賀旭 ，葛金文，宋禎彥，余婧萍

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208；2益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，益陽(yáng) 413000）

鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sp8 是鋅指轉(zhuǎn)錄家族的重要成員，主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和四肢[1,2]。作為一種重要的鋅指轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)蛋白，Sp8可調(diào)控嚙齒類動(dòng)物嗅球中間神經(jīng)元的產(chǎn)生，而基因消融Sp8后嚴(yán)重減少生長(zhǎng)激素抑制素中間神經(jīng)元的表達(dá)[3]。我們先前研究表明Sp8在大鼠側(cè)腦室室管膜區(qū)（SVZ）有廣泛表達(dá)且可調(diào)控該區(qū)的神經(jīng)發(fā)生及星形膠質(zhì)干細(xì)胞分化[4]。SVZ區(qū)產(chǎn)生的神經(jīng)祖細(xì)胞沿吻側(cè)遷移流以鏈狀方式遷移到嗅球，在嗅球顆粒細(xì)胞層（GCL）和突觸球?qū)樱℅L）分化為中間神經(jīng)元。本文擬進(jìn)一步探討Sp8在成年大鼠嗅球各層的分布特點(diǎn)及與嗅球內(nèi)的中間神經(jīng)元的關(guān)系。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇4月齡健康雄性SD大鼠4只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫為（23±1）℃，相對(duì)濕度為55% 的動(dòng)物房。整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序都通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

珊頓低溫冰凍切片機(jī)（Shan Don 公司）、Olympus BX67熒光顯微鏡（奧林巴斯）、鼠抗Sp8 抗體（Santa Cruz公司）、兔抗calbindin（CB）抗體（Sigma公司）、兔抗parvalbumin（PV）抗體（Sigma公司）、兔抗tyrosine hydroxylase（TH）抗體（Sigma公司）。

3 組織學(xué)處理

給予SD大鼠麻醉，灌注取出腦組織。4℃后固定過(guò)夜，梯度沉糖。恒低溫冰凍切片機(jī)下采用鄰切法進(jìn)行冠狀位切片，切片厚度為6μm。

4 免疫熒光單標(biāo)染色法

選取6μm切片。PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；5%驢血清+0.1%TritonX-100磷酸鹽緩沖液室溫孵育2h；將腦片與鼠抗Sp8 （1:1000）孵育，4℃冰箱過(guò)夜；室溫下復(fù)溫30min，PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；Alexa Fluor 488偶聯(lián)驢抗鼠IgG （1:200）孵育2h；PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；雙苯酰亞胺（1:5000）染核10min；PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；貼片，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并選取嗅球部位拍照。

5 免疫熒光雙標(biāo)染色法

選取6μm切片。PBS-T溶液輕微漂洗3次×5 min/次；5%驢血清+0.1%TritonX-100磷酸鹽緩沖液室溫孵育2h；然后將腦片與以下3組抗體孵育：鼠抗Sp8（1:1000）與兔抗PV（1:1000）；鼠抗Sp8（1:1000） 與兔抗CB（1:1000）；鼠抗Sp8（1:1000）與兔抗TH（1:1000），置于 4℃冰箱過(guò)夜；室溫下復(fù)溫30 min，PBS-T溶液輕微漂洗3次，每次5 min；Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯(lián)驢抗鼠、驢抗兔IgG（1:200）室溫孵育2h；接下來(lái)實(shí)驗(yàn)步驟同免疫熒光單標(biāo)染色法。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫熒光染色片子在目鏡×20下拍照，每套片子取相同的部位進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。細(xì)胞比率=（Sp8與中間神經(jīng)元的共表達(dá)細(xì)胞/中間神經(jīng)元）×100%。

結(jié) 果

1 Sp8廣泛表達(dá)于嗅球各層

Sp8免疫陽(yáng)性細(xì)胞在成年大鼠嗅球的嗅神經(jīng)層（ONL）、突觸球?qū)樱℅L）、外叢狀層（EPL）、僧帽細(xì)胞層（MCL）、內(nèi)叢狀層（IPL）和顆粒細(xì)胞層（GCL）6層中均有分布，陽(yáng)性反應(yīng)位于細(xì)胞核。其中，主要分布在MCL、IPL和GCL層，而EPL層的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少（圖1）。

2 Sp8表達(dá)于嗅球大多數(shù)中間神經(jīng)元

PV和CB陽(yáng)性中間神經(jīng)元主要分布于嗅球的EPL層（圖2和圖4），而TH陽(yáng)性中間神經(jīng)元主要分布于GL層（圖3）。上述3種類型的中間神經(jīng)元胞體染色均明顯。此外，CB細(xì)胞之間還可見(jiàn)到有許多突起并相互聯(lián)系。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，EPL層Sp8/PV細(xì)胞與PV細(xì)胞的比值為（90.6±7.2）%；EPL層Sp8/CB細(xì)胞與CB細(xì)胞的比值為（95.4±5.3）%；GL層Sp8/TH細(xì)胞與TH細(xì)胞的比值為（93.8±9.7）%。

討 論

嗅覺(jué)系統(tǒng)是感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，表現(xiàn)為動(dòng)物依靠嗅覺(jué)識(shí)別同類、尋找食物、躲避天敵及占有領(lǐng)地，人類則通過(guò)嗅覺(jué)分辨各種氣味。主嗅球（main olfactory bulb, MOB）是嗅覺(jué)系統(tǒng)的重要組成部分，為同心排列的層狀結(jié)構(gòu)，在嗅覺(jué)系統(tǒng)里充當(dāng)?shù)谝患?jí)中轉(zhuǎn)站的作用。從內(nèi)到外嗅球依次可分為6層：顆粒細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、僧帽細(xì)胞層、外叢狀層、突觸球?qū)雍托嵘窠?jīng)層[5]。

嗅球神經(jīng)元分為投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元兩大類，中間神經(jīng)元的數(shù)量大約為投射神經(jīng)元的100倍。嗅球中間神經(jīng)元的產(chǎn)生需要神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化，以及新生的中間神經(jīng)元的成熟及遷移。在側(cè)腦室室管膜區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞及其直系子代中通過(guò)特定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控神經(jīng)元的分化，新分化的神經(jīng)祖細(xì)胞通過(guò)吻側(cè)遷移流遷移到嗅球且被分化為球周細(xì)胞和顆粒細(xì)胞。因此了解嗅球神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控機(jī)制有助于我們理解嗅球的神經(jīng)發(fā)育[6]。

研究顯示，鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sp8可與側(cè)腦室室管膜區(qū)（SVZ）、海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層（SGZ）及大腦皮層淺層皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞共表達(dá)，因此，Sp8被建議用來(lái)標(biāo)記神經(jīng)祖細(xì)胞[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sp8主要分布在顆粒細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和僧帽細(xì)胞層，而在嗅球的嗅神經(jīng)層、突觸球?qū)雍屯鈪矤顚臃植驾^少。Sp8對(duì)嗅球中間神經(jīng)元的存活、遷移和分子分化起著重要作用，主要表現(xiàn)為敲除Sp8后嗅球內(nèi)鈣網(wǎng)膜蛋白和GABA等中間神經(jīng)元數(shù)量顯著減少[8]。此外，SP8還能與Sp9協(xié)調(diào)管理嗅球中間神經(jīng)元的發(fā)育[9]。因此，我們接著探討Sp8與中間神經(jīng)元的共表達(dá)情況。根據(jù)所表達(dá)的化學(xué)標(biāo)記物的不同，嗅球內(nèi)的中間神經(jīng)元可分為小清蛋白（PV）細(xì)胞、鈣結(jié)合蛋白（CB）細(xì)胞和酪氨酸羥化酶（TH）細(xì)胞等[10]。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，絕大部分中間神經(jīng)元都表達(dá)了Sp8，這與Li等[11]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 Sp8免疫陽(yáng)性細(xì)胞在成年大鼠嗅球的表達(dá)。ONL，嗅神經(jīng)層；GL，突觸球?qū)樱籈PL，外叢狀層；MCL，僧帽細(xì)胞層； IPL，內(nèi)從狀層；GCL，顆粒細(xì)胞層；標(biāo)尺，100μmFig. 1 Expression of Sp8-positive cells in olfactory bulb of the adult rats. ONL, olfactory nerve layer; GL, glomerular layer; EPL, external plexiform layer; MCL, mitral cell layer; IPL, internal plexiform layer; GCL, granule cell layer; scale bar, 100μm

圖2 成年大鼠嗅球Sp8與PV共表達(dá)的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)。A，Sp8/PV在嗅球EPL層的分布；B，A中a-c高倍圖像；a。-c。， Sp8陽(yáng)性細(xì)胞；a’-c’，PV 陽(yáng)性細(xì)胞；a’’-c’’，a。-c。與 a’-c’融合圖像；箭頭示雙標(biāo)記細(xì)胞；標(biāo)尺，100μmFig. 2 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with PV in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/PV cells in the olfactory bulb EPL layer; B, high magni fication images of a-c in A; a。-c。, Sp8 immunopositive cells; a’-c’, PV immunopositive cells;a’’-c’’ are merged images of a。 -c。and a’-c’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

圖3 成年大鼠嗅球Sp8與TH共表達(dá)的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)。A，Sp8/TH在嗅球GL層的分布；B，A中d-f的局部放大圖；d。-f。，Sp8陽(yáng)性細(xì)胞；d’-f’，TH 陽(yáng)性細(xì)胞；d’’-f’’，d。-f。與 d’-f’的融合圖像；箭頭示雙標(biāo)記細(xì)胞；標(biāo)尺，100μmFig. 3 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with TH in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/TH cells in the olfactory bulb GL layer; B, local high magni fication images of d-f in A; d。-f。, Sp8 immunopositive cells; d’-f’, TH immunopositive cells; d’’-f’’, merged images of d。-f。and d’-f’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

圖4 成年大鼠嗅球Sp8與CB共表達(dá)的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)。A，Sp8/CB在嗅球EPL層的分布；B，A中g(shù)-i為局部放大圖；g。-i。，Sp8陽(yáng)性細(xì)胞；g’-i’，CB 陽(yáng)性細(xì)胞；g’’-i’’ ，g。-i。與 g’-i’的融合圖像；箭頭示雙標(biāo)記細(xì)胞；標(biāo)尺，100μmFig. 4 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with CB in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/CB cells in the olfactory bulb EPL layer; B, high magni fication images of g-i in A; g。-i。, Sp8 immunopositive cells; g’-i’, CB immunopositive cells;g’’-i’’, merged images of g’-i。and g’-i’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

綜上所述，鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sp8在成年SD大鼠的嗅球各層均有分布，且在其大多數(shù)中間神經(jīng)元表達(dá)，可能參與了促進(jìn)嗅球中間神經(jīng)元的發(fā)育分化過(guò)程。