存。

1.2.2 酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建由于作者所在實(shí)驗(yàn)室購買的人cDNA 文庫原始克隆載體無法在釀酒酵母中表達(dá)，所以為了能在釀酒酵母中表達(dá)人類基因用于篩選，本研究構(gòu)建了含有attL1/2 交換序列的pRS426-TEFpr destination vector，與含有人類cDNA和attR1/2 交換序列的原始克隆載體pENT221 entry vector 進(jìn) 行LR 重 組 反 應(yīng)， 在 室 溫 下 將1～7 μL pENT221 entry vector （50 ～150 ng/μL） 與1 μL pRS426-TEFpr destination vector（150 ng/μL）在離心管里混合， 用pH 8.0 的TE Buffer 補(bǔ)齊至8 μL。 將LR Clonase II enzyme mix 從-20 ℃取出，冰上靜置2 min，短暫振蕩LR Clonase II enzyme mix 兩次。 每個(gè)樣品 （除了陰性對照） 加入2 μL LR Clonase II enzyme mix，兩次短暫振蕩混勻，25 ℃反應(yīng)1 h。 反應(yīng)結(jié)束后對每個(gè)反應(yīng)加入1 μL 蛋白酶K 溶液，37 ℃反應(yīng)10 min，轉(zhuǎn)化1～2 μL 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)入DH5α 大腸桿菌宿主，涂布在kan 抗性的LB 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證挑取轉(zhuǎn)化得到的單個(gè)轉(zhuǎn)化子，接入2 mL Kan 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)。 離心收集所有菌體，使用生工購買的SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，根據(jù)購買cDNA 文庫所附帶的對應(yīng)人類基因序列， 找出每個(gè)重組質(zhì)粒內(nèi)具有的BamH I 和EcoR I 限制性酶切位點(diǎn)的位置和數(shù)量。 用10 μL 酶切體系 （1 μL 重組質(zhì)粒，1 μL 10×K Buffer，0.1 μL BamH I，0.1 μL EcoR I，7.8 μL ddH20）在37 ℃反應(yīng)2 h，核酸電泳（120 V，20 min，1 000 maker）驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否正確。

表1 本研究使用的菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2.4 檢測不同產(chǎn)孢率的釀酒酵母在UV 下的熒光強(qiáng)度為了檢測產(chǎn)孢率與UV 照射下熒光強(qiáng)度的關(guān)系，利用單倍體酵母無法產(chǎn)孢的特性，將雙倍體釀酒酵母AN120 與單倍體釀酒酵母AN117-4B 按照不同比例混合，經(jīng)過產(chǎn)孢培養(yǎng)從而形成高低不同的產(chǎn)孢率。 將雙倍體和單倍體野生型釀酒酵母分別接種到5 mL YPAD 液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，通過測定OD660調(diào)整AN120 與AN117-4B 的菌液至相同濃度，按照2∶8，5∶5，8∶2 的比例混合兩種菌液，分別取20 μL 點(diǎn)在YPAD 固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。 將已滅菌的中速定性濾紙貼合在新的YPAD 固體培養(yǎng)基上，影印之前點(diǎn)板培養(yǎng)得到的菌落，使得酵母菌株影印到濾紙上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。 將濾紙以及濾紙上的釀酒酵母菌落一并轉(zhuǎn)移到產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基上， 置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 取出濾紙浸潤在10%的氨水緩沖液中并置于干凈透明的塑料器皿中，使用凝膠成像儀拍攝UV 下的熒光照片，使用Image J 軟件處理圖片并測定熒光強(qiáng)度。 同時(shí)挑取菌落重懸在無菌水中，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)釀酒酵母營養(yǎng)細(xì)胞和孢子球的數(shù)量，計(jì)算產(chǎn)孢率。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母接種釀酒酵母AN120 到5 mL YPAD 培養(yǎng)基（試管）中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)10 h， 轉(zhuǎn)接1 mL 菌液到80 mL 液體YPAD 培養(yǎng)基（250 mL 三角瓶）中，30 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)至OD660在1.2~1.6 之間，使用50 mL 離心管離心收集菌體，無菌水洗一遍，重懸于20 mL 酵母一步轉(zhuǎn)化液 （2 mL、2 mol/L LiAc，2 mL、1 mol/L 二硫蘇糖醇，16 mL 50% PEG）中，振蕩混勻，于96 孔板每孔加入100 μL 菌液和1 μL 重組質(zhì)粒（0.1 ng/μL），45℃孵育30 min。每孔取兩次10 μL 菌液點(diǎn)在SD-Ura固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。

1.2.6 篩選導(dǎo)致產(chǎn)孢缺陷的人類基因挑取轉(zhuǎn)化得到的表達(dá)了人類cDNA 的釀酒酵母單菌落，重懸于10 μL 無菌水，點(diǎn)在SD-Ura 固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。將已滅菌的中速定性濾紙貼合在新的SD-Ura 固體培養(yǎng)基上， 影印之前點(diǎn)板培養(yǎng)得到的菌落，使得表達(dá)了人類基因的酵母影印到濾紙上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將濾紙以及濾紙上的釀酒酵母菌落一并轉(zhuǎn)移到產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基上， 置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分析方法同1.2.4，通過與表達(dá)了空質(zhì)粒pRS426-TEFpr 的野生型釀酒酵母AN120 對比熒光強(qiáng)度，篩選出在釀酒酵母中表達(dá)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度明顯降低的候選人類基因，篩選過程見圖1。

1.2.7 復(fù)篩得到的候選基因?qū)⒑Y選到的人類基因重新轉(zhuǎn)化釀酒酵母AN120，轉(zhuǎn)化過程同1.2.5。 為了檢測初篩得到的候選人類基因在釀酒酵母中表達(dá)是否會(huì)影響營養(yǎng)細(xì)胞的生長，挑取轉(zhuǎn)化得到的表達(dá)了人類基因的釀酒酵母單菌落在SD-Ura 固體平板劃線培養(yǎng)， 將表達(dá)了空質(zhì)粒pRS426-TEFpr 的野生型釀酒酵母AN120 作為對照，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后進(jìn)行對比。同時(shí)為了檢測在釀酒酵母表達(dá)候選人類基因是否穩(wěn)定抑制產(chǎn)孢過程，將轉(zhuǎn)化得到的單菌落接入5 mL SD-Ura 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)16 h， 將100 μL 菌液轉(zhuǎn)接到5 mL YPACe 培養(yǎng)基種，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)20 h， 離心收集菌體，用無菌水洗滌兩次，測量OD660并以此調(diào)整接入產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基中的菌液濃度約為3×107個(gè)/mL，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)24 h 進(jìn)行產(chǎn)孢過程。取10 μL 菌液點(diǎn)在血球計(jì)數(shù)板上， 光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)釀酒酵母營養(yǎng)細(xì)胞和孢子球的數(shù)量，分別統(tǒng)計(jì)三次取平均值計(jì)算產(chǎn)孢率。

圖1 抑制釀酒酵母產(chǎn)孢的人類基因篩選過程Fig. 1 Screening of human genes specifically inhibits sporulation

1.2.8 DPAI 染色釀酒酵母表達(dá)了候選基因?qū)е碌漠a(chǎn)孢過程缺陷，可能是因?yàn)闇p數(shù)分裂過程受到抑制或發(fā)生了孢子壁形成缺陷。 為了判斷產(chǎn)孢過程缺陷的釀酒酵母是否進(jìn)入減數(shù)分裂過程，將篩選得到的候選人類基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，產(chǎn)孢方法同1.2.7。離心收集孢子，用無菌水洗滌2 次，重懸于70%乙醇，30 ℃、30 min 對孢子進(jìn)行固定。用無菌水洗滌兩次， 重懸在500 μL 無菌水中并加入0.5 μL、1 mg/mL DAPI 母液，室溫下避光放置20 min進(jìn)行染色。 用無菌水洗滌兩次，重懸于適量無菌水中， 使用熒光顯微鏡觀察DAPI 染色結(jié)果并統(tǒng)計(jì)進(jìn)入減數(shù)分裂過程的釀酒酵母比例。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選方法的確立

2.1.1 酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建作者所在實(shí)驗(yàn)室前期購買的人類cDNA 文庫的克隆載體無法在酵母中表達(dá)， 因此作者在實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS426-TEFpr 中加入attR1/2 位點(diǎn)和ccdB 篩選標(biāo)記，構(gòu)建得到pRS426-TEFpr destination vector，利用cDNA 文庫中原質(zhì)粒載體pENTR221 中含有的attL1/2 交換位點(diǎn)， 通過LR 重組反應(yīng)， 將原質(zhì)粒載體pENTR221 中的人類基因重組至酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS426-TEFpr 中。轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌菌株，涂布在LB-Amp 固體培養(yǎng)基上， 通過Amp 抗性篩選去除原pENTR221 質(zhì)粒載體， 通過ccdB 基因篩選去除未能完成重組的pRS426-TEFpr destination vector，最后通過酶切驗(yàn)證，得到可以在釀酒酵母內(nèi)表達(dá)人類基因的質(zhì)粒載體pRS426-TEFpr-geneX，并用于之后的篩選。

2.1.2 釀酒酵母產(chǎn)孢率與熒光強(qiáng)度的關(guān)系為了驗(yàn)證釀酒酵母產(chǎn)孢率與二酪氨酸層熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，將相同濃度的雙倍體釀酒酵母AN120 和單倍體釀酒酵母AN117-4B 菌液按照2∶8，5∶5，8∶2 的比例混合并點(diǎn)板，隨后進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，以得到不同的產(chǎn)孢率， 同時(shí)單獨(dú)使用釀酒酵母菌株AN120、AN117-4B、dit1Δ 作為對照， 產(chǎn)孢培養(yǎng)結(jié)束后測定熒光強(qiáng)度并且統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢率。 如圖2 所示，雙倍體釀酒酵母AN120 有著最高的產(chǎn)孢率和熒光強(qiáng)度，無法產(chǎn)孢的單倍體釀酒酵母AN117-4B 與二酪氨酸缺陷型釀酒酵母dit1Δ 有著最低的熒光強(qiáng)度， 混合菌液點(diǎn)板得到的不同產(chǎn)孢率的釀酒酵母熒光強(qiáng)度隨著產(chǎn)孢率的提高熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，釀酒酵母在產(chǎn)孢培養(yǎng)后熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱可以作為判斷釀酒酵母產(chǎn)孢過程中是否發(fā)生缺陷的判斷標(biāo)準(zhǔn)。 作者分析產(chǎn)孢培養(yǎng)后釀酒酵母的熒光強(qiáng)度，通過與野生型釀酒酵母孢子的熒光強(qiáng)度進(jìn)行對比，篩選導(dǎo)致產(chǎn)孢過程發(fā)生缺陷的人類基因作為候選基因，該基因有極大可能抑制釀酒酵母的減數(shù)分裂過程或?qū)е骆咦颖谌毕荨?/p>

圖2 釀酒酵母產(chǎn)孢率與熒光強(qiáng)度關(guān)系Fig. 2 Relate of sporulation rate and fluorescence intensity

2.2 篩選抑制產(chǎn)孢過程的人類基因

本研究將含有人類基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS426-TEFpr-geneX 轉(zhuǎn)入釀酒酵母中， 挑選表達(dá)了人類基因的單個(gè)轉(zhuǎn)化子重懸在無菌水中，在SDUra 固體平板上點(diǎn)板培養(yǎng)， 以轉(zhuǎn)入pRS426-TEFpr空質(zhì)粒的釀酒酵母AN120、AN117-4B、dit1Δ 作為對照。 用帶有濾紙的新的SD-Ura 固體平板進(jìn)行影印，等濾紙上長出菌落后將濾紙轉(zhuǎn)到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取出帶有菌落的濾紙，浸潤在10%氨水緩沖液中，使用凝膠成像儀拍攝UV 照射下的熒光照片。

使用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度， 篩選出熒光強(qiáng)度顯著低于AN120 野生型菌株的轉(zhuǎn)化子，將其表達(dá)的人類基因作為篩選得到的候選基因。 如圖3 所示， 表達(dá)了CXCL10，CDC14A，ACP6 這3 個(gè)基因的釀酒酵母熒光強(qiáng)度明顯低于野生型釀酒酵母AN120。 如圖4（a）所示，同時(shí)挑取表達(dá)了這3 個(gè)基因的菌落用無菌水重懸，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢率。 如圖4（b）所示，統(tǒng)計(jì)得到的產(chǎn)孢率高低順序與熒光強(qiáng)弱順序結(jié)果一致， 其中表達(dá)了ACP6 基因的釀酒酵母同時(shí)具有最低的熒光強(qiáng)度和產(chǎn)孢率，因此這3 個(gè)基因可以作為候選基因。

圖3 UV 照射下的熒光篩選照片F(xiàn)ig. 3 Fluorescence intensity detect by UV

圖4 釀酒酵母表達(dá)候選基因后的相對熒光強(qiáng)度與產(chǎn)孢率Fig. 4 Relative fluorescence intensity and sporulation rate of the candidate gene expressed yeast

2.3 驗(yàn)證候選基因并初步分析

2.3.1 表達(dá)候選基因?qū)︶劸平湍笭I養(yǎng)生長的影響研究希望篩選得到的候選基因在釀酒酵母中表達(dá)只會(huì)特異性的抑制釀酒酵母的產(chǎn)孢過程，對釀酒酵母的營養(yǎng)生長不會(huì)造成抑制，為此將帶有候選基因的質(zhì)粒的重新轉(zhuǎn)化釀酒酵母，挑取轉(zhuǎn)化子在SD-Ura固體平板上劃線培養(yǎng)36 h。 如圖5 所示，表達(dá)了候選基因CXCL10，ACP6 的釀酒酵母與野生型生長狀況相同，對釀酒酵母細(xì)胞的生長沒有抑制作用。 表達(dá)了候選基因CDC14A 的釀酒酵母生長情況相對于野生型受到較弱的抑制， 可能是因?yàn)镃DC14A（cell division cycle gene14 homolog A） 作為細(xì)胞分裂周期蛋白質(zhì)基因，在釀酒酵母中表達(dá)影響了出芽生殖，從而抑制了釀酒酵母細(xì)胞的生長。

圖5 表達(dá)候選基因?qū)︶劸平湍讣?xì)胞生長的影響Fig. 5 Express the candidate gene in yeast cells and detect the effect on yeast growth

2.3.2 檢測釀酒酵母產(chǎn)孢率為了確認(rèn)篩選得到的候選基因?qū)︶劸平湍傅漠a(chǎn)孢過程具有抑制作用，挑選表達(dá)了候選基因的轉(zhuǎn)化子并使用液體培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢，產(chǎn)孢結(jié)束后吸取菌液，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢率。 如圖6 所示，表達(dá)得到的三個(gè)候選基因?qū)︶劸平湍府a(chǎn)孢過程具有抑制作用，產(chǎn)孢率由高到低分別是表達(dá)了CXCL10、CDC14A、ACP6 的釀酒酵母菌株，與之前篩選結(jié)果一致，同時(shí)也證明該方法篩選得到的結(jié)果較為可靠。

2.3.3 DAPI 染色對減數(shù)分裂進(jìn)行檢測二倍體釀酒酵母在缺乏氮源且存在非發(fā)酵型碳源的條件下，營養(yǎng)細(xì)胞會(huì)停止生長并進(jìn)入產(chǎn)孢過程，通過減數(shù)分裂產(chǎn)生孢子。 為了研究表達(dá)了候選基因?qū)е庐a(chǎn)孢缺陷的釀酒酵母在產(chǎn)孢過程中是否進(jìn)入減數(shù)分裂過程，我們將表達(dá)了候選基因的釀酒酵母進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)后使用核酸染料DAPI 染色， 統(tǒng)計(jì)進(jìn)入減數(shù)分裂過程的釀酒酵母比率，并與產(chǎn)孢率進(jìn)行對比。如圖6所示，表達(dá)了CXCL10、CDC14A 基因的釀酒酵母進(jìn)入減數(shù)分裂的比率與產(chǎn)孢率大致相同， 說明表達(dá)CXCL10、CDC14A 基因可能導(dǎo)致釀酒酵母無法進(jìn)入減數(shù)分裂過程。 CXCL10（CXC chemokine ligand 10）干擾素誘導(dǎo)蛋白質(zhì)10 作為趨化因子配體定位于細(xì)胞膜上，其在釀酒酵母中表達(dá)會(huì)抑制產(chǎn)孢過程的原因尚無合理解釋。 表達(dá)了ACP6（Lysophosphatidic acid phosphatase type6）溶血磷脂酸磷酸酶基因的釀酒酵母進(jìn)入減數(shù)分裂比率明顯高于產(chǎn)孢率，證明減數(shù)分裂過程已經(jīng)開始， 之前的研究結(jié)果證明，ACP6定位于線粒體上，通過調(diào)節(jié)線粒體脂類代謝功能從而影響線粒體的功能，表達(dá)該基因可能導(dǎo)致減數(shù)分裂過程中受到抑制或孢子壁形成過程發(fā)生缺陷。

圖6 釀酒酵母表達(dá)候選基因后的產(chǎn)孢率及產(chǎn)孢過程中進(jìn)入減數(shù)分裂的比例Fig. 6 Sporulation rate and meiosis rate of yeast expressed candidate gene

3 結(jié) 語

酵母與同為真核生物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞具有很多相似的結(jié)構(gòu)同時(shí)具有大量的同源基因，酵母產(chǎn)孢過程中發(fā)生的營養(yǎng)敏感性、減數(shù)分裂、囊泡重組等細(xì)胞活動(dòng)同樣會(huì)發(fā)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。 將酵母作為人類基因的篩選工具，以及研究同源基因功能的模式生物具有巨大的研究價(jià)值。 本研究建立的篩選方法利用釀酒酵母對人類cDNA 文庫進(jìn)行篩選，獲得在不影響釀酒酵母營養(yǎng)細(xì)胞生長的同時(shí)特異性抑制酵母產(chǎn)孢過程的人類基因，并通過實(shí)驗(yàn)證明了篩選方法的可靠性。 本研究初次篩選的49 個(gè)人類基因中發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)對產(chǎn)孢過程造成抑制的人類基因，并且抑制發(fā)生在不同的產(chǎn)孢階段，據(jù)此推測應(yīng)該有相當(dāng)數(shù)量的人類基因會(huì)對產(chǎn)孢過程造成影響，因此篩選特異性抑制產(chǎn)孢過程的人類基因具有廣闊的研究前景。 本研究對人類新功能基因的發(fā)現(xiàn)以及將釀酒酵母作為模式生物研究人類基因提供了新的方法和思路，同時(shí)為之后的篩選與研究奠定了基礎(chǔ)。