阮賀飛， 吳亞運， 袁景和， 石 彥， 方曉紅*

(1.中國科學(xué)院化學(xué)研究所,分子納米結(jié)構(gòu)與納米技術(shù)重點實驗室，北京分子科學(xué)國家研究中心，北京 100190；2.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100084)

1 前言

1994年，德國科學(xué)家Hell等首次提出受激輻射耗盡顯微術(shù)概念，并在理論上驗證了其突破光學(xué)衍射極限的可行性[1]。2000年，他們在實驗中突破衍射極限并將橫向分辨率提高了2倍左右，縱向分辨率提高了6倍左右[2]。隨后多種遠場光學(xué)超分辨技術(shù)相繼出現(xiàn)并得到快速發(fā)展，橫向分辨率可以達到幾十納米[3 - 4]。光學(xué)超分辨成像技術(shù)主要分為兩類：一類是基于照明光路空間調(diào)制的受激輻射耗盡(Stimulated Emission Depletion，STED)顯微術(shù)[2]、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(Structured Illumination Microscopy，SIM)[5]等；另一類是基于單分子高精度定位的光活化定位顯微術(shù)(Photo-Activated Localization Microscopy，PALM)[6]、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM)[7]等。與PALM和STORM技術(shù)相比，基于共聚焦顯微鏡點掃描成像模式的STED顯微鏡具有更快的時間分辨，以及更加精細的三維解析能力，因此成為生化研究中重要的超分辨成像工具。憑借對STED超分辨顯微鏡發(fā)展所做出的突出貢獻，Hell獲得2014年度諾貝爾化學(xué)獎。

本文結(jié)合我們課題組近年來在STED顯微成像研究方面的工作，首先從STED成像的基本原理、熒光探針的選擇、多色及三維成像以及STED與其他技術(shù)的聯(lián)用等方面，綜述了STED顯微成像技術(shù)的研究進展，然后介紹了STED顯微鏡在不同亞細胞結(jié)構(gòu)成像中的應(yīng)用，最后對STED顯微成像技術(shù)的發(fā)展前景進行了展望。

2 受激輻射耗盡顯微成像技術(shù)的研究進展

2.1 超分辨成像原理

1873年，Abbe提出著名的光學(xué)衍射極限理論：任何理想物點經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成像后都不可能得到一個理想像點，而是得到一個彌散光斑即艾里斑，這樣兩個彌散光斑靠近后就無法分辨，進而限制了系統(tǒng)的分辨率，用公式表述橫向分辨率為[8 - 9]：

(1)

STED顯微鏡其基本原理是采用兩束激光同時照射樣品[10]，其中一束激光用來激發(fā)熒光分子，使艾里斑范圍內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)；同時，用另外一束中心光強為零的環(huán)形損耗激光(STED光)與之疊加，使艾里斑邊沿區(qū)域處于激發(fā)態(tài)的熒光分子，通過受激輻射損耗過程返回基態(tài)而不自發(fā)輻射熒光，因此只有中心STED光為零的區(qū)域中的熒光分子可自發(fā)輻射熒光，從而獲得衍射極限范圍內(nèi)的熒光發(fā)光點。從理論上來講，由于STED損耗光為環(huán)狀光束，其強度符合高斯分布且環(huán)狀中心強度為零，因而環(huán)狀損耗光強度越強，則激發(fā)光激發(fā)的熒光分子自發(fā)輻射熒光的區(qū)域就越小，其橫向分辨率就越高，用公式表示為[1,3]：

(2)

其中，Δr為兩個物點的最小分辨距離，λ為激發(fā)光波長，n為介質(zhì)折射率，θ為物鏡孔徑角的一半，Idep為損耗激光強度，Isat為熒光分子飽和激發(fā)強度。

圖1 STED超分辨熒光顯微鏡成像原理示意圖[11]Fig.1 Schematic diagram of STED super-resolution fluorescence imaging[11]

當(dāng)Idep/Isat比值很大時，橫向分辨率Δr就無限小，因此STED顯微術(shù)沒有理論分辨率極限。圖1為STED超分辨率熒光顯微鏡成像原理示意圖。

2.2 熒光探針

熒光成像過程中，細胞或者組織等生物樣品需要用具有熒光發(fā)色團的熒光探針進行標(biāo)記。理論上所有的熒光發(fā)色團均能發(fā)生受激輻射過程，應(yīng)該都可以用于STED超分辨成像。然而，實際成像過程中為了實現(xiàn)超分辨成像，使用的受激輻射光強度非常高(一般為共聚焦激發(fā)光的100倍)，往往會導(dǎo)致熒光發(fā)色團的快速漂白。另外，活細胞生物成像要求熒光探針具有良好的生物相容性、細胞穿透性和特異性標(biāo)記能力。目前報道的熒光探針主要包括三類：熒光蛋白、有機染料和熒光納米顆粒。

熒光蛋白由于其優(yōu)越的基因編輯和特異性標(biāo)記效果以及多種顏色可選的特性，已成為生物大分子和細胞結(jié)構(gòu)原位熒光成像的主要標(biāo)記策略[12 - 13]。2006年，Hell等報道了使用綠色熒光蛋白(GFP)進行STED成像，達到了70 nm的分辨率，實現(xiàn)了病毒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超分辨成像[14]。T?nnesen等使用GFP和黃色熒光蛋白(YFP)標(biāo)記觀察活體腦切片中前突觸和后突觸的結(jié)構(gòu)[15]。然而，目前可用于STED成像的熒光蛋白只有GFP和YFP。紅色熒光蛋白的穩(wěn)定性和亮度相較于其他熒光蛋白更差，無法用于STED成像。熒光蛋白的穩(wěn)定性和亮度難以與有機染料和熒光納米顆粒相比，目前依舊難以滿足STED成像的要求。

有機染料作為小分子熒光探針目前被廣泛應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域。由于STED成像需要高強度受激輻射光猝滅周圍熒光信號，必須選擇具有優(yōu)越抗光漂白性質(zhì)、亮度高的有機小分子熒光探針進行標(biāo)記。有機染料分子相比于熒光蛋白普遍具有更小的尺寸、更好的熒光穩(wěn)定性和亮度，因而標(biāo)記密度更高，成像效果更好。目前STED生物成像采用的熒光探針主要是結(jié)構(gòu)優(yōu)化過的有機染料分子，具有良好的抗漂白性質(zhì)和生物相容性，已經(jīng)有多種商品化產(chǎn)品可供選擇(Atto系列、Abberior系列染料)。如特殊結(jié)構(gòu)優(yōu)化的染料PB430能夠進行250 s的持續(xù)STED成像并保留70%的熒光強度[19]，SiR染料能進行長達1 500 s的STED成像并保留67%的熒光信號[20]。多種組合的染料對已經(jīng)被用于雙色STED生物成像和活細胞成像中，為研究細胞器和生物分子在活細胞內(nèi)的相互作用提供了重要工具。Bottanelli等采用Atto590和SiR兩種染料結(jié)合SNAP和Halo-tag的標(biāo)記方法，實現(xiàn)了長達3 min的活細胞雙色STED示蹤細胞器相互作用[21]。此外，具有點亮熒光性質(zhì)(Fluorogenic)的染料[22]和大斯托克斯位移的染料[23]也被用于STED成像，能夠有效消除背景信號干擾和簡化顯微鏡光路系統(tǒng)。

近年來，熒光納米顆粒因其優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)，包括高亮度、抗漂白性和光開關(guān)性等，被廣泛應(yīng)用于超分辨成像和單分子示蹤領(lǐng)域，量子點(QDs)[24]、上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UC NPs)[25]、熒光納米鉆石(FNDs)[26 - 27]、碳點(CDs)[28]、聚集誘導(dǎo)發(fā)光納米顆粒(AIE NPs)[29]、染料復(fù)合等離子體納米顆粒[30]等新型熒光納米探針正在被逐漸應(yīng)用于STED成像領(lǐng)域。相比于熒光蛋白和有機染料，熒光納米顆粒具有更高的亮度和抗漂白性質(zhì)，能夠進行長達數(shù)十分鐘到數(shù)小時的持續(xù)STED成像。不過熒光納米顆粒的一些缺點也無法忽視，例如較大的尺寸和活細胞標(biāo)記困難。另外，QDs和AIE NPs具有雙光子效應(yīng)，發(fā)光點周圍會產(chǎn)生一圈由損耗光激發(fā)出的虛影從而降低了信噪比[24，31]。UC NPs和染料復(fù)合等離子體納米顆粒只需要較低的受激輻射光強度就能實現(xiàn)超分辨成像，但UC NPs由于較低的量子產(chǎn)率和較長的熒光壽命限制了成像速度，染料復(fù)合等離子體納米顆粒則會因為等離子體顆粒的熱效應(yīng)導(dǎo)致染料和顆粒的分解。

我們課題組曾報道了具有優(yōu)異抗光漂白性能的熒光導(dǎo)電聚合物點(PDs)作為納米探針，并用于長時間的STED生物成像[32]。將具有優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)的紅色熒光半導(dǎo)體聚合物(668 nm)包裹于兩親性聚合物中，得到粒徑為40 nm的PDs，并進一步偶聯(lián)生物素，實現(xiàn)腫瘤細胞內(nèi)吞囊泡的標(biāo)記，得到了70 nm的分辨率和長達2 h的持續(xù)STED成像(圖2)，并能夠?qū)崟r動態(tài)觀察內(nèi)吞囊泡的融合和分離過程。該PDs與商品化STED染料(Atto 565)和包裹染料的聚苯乙烯微球相比，具有更好的亮度和熒光穩(wěn)定性，成像2 h無明顯熒光衰減，是目前STED成像熒光穩(wěn)定性最高的熒光探針。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，不同分子結(jié)構(gòu)的PDs的熒光穩(wěn)定性有明顯差異。因此，PDs可以作為一類有潛力的新型受激輻射損耗超分辨成像熒光探針，進一步設(shè)計開發(fā)新結(jié)構(gòu)的熒光聚合物，有望滿足廣泛應(yīng)用STED成像的要求。

圖2 熒光聚合物點(Pdots)用于長時間STED生物成像[32]Fig.2 Fluorescent polymer dots for long-term STED bioimaging[32]

2.3 多色及三維成像

為了精細解析細胞內(nèi)不同組分的空間分布和相互作用，發(fā)展STED多色成像和三維成像成為新的趨勢。例如，Neumann等利用雙色STED顯微鏡觀察到三種線粒體孔蛋白(hVDAC)亞型在線粒體上的不同分布，并發(fā)現(xiàn)hVDAC3與I型己糖激酶的共定位比例要高于hVDAC2和hVDAC1[33]。Pellett等利用改進的SNAP和CLIP標(biāo)簽技術(shù)，實現(xiàn)表皮生長因子和受體相互作用的雙色STED成像表征[34]。Li等人利用雙色STED顯微鏡觀察到單純性皰疹病毒(HSV-1)基因組的復(fù)制過程[35]。北京大學(xué)席鵬等使用連續(xù)激光器實現(xiàn)雙色CW-STED，獲得了71 nm的空間分辨率，并對人類呼吸道合胞病毒(hRSV)蛋白的共定位情況進行了分析[36]。

STED多色成像面臨的一個重要問題是如何解決通道間的交叉干擾(串色)和簡化成像光路。從成像裝置及光路設(shè)計上來說，目前研究人員主要通過以下兩種方式來實現(xiàn)多色STED成像：(1)選擇激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可以截然分離的多種熒光分子進行標(biāo)記，裝置上使用相應(yīng)的多束激發(fā)光和多束STED損耗光來實現(xiàn)多色STED超分辨成像[37]；(2)選擇激發(fā)光譜不同，發(fā)射光譜相近的多種熒光分子進行標(biāo)記，裝置上使用多束激發(fā)光且共用一束STED損耗光的成像模式[38 - 39]。然而，無論使用哪種方法，僅僅使用濾波片對不同通道的熒光信號進行分離是無法徹底消除串色問題的。雖然基于圖像的后期處理也能實現(xiàn)多色成像[15,40 - 41]，但是難以實現(xiàn)不同通道信號的徹底分離，并且容易產(chǎn)生假象。目前研究人員使用基于點掃描模式的時間門分離法來徹底消除串色問題，但是該方法需要較高的激光脈沖頻率，并且對脈沖時序的調(diào)控要求極為嚴(yán)格且裝置復(fù)雜，不僅需要嚴(yán)格控制單一通道內(nèi)的熒光激發(fā)、損耗和探測順序，還需要控制多通道之間的門控順序，因此實現(xiàn)起來比較困難。我們課題組提出通過不同通道間線切換掃描的方式實現(xiàn)門控多色STED成像，該方法在徹底消除串色問題的同時，還解決了點掃描時間門分離模式下裝置復(fù)雜、難以控制的問題。

基于共聚焦成像模式的STED顯微鏡本身具有三維層析能力，為細胞內(nèi)的三維成像提供便利，但是如何提高軸向分辨率具有一定的挑戰(zhàn)性。提高軸向分辨率比較經(jīng)典的方法是4Pi技術(shù)[43]，需將兩個反向的物鏡聚焦在同一焦平面上，并通過將所有的光束相干疊加來實現(xiàn)軸向分辨率的顯著提高，但此方法比較復(fù)雜，實現(xiàn)起來有一定難度。另一種方法是Hell等設(shè)計并使用了一塊0/π位相板對損耗光進行位相調(diào)控，經(jīng)過物鏡匯聚后得到一束軸向中空的光斑，進而在單物鏡成像系統(tǒng)中實現(xiàn)軸向分辨率的顯著提高。受全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)成像原理啟發(fā)，北京大學(xué)席鵬等使用鏡面代替顯微鏡載玻片成功的將STED顯微鏡軸向分辨提高了6倍[45]。

2.4 受激輻射耗盡顯微成像與其他技術(shù)聯(lián)用

將超分辨熒光顯微術(shù)與納米表征和操縱等技術(shù)聯(lián)用，可實現(xiàn)納米尺度上生物樣品的同時多模態(tài)成像和納米操縱，具有重要的發(fā)展前景。

原子力顯微鏡(AFM)的生物成像分辨率與STED成像接近，但是其探針不具有生物分子特異性識別功能。將AFM技術(shù)和STED顯微技術(shù)聯(lián)用，可實現(xiàn)納米尺度下的光學(xué)信號和力學(xué)信號同時成像，同時STED顯微鏡可為納米尺度的AFM微操縱提供更精確的引導(dǎo)。我們課題組基于三態(tài)弛豫(T-Rex)概念成功研制了超連續(xù)脈沖激光激發(fā)的SC-STED顯微鏡，獲得了好于40 nm的成像分辨率。在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了與AFM的聯(lián)用，并開發(fā)了同時成像和引導(dǎo)成像兩種聯(lián)用成像模式，在國際上首次實現(xiàn)了熒光和力學(xué)信號的同時同步獲取。利用STED成像精確引導(dǎo)AFM成像，能夠結(jié)合兩種成像的優(yōu)點，既可以快速找到感興趣的區(qū)域，又能準(zhǔn)確獲取光學(xué)信息、形貌特征和力學(xué)參數(shù)。如圖3所示，我們利用同時成像模式實現(xiàn)了細胞偽足表面形態(tài)和原位肌動蛋白微絲的超分辨熒光表征[46]。

圖3 STED顯微鏡與AFM聯(lián)用的原理示意圖[46]。左邊為聯(lián)用光路示意圖，右邊為細胞偽足的原位光學(xué)信息和形態(tài)特征。(a)共聚焦圖像；(b)AFM圖像；(c)STED圖像；(d)STED去卷積圖像Fig.3 Schematic diagram of the integrated STED microscope and AFM[46].The left figure shows the optical path of integrated system,and the right figure shows in situ optical imaging and morphological characteristics of the cellular pseudopod.(a) Confocal image;(b) AFM image;(c) STED image;(d) STED deconvolution image

與共聚焦模式下的熒光相關(guān)光譜(Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS)技術(shù)相比，基于STED顯微鏡的FCS技術(shù)可將有效探測體積減小到Confocal-FCS的十分之一，進而可用于探測濃度更高的生物樣品。因此，STED -FCS技術(shù)更有利于研究細胞膜上高密度的蛋白受體寡聚化、脂筏和脂質(zhì)分子的動力學(xué)信息。如細胞膜上的微結(jié)構(gòu)域脂筏，由于具有較小的尺寸(直徑5～200 nm)和高度的動態(tài)特性，普通熒光顯微鏡無法對其進行直接表征和研究，其存在與否一直都具有爭議性。Hell等使用STED -FCS聯(lián)用技術(shù)，直接觀察到鞘磷脂和糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI-anchored proteins)能夠被膽固醇富集的微結(jié)構(gòu)域(～20 nm)短暫的(10～20 ms)捕獲，而其他的一些磷脂不具有這種行為，直接證明了細胞膜上微結(jié)構(gòu)域的存在[47]。

光鑷技術(shù)(Optical Tweezer)廣泛用于生物樣品的微操縱，STED顯微技術(shù)與光鑷微操縱技術(shù)的聯(lián)用將進一步幫助我們在納米尺度上精確解析生物樣品結(jié)構(gòu)。例如，我們知道DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)表面上緊密的分布著多種多樣的功能蛋白，它們在DNA的復(fù)制和修復(fù)過程中具有重要作用。為精確解析和追蹤單一蛋白在雙螺旋結(jié)構(gòu)上的分布，Wuite等實現(xiàn)了STED技術(shù)和光鑷技術(shù)的聯(lián)用，首先利用光鑷技術(shù)控制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象和張力，同時利用高時間分辨(<50 ms)和空間分辨(50 nm)的STED顯微鏡來解析和追蹤蛋白的位置變化[48]。

3 受激輻射耗盡顯微鏡在細胞成像中的應(yīng)用

3.1 細胞膜蛋白和微結(jié)構(gòu)域

細胞膜既是細胞生存的屏障，又是細胞與外界發(fā)生信息、物質(zhì)和能量交換的直接介質(zhì)。其中，生理狀態(tài)下細胞膜受體的聚集狀態(tài)往往與其信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，同時細胞膜上的微結(jié)構(gòu)域又能直接影響膜受體的激活和聚集，因此利用STED超分辨顯微鏡在納米尺度上研究細胞膜受體聚集程度及微結(jié)構(gòu)域的變化有助于進一步了解細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制。

圖4 活細胞細胞膜上脂質(zhì)分子的Confocal-FCS和STED -FCS分析[47]Fig.4 Confocal-FCS and STED-FCS analysis of lipids on living cell membrane[47]

在細胞膜受體聚集研究方面，Garcia-Parajo等利用STED超分辨熒光成像研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源或者外源性脂類抗原刺激下，抗原呈遞分子CD1d在抗原呈遞細胞THP-1表面形成平均尺寸為78 nm的納米團簇，從而調(diào)控免疫細胞iNKT的激活。進一步的成像結(jié)果顯示，當(dāng)破壞細胞骨架或者切除CD1d分子的胞內(nèi)端時，CD1d分子能夠形成更大尺寸的納米團簇，進而增強免疫細胞iNKT的激活效應(yīng)[52]。Hell等也利用STED超分辨成像發(fā)現(xiàn)CHO細胞表面的乙酰膽堿受體(AChR)以平均直徑55 nm左右的納米團簇存在，并且納米團簇的尺寸和分布同樣受到細胞骨架和膽固醇去除的影響[53 - 54]。圖4為活細胞細胞膜上脂質(zhì)分子的Confocal-FCS和STED -FCS分析。

STED -FCS聯(lián)用技術(shù)為在活細胞上研究細胞膜脂肪分子、微結(jié)構(gòu)域的動態(tài)行為及相互作用提供有利條件。例如，Hell等利用STED -FCS聯(lián)用技術(shù)在活細胞細胞膜上觀察到鞘磷脂的受限擴散，直接證明細胞膜微結(jié)構(gòu)域的存在[47]。Eggeling等利用STED -FCS技術(shù)研究活細胞細胞膜上直徑30 min區(qū)域內(nèi)的多種脂質(zhì)分子的動態(tài)行為及相互作用，發(fā)現(xiàn)磷酸甘油酯之間形成弱的相互作用，而鞘磷脂之間能夠形成強的相互作用，直接證明鞘磷脂是細胞膜微結(jié)構(gòu)域成分之一[55]。

3.2 細胞器和細胞結(jié)構(gòu)

細胞質(zhì)中的細胞骨架、細胞核和多種細胞器組成了細胞的基本結(jié)構(gòu)，維持細胞的正常工作和運轉(zhuǎn)?；诠簿劢钩上衲Ｊ降腟TED顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)細胞各個層面的超分辨成像，為在納米尺度上研究各細胞器中蛋白質(zhì)的分布和功能提供幫助，彌補了普通熒光顯微鏡在分辨率上的局限。

圖5 核孔復(fù)合體中蛋白分布的confocal和STED成像圖[39]Fig.5 Confocal and STED imaging of protein distribution in nuclear pore complexes[39]

線粒體內(nèi)膜上覆蓋著很多寡聚化的蛋白復(fù)合物，它們對維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，并與一些人類疾病相關(guān)，但是它們在內(nèi)膜上的分布情況并不明確。Stefan Jakobs等利用STED超分辨顯微鏡發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中三種已知蛋白mitofilin、MINOS1、和CHCHD3在線粒體內(nèi)膜組織系統(tǒng)中形成相似的、有規(guī)則的團簇結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)位于細胞核附近的線粒體內(nèi)膜系統(tǒng)要比邊緣處的豐富[56]。

在細胞核結(jié)構(gòu)的研究中(圖5)，Hell等利用分辨率好于20 nm的雙色STED顯微鏡觀察到核孔復(fù)合體中g(shù)p210蛋白的八倍體對稱分布，并對核孔的大小和蛋白復(fù)合物的尺寸進行了表征[39]。Stave Kohtz等則利用STED顯微鏡觀察到核孔蛋白NUP62和NUP64在核孔復(fù)合體中的微觀不均一性分布[57]。

3.3 轉(zhuǎn)運囊泡

轉(zhuǎn)運囊泡在不同細胞器和細胞結(jié)構(gòu)之間扮演重要的物質(zhì)運輸作用，但因其尺寸較小，傳統(tǒng)熒光顯微鏡往往對其無能為力。例如，直徑為1 μm左右的突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)富含大量直徑約為40 nm左右的突觸囊泡，它們的運動及轉(zhuǎn)運行為就無法用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡來表征。Hell等利用每秒可以拍攝28幀圖像的STED超分辨顯微鏡追蹤到突觸囊泡的轉(zhuǎn)運行為，并發(fā)現(xiàn)這種囊泡在沒有神經(jīng)節(jié)的區(qū)域運動速度會更快[58]。我們課題組利用自主搭建分辨率可達40 nm的STED顯微鏡實現(xiàn)了后高爾基體囊泡的超分辨成像。如圖6所示，觀察到轉(zhuǎn)化生長因子Ⅱ型受體(TβRⅡ)后高爾基體囊泡的環(huán)狀輪廓結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)TβRⅡ在到達細胞膜之前，在后高爾基體囊泡膜上以聚集體的形式存在，這樣有利于其上膜后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[59]。我們還通過發(fā)展適用于STED超分辨成像的新型導(dǎo)電聚合物點，發(fā)現(xiàn)活細胞中內(nèi)吞囊泡結(jié)合和解離的動態(tài)變化[32]。

圖6 Tβ RⅡ在后高爾基體囊泡上分布的Confocal和STED成像圖[59]Fig.6 Confocal and STED imaging of Tβ RII distribution on the post-Golgi vesicles[59]

3.4 神經(jīng)元結(jié)構(gòu)

圖7 活體小鼠視覺皮層樹突中肌動蛋白微絲的超分辨成像[66]Fig.7 Super-resolution imaging of actin filaments in visual cortex dendrites of living mice[66]

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，可以通過樹突和軸突來接受和傳遞信號。在神經(jīng)生物學(xué)研究中，人們發(fā)現(xiàn)樹突棘的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，因此研究其結(jié)構(gòu)變化有助于解釋相關(guān)疾病的發(fā)生機制。然而樹突棘尺寸位于衍射極限范圍內(nèi)(40～500 nm)[60]，再加上高密度分布的樹突結(jié)構(gòu)，使得對它們結(jié)構(gòu)細節(jié)的研究非常困難。

超分辨熒光顯微技術(shù)從早期發(fā)明開始就被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究中。例如，N?gerl等利用自主搭建分辨率達70～80 nm的STED顯微鏡，在海馬切片中獲得了樹突棘結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)超分辨圖像[61]，并在另一篇報道中詳細解析了海馬神經(jīng)元中樹突棘頸的寬度和樹突棘頭的曲率[62]，他們還在腦切片中實現(xiàn)了深度達120 μm的突觸肌動蛋白微絲的動態(tài)超分辨成像[63]。進一步利用STED超分辨成像發(fā)現(xiàn)，在小鼠的正常生長發(fā)育中，隨著年齡的增長，樹突棘的頭會變小，頸部會變小和變寬，但是與普遍認知所不同的是，他們發(fā)現(xiàn)患脆性X染色體綜合癥小鼠的樹突棘的頭和頸并不會受到損傷，而是同樣隨著年齡的增長而變小變寬[64]。Brismar等利用雙色STED超分辨顯微鏡發(fā)現(xiàn)磷蛋白DARPP-32和D1R在樹突棘結(jié)構(gòu)中呈離散分布，但是在樹突棘的頭和頸部呈聚集狀態(tài)分布[65]。

另外，與其他超分辨技術(shù)相比，STED顯微鏡獨特的三維層析能力使得其具有更深的成像深度，為其在活體成像應(yīng)用中提供優(yōu)勢。如圖7所示，Hell等利用STED顯微鏡在活體小鼠大腦視覺皮層中，實現(xiàn)了深度達40 μm的樹突棘中肌動蛋白微絲的超分辨表征，并在43～70 nm的分辨率下揭示了樹突棘形態(tài)的動態(tài)變化[66]。

4 總結(jié)與展望

憑借其超高分辨率，STED顯微成像在生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域已發(fā)揮了重要的作用，證實了對一些亞細胞尺度細胞結(jié)構(gòu)的猜想，發(fā)現(xiàn)普通熒光顯微鏡無法觀察到的新現(xiàn)象[67]。但是，STED顯微術(shù)的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括成像裝置復(fù)雜、熒光探針抗漂白能力差難以實現(xiàn)長時間追蹤、STED損耗光可能具有光毒性、高時間分辨和空間分辨難以同時獲得等，這些問題的解決都將促進STED顯微術(shù)的進一步發(fā)展。例如設(shè)計合成結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的熒光染料、具有更小尺寸和更高亮度的納米顆粒熒光探針、發(fā)展適用于活細胞的特異性標(biāo)記策略將為STED成像領(lǐng)域的應(yīng)用帶來新的契機；開發(fā)靈敏度更高、探測速度更快的探測器，將有效地提高活細胞和活體的成像質(zhì)量和速度；簡化STED光路系統(tǒng)、發(fā)展小型STED顯微鏡等將會降低裝置的復(fù)雜性和成本，有利于STED顯微鏡的更廣泛使用；促進STED顯微鏡與其他成像表征技術(shù)的聯(lián)用，將幫助我們同時獲取更多的樣品信息等。隨著STED超分辨顯微術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，它將成為研究生命過程中分子機制的重要分析技術(shù)。