軒轅玉潔， 呂媛， 趙三軍， 高潤池

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500)

分化誘導(dǎo)因子(Differentiation inducing factors，DIFs)最初是作為多細(xì)胞黏菌盤基網(wǎng)柄菌莖細(xì)胞分化的信號分子被鑒定出來，它們是一類可溶的擴散性的親脂類烷基氯化物，主要由DIF-1及少量的DIF-2、DIF-3、DIF-4和DIF-5組成[1].研究發(fā)現(xiàn)，DIFs通過抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)或促進其分化來發(fā)揮抗腫瘤作用[2-9]，DIFs的抗腫瘤活力存在差異，其中DIF-3具有最強的抗腫瘤活力，此外，研究者們也合成了一些具有抗腫瘤活性的DIF衍生物[10].

目前，研究者對DIFs抗腫瘤機制的研究主要集中在調(diào)控細(xì)胞周期方面，例如，DIFs在腫瘤細(xì)胞中通過快速地增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)揮作用[11]；DIFs直接抑制鈣調(diào)蛋白依賴的cAMP/cGMP磷酸激酶(PDE1)的活性和p-21激活的激酶1(PAK1)的活性[6]；DIF-3通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號降低細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA的表達[9]；DIF-1和DIF-3通過激活GSK-3β來降低細(xì)胞周期蛋白D1的蛋白水平[7,9,12]；DIF-1通過抑制ERK和STAT2信號抑制細(xì)胞的增殖[5,8]；以及DIF-3通過調(diào)節(jié)ROS-依賴的DRP1-調(diào)節(jié)線粒體的分裂，引起細(xì)胞的自噬[13]等等.然而，DIFs抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機制卻并不清楚.

腫瘤細(xì)胞不受控制地快速生長導(dǎo)致其表面電荷發(fā)生明顯改變，從而在腫瘤增生區(qū)與周圍正常組織間存在電壓梯度，由此產(chǎn)生穩(wěn)定的直流電場，即腫瘤生物電場，且腫瘤組織的電流方向與周圍正常組織相反[14].腫瘤生物電場不僅具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號分子表達激活的作用，還能控制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[15-17]，腫瘤細(xì)胞在生物電場中發(fā)生的定向遷移現(xiàn)象被稱為腫瘤細(xì)胞的趨電性，研究結(jié)果顯示腫瘤生物電場很可能與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系.因此，本研究通過探討DIF-3對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10趨電性的影響，試圖從腫瘤生物電場方面揭示DIF-3抗腫瘤的可能機制，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞株B16-F10購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫.

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶及CO2非依賴性培養(yǎng)基均購自Gibco公司；PBS緩沖液購自Athena Es公司；DIF-1、DIF-3、Br-DIF-1和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；青霉素/鏈霉素溶液購自上海源培生物科技股份有限公司.

1.2 B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)

B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃且5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3 MTT法檢測 B16-F10細(xì)胞的增殖

取對數(shù)生長期的B16-F10細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×104個/mL，按每孔104個接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁12 h后，分別加入不同濃度(0、10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L)的DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1，每個濃度做6個重復(fù)，并在特定的時間(24 h和48 h)用MTT法檢測細(xì)胞量.按以下公式計算B16-F10細(xì)胞的存活比率：

存活比率(%)=

實驗組OD值/對照組OD值×100%

1.4 劃痕實驗檢測DIF-3對B16-F10細(xì)胞遷移的影響

在12孔板中培養(yǎng)并進行劃痕實驗，更換培養(yǎng)基以便除去懸浮細(xì)胞，拍照記錄0 h時的劃痕情況(記為scratch0).分別加入不同濃度(0、10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L)的DIF-3，每個濃度3個重復(fù)，在37 ℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，拍照記錄劃痕的情況(記為scratcht)，并用愈合率來表示細(xì)胞的遷移情況，具體計算公式如下：

劃痕愈合率=(1-scratcht/scratch0)×100%.

1.5 趨電性實驗、圖像采集和數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 DIFs以濃度依賴方式抑制B16-F10細(xì)胞的增殖

為探究分化誘導(dǎo)因子或衍生物對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的抗增殖效果，實驗選用DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1三種分化誘導(dǎo)因子(或衍生物)分別處理細(xì)胞，并通過MTT法檢測不同濃度藥物處理后的細(xì)胞存活比率，從而反映藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用.結(jié)果如表1所示，DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1都可以顯著降低細(xì)胞的存活比率，且隨著濃度增加和時間的延長，藥物對細(xì)胞的作用越強,其中DIF-3的抑制效果最為明顯.

表1 不同種類分化誘導(dǎo)因子對B16-F10增殖的影響

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 DIF-3以濃度依賴方式抑制B16-F10細(xì)胞的遷移

基于DIF-3對B16-F10細(xì)胞增殖具有顯著抑制效果，因此實驗進一步選用DIF-3來研究分化誘導(dǎo)因子對B16-F10細(xì)胞遷移的影響.通過比較不同濃度的DIF-3(10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L，以不加藥物為空白對照)處理后的劃痕面積變化情況來反映藥物對細(xì)胞遷移的影響.結(jié)果如圖1A所示，與空白對照相比，10 μmoL/L的DIF-3處理24 h就可以顯著抑制細(xì)胞的遷移，而且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞遷移距離也逐漸降低，說明DIF-3不僅對B16-F10細(xì)胞的遷移有抑制作用，而且還以濃度依賴的方式發(fā)揮作用.

A.劃痕實驗觀察圖 B.劃痕愈合率統(tǒng)計

2.3 DIF-3對B16-F10細(xì)胞趨電性的影響

在機體中腫瘤細(xì)胞的侵襲以集體遷移為主[20].為探究DIF-3對B16-F10細(xì)胞趨電性的影響，分別對單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞進行研究.實驗都用20 μmoL/L DIF-3預(yù)處理單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞，隨后施加2 V/cm的直流電場，實時錄像并分別對單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞的趨電性運動情況進行分析.結(jié)果如圖2(單細(xì)胞)、圖3(成片細(xì)胞)和圖4(單層細(xì)胞)所示，在直流電場刺激下，單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞都具有明顯的朝向陰極的趨電性運動；用DIF-3處理細(xì)胞后，單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞在直流電場中仍然朝向陰極運動，但是運動速度降低.

A.單細(xì)胞趨電軌跡圖;B.趨電性指標(biāo)統(tǒng)計圖

A.成片細(xì)胞趨電軌跡圖;B.趨電性指標(biāo)統(tǒng)計圖

圖420μmoL/LDIF-3對B16-F10單層細(xì)胞趨電性遷移的影響

Fig.4Effectof20μmoL/LDIF-3onthemonolayercellsgalvanotaxisofB16-F10

3 結(jié) 語

研究結(jié)果顯示，DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1都可以抑制黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的增殖，且以DIF-3的抑制效果最好，這與之前報道的結(jié)果一致[2,4,7].DIF-3處理后單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞在電場中的遷移方向都沒有受到很大影響，但運動速度都不同程度地減小了,暗示DIFs的抗腫瘤機制有可能是通過腫瘤生物電場發(fā)生作用的，后期的研究將通過測定小鼠移植瘤周圍腫瘤生物電場的變化情況以及腫瘤發(fā)生發(fā)展情況來探討DIFs與腫瘤生物電場之間的具體關(guān)系.