孟照敏， 耿 燕*， 李 恒， 許泓瑜， 許正宏，2， 趙 輝， 劉 敏， 史勁松

（1. 江南大學 藥學院， 江蘇 無錫2141222；2. 江南大學 生物工程學院 江蘇 無錫214122；3. 青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程研究中心 西藏 拉薩850000）

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是Ⅱ型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關鍵驅動性因素，也是引起一系列代謝疾病如冠心病、高脂血癥、高血壓等共同的病理生理基礎[1]。 其主要表現(xiàn)為靶細胞對胰島素的敏感性和 （或） 反應性降低， 即正常劑量的胰島素（Insulin，Ins） 產生低于正常生物學效應的一種狀態(tài)，主要發(fā)生在肝臟、骨骼肌和脂肪組織，在肝臟中通過抑制糖原分解和糖異生來降低肝臟葡萄糖輸出的能力，在脂肪、骨骼肌組織中表現(xiàn)為攝取葡萄糖并將其利用或存儲的能力下降[2-3]。 其中人體80%~90%的葡萄糖消耗和攝取是通過骨骼肌，是葡萄糖代謝過程中最為重要的組織，目前認為游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）的蓄積是引起骨骼肌IR 的重要原因[4]，因此選用棕櫚酸（Palmitic acid，PA）誘導C2C12 肌細胞建立胰島素抵抗細胞模型作為體外評價手段。

滇 結 香 花（Edgeworthia gardneri（Wall.） Meisn）屬于瑞香科、結香屬植物，俗稱綠蘿花，多分布在西藏、云南等地區(qū)，是西藏地區(qū)的民族特色習用藥材，泡水飲用可治療糖尿病、冠心病、高血壓、高血脂等疾病[5]。 據(jù)國內外文獻報道，從滇結香花中分離出的化合物主要有香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類、有機酸類及甾類等，具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、降血糖及降血脂等功效[6-7]。 目前有研究表明，滇結香花水提物、有機溶劑提取物在體內、 外均具有較好的降血糖活性，因此，利用滇結香花治療糖尿病具有良好的研究價值及應用前景。

作者所在課題組前期發(fā)現(xiàn)滇結香花正己烷提取物在體內、外均能有效改善IR，隨后對其正己烷提取物經(jīng)硅膠柱層析分離得到Fr.1。 以Fr.1 為研究對象，通過PA 誘導C2C12 肌細胞建立胰島素抵抗細胞模型評價其體外降血糖活性， 檢測IR 相關信號通路中基因、蛋白質的表達水平，探究其作用機制， 為滇結香花改善IR 從而治療Ⅱ型糖尿病的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料滇結香花 （Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn）由西藏月王生物科技有限公司提供，經(jīng)鑒定為瑞香科、結香屬植物，標本保藏于中國科學院昆明植物研究所[8]；C2C12 成肌細胞由江南大學金堅教授實驗室饋贈。

1.1.2 試劑高糖DMEM 培養(yǎng)基、 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、馬血清（Horse serum，HS）：購自美國Gibco 公司；胰酶-EDTA 消化液、 青霉素-鏈霉素 （100×）、10%SDS、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）：購自碧云天公司；牛胰島素：購自阿拉?。慌Ｑ灏椎鞍祝˙ovine serum albumin，BSA）、棕櫚酸（PA）、噻唑藍（MTT）：購自美國Sigma 公司；2-（N-7-硝基-2，1，3-苯并惡二唑-4-氨基）-2-脫氧-D-葡萄糖（2-NBDG）：購自美國Invitrogen 公司；葡萄糖氧化酶法測定試劑盒：購自北京普利萊技術有限公 司；Trizol、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）、 細 胞 裂 解 液： 購 自 美 國Roche 公 司；AMPKα、p-AMPKα、ACC、p-ACC、AKT、p-AKT 抗體： 購自Cell Signaling Technology 公司；p-IRs、IRs（Insulin receptors）、p-IRS、IRS-1 （Insulin receptor substrate-1）、Glut4、β-actin 抗 體： 均 購 自 英 國Abcam 公司；其余試劑為分析純，購自國藥集團化學有限公司。

1.1.3 儀器旋轉蒸發(fā)器： 德國Heidolph 公司；Reveleris iES 中低壓柱層析： 美國Grace 公司；Multiskan MK3 型熒光酶標儀： 德國Eppendorf 公司；CO2細胞培養(yǎng)箱： 美國Thermo 公司； 倒置顯微鏡：日本Nikon 公司；RT-PCR 儀、化學發(fā)光成像儀：美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fr.1 的制備干燥滇結香花（500 g）粉碎后，按質量體積比為1∶10 以正己烷提取， 于60 ℃浸提6 h 后過濾得澄清濾液，濾渣再重復浸提兩次，合并濾液，采用旋轉蒸發(fā)去除正己烷后得到滇結香花正己烷提取物15.15 g。利用中低壓柱層析儀分離上述提取物，填料為硅膠，采用正己烷、乙酸乙酯為流動相進行梯度洗脫，流速30 mL/min，檢測波長為254 nm 和320 nm， 在乙酸乙酯洗脫比例為14%時收集洗脫峰，經(jīng)旋轉蒸發(fā)得到Fr.1 5.99 g。

1.2.2 C2C12 細胞培養(yǎng)、 傳代與分化生長培養(yǎng)基： 高糖DMEM 培養(yǎng)基+含10%胎牛血清 （FBS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素）。

分化培養(yǎng)基： 高糖DMEM 培養(yǎng)基+含2%馬血清（HS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素）。

培養(yǎng)條件：置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞傳代：細胞貼壁生長，至80%~90%時進行胰酶消化， 終止消化后加生長培養(yǎng)基懸浮細胞，接種傳代。

細胞分化：細胞貼壁生長，至80%左右，換為分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5~7 d，隔天換液，C2C12 成肌細胞90%分化為肌細胞即多核肌管后進行后續(xù)實驗[8]。

1.2.3 MTT 法檢測PA 作用C2C12 肌細胞后對細胞活力的影響將對數(shù)生長期的C2C12 細胞以5×104個/孔的密度鋪于96 孔板，細胞長至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d，隔天換液，待細胞分化為肌細胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同濃度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L） 及含1 nmol/L Ins 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，每組6 個平行，棄去培養(yǎng)液， 每孔加入含0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基100 μL孵育4 h， 吸去培養(yǎng)基， 加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩使紫色結晶溶解，在570 nm 處測OD值[10]，按照公式（1）進行計算。

1.2.4 葡萄糖氧化酶法檢測PA 誘導C2C12 肌細胞產生IR 對葡萄糖消耗量的影響將對數(shù)生長期的C2C12 細胞以5×104個/孔的密度鋪于96 孔板，細胞長至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d， 隔天換液，待細胞分化為肌細胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同濃度PA （0.25、0.5、0.75、1 mmol/L） 及含1 nmol/L Ins 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h[11]，每組6 個平行， 取上清培養(yǎng)液按照葡萄糖氧化酶法測定試劑盒檢測葡萄糖含量，分為空白管、標準管、樣品管， 分別對應加入5 μL 蒸餾水、5 μL 標準品（10 mmol/L）、5 μL 培養(yǎng)基上清液， 與195 μL 混合試劑（將R1 和R2 按照體積比4∶1 混合）于37 ℃反應20 min，在570 nm 處測OD 值，計算各組葡萄糖消耗量[12]，確定最佳造模濃度。選用最佳造模濃度分別作用細胞8、16、24、32 h，每組6 個平行，取上清培養(yǎng)液檢測不同作用時間各組葡萄糖消耗量，與陽性對照組比較，確定最佳作用時間，按照公式（2）進行計算。

1.2.5 2-NBDG 法檢測PA 誘導C2C12 肌細胞產生IR 對葡萄糖攝取量的影響將對數(shù)生長期的C2C12 細胞以5×104個/孔的密度鋪于96 孔黑色熒光板，細胞長至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d，隔天換液，待細胞分化為肌細胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，換含有不同濃度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）的2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，每組6 個平行，100 nmol/L Ins 作用30 min 后， 每孔加入終濃度為50 μmol/L 的2-NBDG 孵育1 h，DPBS 漂洗細胞三遍后，換2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基于激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm 處測定熒光值[11]，與陽性對照組比較，確定最佳作用濃度。 選用最佳造模濃度作用細胞8、16、24、32 h， 每組6 個平行，測定不同時間的葡萄糖攝取量， 確定最佳作用時間，按照公式（3）進行計算。

1.2.6 MTT 法檢測Fr.1 作用C2C12 肌細胞后對細胞活力的影響將對數(shù)生長期的C2C12 細胞以5×104個/孔的密度鋪于96 孔板，細胞長至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，隔天換液，待細胞分化為肌細胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同質量濃度Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 及含1 nmol/L Ins、0.75 mmol/L PA 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h， 每組6 個平行，檢測方法同1.2.3。

1.2.7 葡萄糖氧化酶法檢測Fr.1 改善C2C12/IR 對葡萄糖消耗的影響培養(yǎng)方法同1.2.6，檢測方法同1.2.4。

1.2.8 2-NBDG 法檢測Fr.1 改善C2C12/IR 對葡萄糖攝取的影響將對數(shù)生長期的細胞以5×104個/孔的密度鋪于96 孔黑色熒光板， 細胞長至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，隔天換液，待細胞分化為肌細胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同質量濃度Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 及含0.75 mmol/L PA 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h， 每組6 個平行，100 nmol/L Ins 作用30 min 后，檢測方法同1.2.5。

1.2.9 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測IR 相關基因的表達采用苯酚抽提法提取細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA， 采用熒光染料FastStart Universal SYBR Green Master （ROX） 進行熒光定量PCR 反應，用2-△△t法[12]對IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα mRNA 的表達水平進行相對定量，采用的引物見表1。

1.2.10 蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測IR相關蛋白質的表達細胞加藥作用后， 預冷的DPBS 漂洗細胞， 每皿加入100 μL 蛋白質裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑）， 在冰上裂解30 min，將細胞刮下收集于1.5 mL 離心管中，12 000g、4 ℃離心10 min， 取蛋白質上清液，BCA 試劑盒測樣品的蛋白質濃度。經(jīng)10%的SDS-PAGE 電泳濕法轉膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉后，4 ℃過夜孵育一抗，常溫孵育二抗1 h，顯色拍照，通過Image J 軟件分析蛋白質條帶， 定量檢測p-IRs、p-IRS-1[10]、Glut4[13]以及AKT[14]、AMPK[13]信號通路蛋白質的表達。

表1 IR 相關基因序列Table 1 Sequences of IR primers

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計實驗結果通過One-Way ANOVA 進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示，p＜0.05，與陽性對照組相比，極顯著水平表示為***p＜0.001，與模型組相比，極顯著水平表示為###p＜0.001[11]。

2 結果與分析

2.1 棕櫚酸（PA）誘導C2C12 肌細胞建立胰島素抵抗細胞模型

組織或細胞產生IR 會降低其對胰島素的敏感性，造成血糖代謝紊亂，所以作者采用檢測葡萄糖消耗量和攝取量來反應IR 的程度。 2-NBDG 是2-脫氧葡萄糖的熒光類似物，通過識別細胞膜上的葡萄糖轉運體進入細胞中，因其無放射性危害，易于檢測且分辨率高，已廣泛用于糖攝取及糖代謝的研究[11]。

如圖1（a）所示，在無細胞毒性（0.25～1 mmol/L）的PA 作用濃度范圍內， 通過檢測細胞葡萄糖消耗量、葡萄糖攝取量兩個指標選擇建立胰島素抵抗細胞模型的最佳作用劑量及作用時間。 如圖1 （B）所示， 與陽性對照組相比， 不同濃度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）作用于C2C12 肌細胞后，0.75 mmol/L PA 組葡萄糖消耗量有極顯著的下調（***p＜0.001）；采用2-NBDG 法檢測不同濃度作用下各組葡萄糖攝取量，如圖1（d）所示，0.75 mmol/L PA 誘導肌細胞后葡萄糖攝取量有顯著的降低（***p＜0.001）。 如圖1（c、e）所示，選擇最佳作用濃度0.75 mmol/L PA與C2C12 肌細胞共同孵育8、16、24、32 h，與陽性對照組相比，0.75 mmol/L PA 作用細胞16 h 后， 其葡萄糖消耗能力及攝取能力大大減弱 （***p＜0.001）；因此，選擇0.75 mmol/L PA 作用C2C12 肌細胞16 h作為最佳建模條件。

2.2 Fr.1 體外降糖活性評價

2.2.1 Fr.1 對C2C12 肌細胞活力的影響將不同質量濃度的Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL）與C2C12肌細胞共孵育16 h，利用MTT 法檢測細胞存活率。如圖2 所示，F(xiàn)r.1 在低于100 μg/mL 作用質量濃度時對C2C12 肌細胞無明顯毒性， 細胞存活率均在90%以上。 Fr.1 與Ins（1 nmol/L）、PA（0.75 mmol/L）共同作用細胞16 h 后， 在100 μg/mL 的Fr.1 作用下，F(xiàn)r.1 對C2C12 肌細胞的生長有12%的抑制率。因此，選擇Fr.1 作用質量濃度在12.5～100 μg/mL 時與C2C12 肌細胞共孵育16 h 進行后續(xù)研究。

2.2.2 Fr.1 對C2C12/IR 葡萄糖消耗量及攝取量的影響通過檢測細胞對葡萄糖的消耗量及攝取量，考察Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL）的降糖活性。 如圖3 （a） 和3 （b） 所示， 與陽性對照組相比，0.75 mmol/L PA 誘導后， 細胞對葡萄糖的消耗量及攝取量顯著降低（***p＜0.001），而在Fr.1 作用C2C12/IR后顯著提高（###p＜0.001），且具有明顯的劑量依賴關系，100 μg/mL Fr.1 與模型組相比，葡萄糖消耗量提高64.9%，葡萄糖攝取量提高60.4%。

圖1 C2C12 胰島素抵抗細胞模型的構建Fig. 1 Establishment of insulin resistance cell model in C2C12 cells

圖2 不同質量濃度的Fr.1 對C2C12 肌細胞存活率的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of Fr.1 on cell viability in C2C12 cells

2.3 Fr.1 改善C2C12 肌細胞IR 作用機制初步探討

骨骼肌是利用葡萄糖的主要外周組織，葡萄糖進入骨骼肌細胞需要細胞膜上的Glut4 直接參與，促進Glut4 轉運從而提高細胞對葡萄糖的攝取主要是通過PI3K/AKT 和蛋白激酶AMPK 兩條信號轉導途徑來實現(xiàn)。 PI3K/AKT 信號傳導通路的阻滯是外周組織IR 發(fā)生最基本的機制之一。胰島素在IRs 的介導下，使IRS-1 的酪氨酸磷酸化，通過酪氨酸位點與PI3K 結合使其下游Akt 磷酸化蛋白增加，促進Glut4 轉運增加其葡萄糖攝取率[15]。AMPK 信號通路在增加骨骼肌對葡萄糖的攝取、增強胰島素敏感性、 增加脂肪酸氧化等方面發(fā)揮重要作用。 激活AMPK 是通過非胰島素途徑促進Glut4 的表達和轉位，從而提高骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，進一步改善IR[17]。乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）被認為是AMPK活化的標志，AMPK 可以直接磷酸化ACC 的Ser79位點，從而激活AMPK 信號通路[16]。 作者通過對IR相關基因及蛋白質水平的檢測，初步探討Fr.1 改善C2C12 肌細胞IR 的作用機制。

2.3.1 Fr.1 對C2C12 肌細胞IR 相關基因表達的影響采用qRT-PCR 技術進一步檢測Fr.1 對PA 誘導C2C12 肌細胞產生IR 相關基因表達水平的影響，結果見圖4。0.75 mmol/L PA 誘導C2C12 肌細胞產生IR 后，IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα 轉錄水平顯著降低（***p＜0.001）。 Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 作用C2C12/IR 后顯著上調基因的表達 （###p＜0.001），且具有劑量相關性。

2.3.2 Fr.1 對C2C12 肌細胞IR 相關蛋白質表達的影響通過Western blot 法檢測在0.75 mmol/L PA的誘導下， 不同質量濃度Fr.1 作用于C2C12/IR 后細 胞 中p-IRs、p-IRS-1、Glut4 及p-AMPKα、p-ACC、p-AKT 的表達。 如圖5 （a） 所示，PA 作用于C2C12 肌細胞后相對于陽性對照組可顯著降低p-IRs、p-IRS-1 蛋白質的表達 （***p＜0.001）， 而50、100 μg/mL 的Fr.1 作用于細胞后，IRs、IRS 磷酸化蛋白質的表達顯著升高（###p＜0.001）；Glut4 是骨骼肌細胞協(xié)助葡萄糖轉運的主要蛋白質，如圖5（b）所示，C2C12/IR 細胞Glut4 的表達顯著下降 （***p＜0.001），與陽性對照組相比下調了49.5%，50 μg/mL Fr.1 作用后使Glut4 的表達上調54.4%， 從而達到改善IR 的效果。

圖3 Fr.1對C2C12/IR葡萄糖消耗及攝取的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of Fr.1 on consumption and uptake of glucose in C2C12/IR

圖4 Fr.1 組分對IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα 基因相對表達量的影響Fig. 4 Effect of Fr.1 on the expression of IRs、IRS-1、Glut4、PI3K and AMPKα mRNA induced by PA

PA 可以通過抑制AMPK、AKT 的信號通路從而產生IR 導致糖尿病。 如圖5（c）所示，產生IR 后AMPKα 磷酸化水平明顯下降（***p＜0.001），50、100 μg/mL 的Fr.1 作用于細胞后，AMPKα、ACC 磷酸化蛋白質的表達水平升高（###p＜0.001），表明Fr.1 可以激活AMPK 信號通路。 如圖5（d）所示，模型組AKT（Ser473）磷酸化水平下降，給予Fr.1 處理后，明顯提高了AKT （Ser473） 磷酸化蛋白質的表達水平（###p＜0.001）， 說明Fr.1 組分可以激活PI3K/AKT胰島素信號通路。 綜上所述，F(xiàn)r.1 通過調控多個PA誘導的信號通路中的蛋白質表達水平改善IR。

3 結 語

張琨[18]、張曉英[19]等發(fā)現(xiàn)滇結香花石油醚、乙酸乙酯提取物具有良好的治療糖尿病腎病的療效。 鐘國躍[20]、Die Gao 等[21]人發(fā)現(xiàn)滇結香花有機溶劑提取物通過激活PPAR 靶點作為治療糖尿病的受體激動劑。耿燕[22]等研究表明，滇結香花提取物對酵母和大鼠來源的α-葡萄糖苷酶均具有較好的體外抑制活性。 Gao 等[23]發(fā)現(xiàn)滇結香花乙酸乙酯提取物通過調節(jié)AMPK 信號通路抑制脂肪細胞的分化， 從而調節(jié)脂質代謝。王賽[24]等通過建立高脂、高糖大鼠動物模型證明滇結香花具有降血糖、降血脂的功效。 綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，滇結香花有機溶劑提取物具有良好的降血糖活性，并且這一發(fā)現(xiàn)多數(shù)是利用體外抑制活性篩選模型，目前對滇結香花利用細胞模型評價藥效及機制來改善IR 的研究甚少， 因此對滇結香花通過改善IR 達到治療Ⅱ型糖尿病的研究是非常必要的。

圖5 Fr.1 對C2C12/IR 細胞p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、p-ACC、p-AKT 蛋白質表達的影響Fig. 5 Effect of Fr.1 on expression of p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、p-ACC、p-AKT in C2C12/IR

作者通過PA 誘導C2C12 肌細胞建立胰島素抵抗細胞模型，運用此模型研究了滇結香花正己烷提取物Fr.1 的體外降糖活性。 結果表明，F(xiàn)r.1 可促進C2C12/IR 對葡萄糖的消耗和提高對葡萄糖的攝取。 通過對IR 相關基因及蛋白質表達的檢測，發(fā)現(xiàn)Fr.1 可顯著增加胰島素與IRs 結合來磷酸化IRS-1的酪氨酸位點，從而激活PI3K，PI3K 又激活蛋白激酶AKT，最終激活葡萄糖轉運體Glut4。 Fr.1 亦可上調p-AMPKα 及p-ACC 蛋白質的表達， 從而促進Glut4 的轉位。Fr.1 通過激活PI3K/AKT 和AMPK 兩條信號通路增強了細胞周圍的葡萄糖轉運水平，起到改善IR 的效果。

后期需要對滇結香花提取物Fr.1 進一步分離純化，分析鑒定Fr.1 中主要活性物質，同時結合體內、體外模型， 進一步研究其治療Ⅱ型糖尿病的作用機制，為民族特色習用藥材治療糖尿病提供理論依據(jù)。