張 森，郭倩妤，湯德元，曾智勇，石遠菊，葉 麗，楊 偉，廖少山

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

2019年4月，廣西省某羊場部分羊發(fā)病，發(fā)病羊表現(xiàn)為精神沉郁、食欲廢絕、喜歡獨處、角落埋頭站立、拉稀、大便出血、病程逐步發(fā)展為食欲廢絕，后期大便帶鮮血，衰弱死亡。為查明該養(yǎng)羊場發(fā)病原因，通過流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理剖檢、細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗及支原體PCR檢測等方法對送檢的病羊進行診斷，確診該發(fā)病羊為羊產(chǎn)氣莢膜梭菌、支原體與大腸桿菌混合感染，現(xiàn)報告如下。

1 發(fā)病情況

廣西某羊場的羊存欄數(shù)超過 1 000只，圈養(yǎng)管理，2019 年 4 月2日出現(xiàn)個別圈羊有發(fā)病現(xiàn)象，發(fā)病特點為起病急、病程短、死亡率高，病程2～4 d。發(fā)病羊主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、拉稀、大便帶血、體溫升高，并伴有咳嗽、流涕和嚴重喘氣、鼻腔流出大量白色泡沫，四肢無力，站立不穩(wěn)，突然倒地死亡。截止到4月4日共有46只羊發(fā)病，死亡39只，發(fā)病羊均表現(xiàn)出相同或相似的癥狀。

2 臨床癥狀

發(fā)病羊表現(xiàn)為精神沉郁，少食，進而食欲廢絕，喜獨處，部分羊體溫升高(40.5～41.5 ℃)，呼吸困難且呈腹式呼吸，呼吸次數(shù)為55 次/min，咳嗽、流涕。聽診心臟有雜音、肺部有腸鳴音。病程后期發(fā)病羊角落埋頭站立，大便帶鮮血，全身肌肉顫抖，四肢無力，逐漸衰弱死亡，病程約2～4 d。該羊場第1個圈37只羊發(fā)病后全部死亡，第2個圈羊正在發(fā)病，初步懷疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌及支原體混合感染。

3 剖檢病理變化

對2只病死羊進行剖檢，發(fā)現(xiàn)口鼻有白色泡沫；心臟腫大，心包有積液，內有纖維素樣物；肺部有大理石樣病變；胸膜有纖維素樣滲出物；肝臟腫大充血；膽囊腫大；腎臟腫大且被膜出血；脾臟腫大，有壞死灶；瘤胃臌氣；腸系膜淋巴結腫大；十二指腸、大腸有出血點和大量的出血現(xiàn)象。

4 實驗室檢驗

4.1 細菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察 無菌操作采集發(fā)病羊的血液、肝臟、肺臟、心臟和淋巴結等病料組織進行細菌分離培養(yǎng)，劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，分別于37 ℃條件下需氧和厭氧培養(yǎng) 24～72 h觀察。結果在需氧血瓊脂培養(yǎng)基中長出大量光滑、隆起、半透明、灰白色菌落；在厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中出現(xiàn)表面光滑、半透明的菌落生長，并出現(xiàn)溶血環(huán)，且有些菌落有雙溶血環(huán)。分別從需氧血瓊脂培養(yǎng)基、厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中挑取單個菌落進行革蘭染色及鏡檢，需氧血瓊脂培養(yǎng)基染色后視野內有兩端鈍圓、革蘭陰性桿菌；厭氧血瓊脂培養(yǎng)基染色后可見視野內有兩端鈍圓、革蘭陽性大桿菌。

4.2 細菌的生化特性鑒定 根據(jù)細菌微量生化鑒定管說明書進行操作，從需氧血瓊脂培養(yǎng)基和厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中挑取純化培養(yǎng)的菌落，接種于細菌微量生化鑒定管進行生化特性鑒定。結果表明：需氧血瓊脂培養(yǎng)基中細菌對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇和山梨醇呈陽性；硫化氫試驗、明膠液化試驗呈陰性；靛基質試驗呈陽性。厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中細菌對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和果糖呈陽性，且產(chǎn)酸產(chǎn)氣，對木糖、甘露醇和山梨醇呈陰性；在含鐵牛乳試驗中出現(xiàn)“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象；硫化氫試驗、明膠液化試驗呈陽性；靛基質試驗呈陰性。結合細菌培養(yǎng)特性及生化試驗結果，判斷分離菌為大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4.3 藥敏試驗 無菌操作從需氧血瓊脂培養(yǎng)基、厭氧血瓊脂培養(yǎng)基用接種環(huán)各挑取1個純化培養(yǎng)的菌落，分別接種于培養(yǎng)基中，涂勻，選用8種常用藥敏紙片貼在培養(yǎng)基中，分別于37 ℃下需氧和厭氧培養(yǎng)24～48 h后觀察結果，并測定抑菌圈直徑，判斷其藥敏性。

需氧血瓊脂培養(yǎng)基中細菌藥敏試驗結果：多西環(huán)素、青霉素抑菌圈直徑<10 mm，屬低敏感；鏈霉素、環(huán)丙沙星抑菌圈直徑為12 mm，屬中度敏感；阿米卡星、土霉素抑菌圈直徑為18 mm，屬高度敏感；頭孢曲松和頭孢拉定的抑菌圈>20 mm，屬極敏感。

厭氧血瓊脂培養(yǎng)基中細菌藥敏試驗結果：青霉素、卡那霉素的抑菌圈直徑<10 mm，屬低敏感；頭孢拉定的抑菌圈直徑為11 mm，屬中度敏感；頭孢曲松的抑菌圈為18 mm，屬高度敏感；土霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星抑菌圈>20 mm，屬極敏感。

4.4 支原體的 PCR 檢測 采集送檢發(fā)病羊的脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結等，分別選取病變較嚴重的部位混合研磨，用液氮反復凍融3次，再用勻漿器磨20 min后收集勻漿，12 000 r/min 離心 10 min，取上清液按支原體 PCR檢測試劑盒說明書方法(購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，MYCO20170703P)進行支原體PCR檢測。PCR 反應液 16 μL，TapDNA 聚合酶 2 μL，模板 DNA 2 μL，總體積 20 μL。反應程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。反應結束后取 5 μL PCR 產(chǎn)物于 1%的 1×TAE 瓊脂糖凝膠中電泳檢測(110V，35 min)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。PCR檢測結果顯示：檢測出602 bp條帶，與預期條帶相符，表明發(fā)病羊存在支原體感染。

5 結果

本次試驗對發(fā)病羊組織樣品、血液、血清進行了細菌培養(yǎng)、生化試驗、藥敏試驗及支原體核酸檢測，檢測結果顯示，細菌培養(yǎng)及生化試驗檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌及大腸桿菌感染，且支原體核酸檢測呈陽性。說明該養(yǎng)殖場羊只發(fā)生產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌及支原體混合感染。

6 防治

針對本羊場目前發(fā)病情況，首先應將發(fā)病及疑似發(fā)病羊進行隔離；對發(fā)病羊肌內注射土霉素0.05～0.1 mL/(kg·bw)，2 次/d，連用3 d；同時使用ATP、葡萄糖注射液靜脈注射輔助治療；對所有健康羊立即接種羊三聯(lián)四防滅活苗及綿羊支原體氫氧化鋁疫苗；對圈舍及周圍水溝使用燒堿嚴格消毒；同時建議羊場合理搭配飼料，加強營養(yǎng)，保障飼料的新鮮，嚴禁飼喂發(fā)霉變質飼料，保證羊腸道正常菌群平衡，提高抵抗力和抗應激能力;對病死羊及其污染物進行無害化處理或深埋焚燒；若有妊娠母羊產(chǎn)仔，產(chǎn)前需加強免疫。

按照以上方法進行處理，3 d后沒有新的死亡病例發(fā)生，7 d后該場羊只基本恢復正常，無明顯臨床癥狀羊出現(xiàn)。