白欣潔，劉莎莎，喬立東，王功民

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 房山 102442 ； 2.中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局，北京 朝陽 100125)

褪黑素是由哺乳動物下丘腦松果體產(chǎn)生的一種吲哚胺類激素，化學(xué)成分是N-乙酰-5甲氧基色胺，1957年被耶魯大學(xué)的皮膚科專家首次分離并檢測了其分子結(jié)構(gòu)，此后褪黑素成為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。褪黑素是介導(dǎo)光照影響動物繁殖活動的重要調(diào)節(jié)因子，合成和分泌呈晝低夜高的節(jié)律性變化。光照可以通過調(diào)控褪黑素的分泌影響動物的繁殖活動。對于季節(jié)性繁殖動物，日照時長決定著褪黑素表現(xiàn)出抑制或促進(jìn)繁殖性能的活動[1]。在高緯度地區(qū)，光周期是決定繁殖季節(jié)開始和持續(xù)時間長短的主要環(huán)境因素。松果體通過改變夜間褪黑素分泌的持續(xù)時間控制繁殖活動，近年來隨著探索的深入，發(fā)現(xiàn)褪黑素在動物性成熟、激素分泌、配子形成、胚胎早期發(fā)育、妊娠以及分娩過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。在現(xiàn)代化畜牧養(yǎng)殖中，精子的冷凍保存、卵母細(xì)胞的體外成熟以及胚胎的體外發(fā)育等技術(shù)是人工繁育的基礎(chǔ)，提高精子冷凍后的活力，改善體內(nèi)外卵母細(xì)胞的成熟和胚胎發(fā)育的質(zhì)量對于動物生產(chǎn)有著重要意義。隨著人工繁育技術(shù)的提升，更加凸顯了雄性動物在動物繁殖生產(chǎn)的作用，本文主要就褪黑素的相關(guān)特性以及其在雄性動物繁殖中的最新研究進(jìn)展展開綜述，為深入挖掘褪黑素對哺乳動物繁殖活動的調(diào)控功能，優(yōu)化體外胚胎生產(chǎn)體系，提高畜牧生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益奠定理論基礎(chǔ)，也為人類生殖健康提供理論參考依據(jù)。

1 褪黑素概念

1.1 褪黑素分子特性 褪黑素(Melatonin，MEL)是一種吲哚胺類激素，其合成受光照的調(diào)控，具有明顯的晝夜節(jié)律性。松果體細(xì)胞從血液中攝取色氨酸后，在羥化酶和脫羧酶的作用下生成血清素。血清素在N-乙?；D(zhuǎn)移酶(NAT)作用下生成N-乙酰血清素。然后在甲基酶作用下生成褪黑素，此過程需要羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(HIOMT)參與。HIOMT調(diào)節(jié)褪黑素的周期性分泌，提高HIOMT的活性后，松果體褪黑素合成顯著升高。褪黑素的分子量為232.27，具有高親脂性、易溶于有機(jī)溶劑、受熱易破壞等特性。

大多數(shù)生物活性的化學(xué)信號物質(zhì)在體內(nèi)都是和特異性受體相互作用，改變細(xì)胞的生理生化功能而產(chǎn)生效應(yīng)。褪黑素調(diào)控細(xì)胞機(jī)能，一方面是通過其受體途徑，另一方面可以直接穿透細(xì)胞膜，通過調(diào)控細(xì)胞的抗氧化水平而發(fā)揮作用。

1.2 褪黑素與受體 褪黑素及其受體分布于視網(wǎng)膜、胃腸道、卵巢及睪丸等器官[4]，但褪黑素僅在松果體和視網(wǎng)膜上呈周期性分泌。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素有兩類受體，膜受體和核受體。褪黑激素膜受體包括MT1、MT2以及MT3；另一類是維甲酸Z受體(RZR)和相關(guān)受體(ROR)，屬于孤兒受體亞家族成員。MT3主要存在于非哺乳動物體內(nèi)，哺乳動物僅在倉鼠的肝臟和腎臟中發(fā)現(xiàn)。在體內(nèi)褪黑素通過結(jié)合G偶聯(lián)蛋白受體MT1、MT2及核受體RZR/ROR發(fā)揮作用[5]。其中，MT1、MT2受體能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate Cyclase,AC)活性，不同的是MT1受體可以激活蛋白激酶 C-β，而MT2受體抑制鳥苷酸環(huán)化酶的活性，并刺激蛋白激酶C[6]。MT1受體屬于高親和力受體，能調(diào)節(jié)離子流動和離子通道。MT2受體屬于低親和力受體，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[7]。

1.3 褪黑素與機(jī)體抗氧化能力 研究表明，褪黑素具有高效的抗氧化作用，在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生理功能。由于同時具有親水性和親脂性，褪黑素可以輕松通過所有的生理障礙，保護(hù)細(xì)胞核和線粒體中的DNA、脂肪酸和蛋白質(zhì)免受自由基的損害[8]，減少細(xì)胞的氧化損傷[9]。

2 褪黑素在雄性動物繁殖中的生物學(xué)功能

2.1 褪黑素對雄性動物生殖細(xì)胞的影響 雄性生殖細(xì)胞在繁殖過程中擁有越來越高的地位。那么提高精子的有效性能，在繁殖中起著至關(guān)重要的作用。

2.1.1 褪黑素增加精子的穩(wěn)定性 有人在公羊精子中發(fā)現(xiàn)褪黑素及其受體MT1和MT2的表達(dá)，說明褪黑素可能對精子細(xì)胞具有直接作用。褪黑素能夠降低精子畸形率、脂質(zhì)過氧化程度，提高精子穩(wěn)定性，可在小鼠精子連續(xù)或間歇性缺氧的情況下，提高小鼠精子DNA的穩(wěn)定性[10]。褪黑素除了通過受體發(fā)揮作用，其還可直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體的抗氧化水平，減少大鼠睪丸缺血再灌注模型中附睪精子的質(zhì)量受損[11]。在精原干細(xì)胞移植到無精癥小鼠睪丸的過程中，褪黑素可以有效地減少活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)和脂質(zhì)過氧化物，從而提高移植效率并改善睪丸組織的結(jié)構(gòu)特性[12]。

2.1.2 褪黑素促進(jìn)精子活性 對于體外公豬精子，褪黑素可以不依賴抗氧化特性影響其活力和核蛋白的穩(wěn)定性[13]。Miguel等人確定了褪黑素可以通過一氧化氮合酶調(diào)節(jié)作用，增加了公羊精子獲能的作用[14]。褪黑素通過MT1受體抑制細(xì)胞凋亡和提高受精能力來提高公牛精子的受精能力[15]。在人類精子的研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑素與精子活力顯著相關(guān)，在不孕患者的精漿中褪黑素水平顯著下降[16]。將褪黑素加入到精液稀釋液中，能夠增加了運(yùn)動精子和快速運(yùn)動精子的百分比[17]。

2.1.3 褪黑素有效提高冷凍精子的存活率 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，凍精作為有效提高繁育水平、降低養(yǎng)殖成本、方便保存及運(yùn)輸?shù)榷嘀貎?yōu)勢，被廣泛應(yīng)用在動物繁育上，但是如何降低精子冷凍的過程中損傷，是迫切需要解決的問題。Ashrafi 等的研究證明，可以通過在牛精子冷凍液中添加褪黑素抵消牛精子在凍融過程中產(chǎn)生的不良影響，加入褪黑素后，提高了總的抗氧化能力和抗氧化酶活性，從而保護(hù)了冷凍精子[18]。外源添加褪黑激素對解凍后公雞精子質(zhì)量，同樣起到了有效的冷凍保護(hù)作用[19]。褪黑素能夠刺激超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-過氧化物酶和過氧化氫酶等參與清除 ROS 代謝的幾種酶活性，從而維持細(xì)胞膜的流動性[18]。在染色、分選及冷凍等過程中，褪黑素能夠保護(hù)水牛精子免受丙二醇的損傷，并在凍融過程后提高精子質(zhì)量[20]。在人類精子冷凍保存期間，褪黑素也可以通過PI3K / AKT信號傳導(dǎo)途徑有效的保護(hù)精子免受冷凍損傷[21]。

2.1.4 合適的外源褪黑素添加濃度能夠有效改善精子質(zhì)量 褪黑素對精子的作用與其外源添加的濃度息息相關(guān)。Martín-Hidalgo等觀察1 μmol/L褪黑素雖然可以提高頂體完整的活細(xì)胞的比例，但是不能改善17 ℃儲存7 d的豬精液的功能[22]。微摩爾濃度的褪黑素能夠通過降低ROS和環(huán)磷腺苷(cAMP)水平，調(diào)控由cAMP升高劑誘導(dǎo)的公羊精子獲能；在較低濃度下，褪黑素改變運(yùn)動型精子亞群[23]。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究褪黑素在人工授精體系中控制精子獲能方面提供參考依據(jù)。對于人類精液，添加2 mmol/L褪黑素后發(fā)現(xiàn)運(yùn)動精子、前向性運(yùn)動精子及快速運(yùn)動精子比例增高，精子死亡數(shù)量降低，內(nèi)源性一氧化氮(NO)明顯降低，但ROS水平無顯著變化，表明2 mmol/L褪黑素可以直接或間接的清除過量NO，從而起到保護(hù)精子的作用。由此可以推斷不同物種對褪黑素的敏感程度不同，導(dǎo)致發(fā)揮有益作用的褪黑素濃度有所差異。

2.2 褪黑素及其受體與雄性動物繁殖內(nèi)分泌

2.2.1 褪黑素影響細(xì)胞增殖及能量代謝，因此褪黑素是調(diào)控生殖激素合成的重要參與者。褪黑素對生殖激素的影響取決于生理條件和動物種類等多種因素[4]。褪黑素會降低雄鼠雄激素受體和睪丸雄激素結(jié)合蛋白的表達(dá)[24-25]。將褪黑素注入到繁殖期的雄鼠睪丸后，睪丸體積減小，睪酮含量顯著降低[26]。因此，褪黑素對長日照哺乳雄性動物的生殖作用具有抑制作用。褪黑素與短日照期動物的雄性激素水平呈正相關(guān)，褪黑素處理組中睪酮濃度比對照組高出1倍[27]，對短日照組持續(xù)補(bǔ)充褪黑素可以促進(jìn)性腺功能，褪黑素長期治療可以誘導(dǎo)梅花鹿睪丸的早期發(fā)育[28]，皮下注射褪黑素會增加公山羊的睪酮濃度[29]。以上結(jié)果表明，褪黑素是短日照動物繁殖的活性因子。

2.2.2 褪黑素是將光周期與生殖活動協(xié)同的關(guān)鍵 褪黑素通過激活下丘腦神經(jīng)元上的促性腺激素釋放激素(Gonadotrophin releasing hormone,GnRH)的受體，來調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸作用，從而影響性腺生殖激素的分泌[30]。外源性褪黑素長期作用于雄性綿羊，可導(dǎo)致GnRH的釋放，從而激活生殖活性[14]。有證據(jù)表明，褪黑素對長日照動物生殖具有抑制作用可能是通過抑制GnRH來實現(xiàn)的[31]。但目前，褪黑素調(diào)節(jié)GnRH的確切機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)肽Kisspeptins (Kp)是由Kiss基因編碼的蛋白質(zhì)，Kiss基因存在Kiss-1和Kiss-2亞型。Kp促進(jìn)GnRH分泌的上游因子，是傳遞褪黑素信息的關(guān)鍵[32]。研究發(fā)現(xiàn)，光周期可以通過褪黑素調(diào)節(jié)kiss1基因表達(dá)以驅(qū)動生殖軸[33]。褪黑素誘導(dǎo)斑馬魚后，其腦中Kiss1、kiss2和GnRH3基因表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)性腺成熟，顯著提高斑馬魚的生殖能力[34]。因此，褪黑素可引起Kp表達(dá)的變化，從而影響生殖系統(tǒng)，但褪黑素與Kp之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步的探索。

3 展望

綜上所述，一定劑量的褪黑素可以保證雄性哺乳動物正常的機(jī)體代謝，調(diào)控繁殖內(nèi)分泌，保證精子的穩(wěn)定性與活性；在體外精子保存中，特定濃度的外源性褪黑素能夠降低環(huán)境變化帶來的氧化應(yīng)激，平衡體系中氧化還原反應(yīng)和抗氧化系統(tǒng)之間的關(guān)系，降低環(huán)境沖擊對核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的損害，提高受精率。

科學(xué)家一直致力于研究褪黑素在雄性器官的發(fā)育、精子質(zhì)量和凍精復(fù)蘇率中的直接的調(diào)控作用。褪黑素作為抗氧化劑和內(nèi)分泌激素，在哺乳動物生殖系統(tǒng)中的生物學(xué)功能是顯而易見的，進(jìn)一步研究褪黑素調(diào)節(jié)類固醇激素合成和探索小分子褪黑素受體的機(jī)制也有助于治療由類固醇激素紊亂引起的生殖障礙和疾病。但褪黑素提高精子活性，有效降低凍精的死亡率及其作用機(jī)制還都需要更多的證據(jù)；離體條件下外源褪黑素濃度是如何調(diào)控精子質(zhì)量，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育能力，需要更深入的研究和探索。