蔣鈺為

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 118000)

乳腺癌現(xiàn)已成為女性最常見的惡性腫瘤，而我國(guó)乳腺癌發(fā)病率與發(fā)病速度均高于發(fā)達(dá)國(guó)家，嚴(yán)重威脅著女性的身體與身心健康[1]。目前，乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式為手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療和中醫(yī)藥治療等[2]。其中，中醫(yī)藥治療乳腺癌以其效果顯著、毒副作用小的特點(diǎn)被廣泛用于臨床和實(shí)驗(yàn)研究。莪術(shù)(Curcuma zedoaroa Ros.c)作為一味傳統(tǒng)中藥材，具有行氣破血、消積止痛等功效[3]，臨床常應(yīng)用于癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛等病癥的治療。研究表明，其主要成分莪術(shù)油具有抗腫瘤、消炎、抗氧化、保肝等作用，對(duì)卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌等均有療效[4]。本研究采用LuminalB型乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象，給予不同濃度的莪術(shù)油，觀察其對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞周期的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)提供；莪術(shù)油注射液購(gòu)自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H20053467)；RPMI-1640(HyClone)；胎牛血清(四季青)；胰蛋白酶；PBS(1×)；二甲基亞砜(DMSO)；75%乙醇；超凈工作臺(tái)(Dl-CT-2N)；倒置顯微鏡(Olympus CKX31)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Allergra X-15R)；酶標(biāo)測(cè)試儀(TECAN sunrise)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD)；高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱(Thermo-371)。

1.2 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶中，放置于含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底90%時(shí)，用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 采用CCK-8檢測(cè)不同濃度的莪術(shù)油對(duì)體外生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞的抑制作用

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后成為細(xì)胞懸液，用含有胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋為約5×104/mL濃度，等量接種于96孔板，每孔100 μL。因?qū)嶒?yàn)需求同時(shí)接種3個(gè)96孔板。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉原培養(yǎng)液，加入濃度分別為100、150、250、300、400、500 μg/mL的莪術(shù)油，每孔100 mL，每組3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置無(wú)藥物的對(duì)照組和完全培養(yǎng)基的空白組，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中24、48、72 h后，棄掉原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL濃度為10%CCK8(RPMI-1640稀釋)，37 ℃孵育1 h。采用酶標(biāo)測(cè)試儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光值(OD值)，計(jì)算每組平均OD值，各藥物濃度組對(duì)細(xì)胞的抑制率=(加藥組平均OD值-空白組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)莪術(shù)油對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的MCF-7細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化成細(xì)胞懸液，用含有胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋至7.5×105/mL濃度，接種于6孔板，每孔2 mL細(xì)胞液。孵育24 h后加入濃度為200、300、400、500 μg/mL的莪術(shù)油，另設(shè)一組無(wú)藥物對(duì)照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用胰酶消化，離心1 000 r，5 min，棄去上清液。采用PBS沖洗后再次離心，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇固定，放置于4 ℃冰箱。24 h后，離心4 ℃，3 000 r，10 min，棄掉上清后用預(yù)冷的PBS沖洗，離心棄上清，避光加入500 μL碘化丙啶溶液，放置培養(yǎng)箱30 min，每10 min搖晃一次。取出后離心棄上清，加入400 μL PBS沖洗后，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1莪術(shù)油對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各濃度莪術(shù)油對(duì)MCF-7細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，根據(jù)各組OD值計(jì)算得出抑制率，500 μg/mL組抑制率最高，且抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)。運(yùn)用回歸方程得出莪術(shù)油用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，加藥后24 h、48 h、72 h的IC50分別為335.42 μg/mL、242.71 μg/mL和155.93 μg/mL(P<0.05)。見表1和圖1。

組別 劑量(μg/mL)抑制率(%)24h48h72h空白組無(wú)細(xì)胞---培養(yǎng)基無(wú)藥物---1007.7±2.4*28.6±3.9**36.6±3.2*15010.4±3.6**32.4±3.6*49.4±3.8**莪術(shù)油25030.3±3.2*42.0±2.3*61.0±3.0*30040.8±1.8*47.2±2.7*69.2±2.9*40050060.1±3.3*78.4±1.8*72.7±1.8*81.7±1.7*82.7±2.8*91.7±1.8*

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.05，*P<0.01。

圖1不同時(shí)間作用下不同濃度莪術(shù)油對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制

2.2不同濃度莪術(shù)油對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞儀對(duì)藥物作用后的MCF-7細(xì)胞以及對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同濃度的莪術(shù)油作用細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期均出現(xiàn)異常。藥物作用24 h后，對(duì)照組細(xì)胞比率G1期為53.3%，S期為36.1%，G2期為10.6%(P<0.05)。與對(duì)照組相比，各藥物組MCF-7細(xì)胞在G1期的比例均提高，濃度為200、300、400、500 μg/mL藥物組G1期細(xì)胞比率分別為68.8%、73.1%、76.9%和81.3%(±)，而相應(yīng)S期和G2期細(xì)胞數(shù)減少，由此說(shuō)明莪術(shù)油是通過(guò)將細(xì)胞阻滯在G1期來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的目的。見圖2。

圖2 不同濃度莪術(shù)油對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

3 討論

遺傳、生育、過(guò)胖等內(nèi)在因素到不良情緒、壓力等外在因素都會(huì)導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，癌癥患者的生存率有了明顯提高，但復(fù)雜的醫(yī)療手段所帶來(lái)的副作用與不良反應(yīng)也不容小視。如今，中醫(yī)藥在治療乳腺癌方面有了顯著的進(jìn)步，合理地運(yùn)用其理念與療法，不僅能改善患者全身癥狀，還能提高其生存質(zhì)量[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，莪術(shù)具有細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制正常細(xì)胞癌變等作用，具有抗腫瘤、抗血栓、抗病毒、抗纖維組織增生等活性[6]，所以在具有腫瘤抑制作用的中草藥中，莪術(shù)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究將不同濃度的莪術(shù)油用于人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，結(jié)果顯示，其對(duì)MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的抑制率越來(lái)越高，細(xì)胞半數(shù)抑制濃度逐漸降低。流式細(xì)胞術(shù)顯示，莪術(shù)油作用后MCF-7細(xì)胞G1期細(xì)胞比例增高，細(xì)胞周期在G1期被明顯阻滯，說(shuō)明莪術(shù)具有開發(fā)出抗癌藥物的潛力。