楊婷，林志健，姜卓希，褚夢(mèng)真，張冰，鄒麗娜

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，又稱(chēng)急性腎功能衰竭，是由各種病因引起腎功能急速下降的一種臨床綜合征[1]。作為世界難治性疾病之一，其治療手段仍有限制，建立穩(wěn)定、可靠的AKI模型是促進(jìn)腎功能不全藥物研制的前提。臨床上以腎臟缺血、腎毒性藥物、病菌感染為高發(fā)誘因，故研究者多從這幾方面入手，塑造出多種急性腎損傷模型。筆者通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的梳理發(fā)現(xiàn)，該模型常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有大鼠、小鼠、家兔、犬等，造模類(lèi)型以缺血再灌注型、藥物誘導(dǎo)型與感染型三者較為集中，現(xiàn)將從這三種造模類(lèi)型展開(kāi)論述與分析。

1 缺血再灌注型

實(shí)驗(yàn)缺血再灌注型急性腎損傷模型包括雙側(cè)腎蒂夾閉法、一側(cè)腎缺血再灌注加對(duì)側(cè)腎切除法、部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈法、遠(yuǎn)端臟器缺血誘導(dǎo)法、失血性休克法等，多以外源性手術(shù)方式造模，常見(jiàn)動(dòng)物有大鼠、小鼠、家兔和犬。缺血為急性腎損傷最常見(jiàn)病因之一，是AKI模型的首選造模因素。腎臟遍布豐富的微血管網(wǎng)，其血容量不足是引起腎臟循環(huán)障礙、組織損傷的病理基礎(chǔ)。隨后血液恢復(fù)再灌注階段，通過(guò)引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、活性氧(ROS)氧化損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)Ca2+代謝失衡、能量代謝障礙等造成腎組織再次受損[2]。

1.1 雙側(cè)腎蒂夾閉法

雙側(cè)腎蒂夾閉法為目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者常用造模方法。 Shen等[3]對(duì)麻醉后大鼠作腹正中線切口，以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，再灌注6 h，以大鼠腎組織由紫黑色轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)時(shí)表明造模成功。以往實(shí)驗(yàn)多以腹部正中切口，牽扯其胃腸道，易引起動(dòng)物胃腸感染和功能紊亂，謝慧敏等[4]通過(guò)采用背入式切口對(duì)模型進(jìn)行改進(jìn)，成功塑造出一種損傷小、操作簡(jiǎn)便且效果穩(wěn)定的大鼠腎缺血再灌注損傷模型。

該法造模周期短，成功率高達(dá)90%，通過(guò)突然暫時(shí)性的阻斷腎臟血液供應(yīng)，使細(xì)胞線粒體功能障礙，能量生成下降；當(dāng)血液恢復(fù)再灌流時(shí)，大量活性氧釋放致膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，引起腎臟組織的快速損傷[5]。雖然該法有操作簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)勢(shì)，但通過(guò)夾閉腎動(dòng)靜脈引起的腎臟淤血缺血，易導(dǎo)致機(jī)體血壓大幅度波動(dòng)，并發(fā)高血壓等病癥，與臨床急性缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機(jī)制不大等同。

1.2 一側(cè)腎缺血再灌注加對(duì)側(cè)腎切除法

一側(cè)腎蒂/腎動(dòng)脈夾閉加對(duì)側(cè)腎切除法在雙側(cè)腎蒂夾閉法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)腎切除手段模擬臨床因創(chuàng)傷、腎移植引起免疫炎癥損害。王明秋等[6]對(duì)SD大鼠作腹正中切口，安全切除右腎后，對(duì)左側(cè)腎蒂夾閉45 min,動(dòng)態(tài)觀察以再灌注24 h后腎組織、功能損傷最為顯著，且證實(shí)該模型可用于AKI早期診斷、及時(shí)干預(yù)治療等方面的研究。Rojas-Morales等[7]采用該法成功建立急性腎損傷大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)禁食處理可減輕腎損傷所伴隨的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等病理反應(yīng)。

該法相比于雙側(cè)腎蒂夾閉法而言，病理?yè)p傷顯著、呈更明顯的漸進(jìn)性變化，更趨于臨床腎移植狀態(tài)。但實(shí)驗(yàn)過(guò)程涉及到一側(cè)腎臟切除過(guò)程，要求實(shí)驗(yàn)者掌握熟練的操作技術(shù)，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌無(wú)污染，須動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)物術(shù)后的生理狀態(tài)等。

1.3 部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈法

腎血流量因遠(yuǎn)端肢體損傷導(dǎo)致持續(xù)性低灌流狀態(tài)，易形成腎前性急性腎損傷。慈紅波[8]為探討遠(yuǎn)端肢體恢復(fù)血流后的損傷作用，采用部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈法造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素以及氧自由基在腎損傷過(guò)程中起主導(dǎo)作用，可對(duì)其病理機(jī)制展開(kāi)進(jìn)一步研究。Eser等[9]通過(guò)對(duì)大鼠腎下腹主動(dòng)脈夾閉120 min、再灌注120 min后成功建立急性腎損傷模型，且應(yīng)用該模型可評(píng)價(jià)腎上腺髓質(zhì)素的干預(yù)作用。

通過(guò)結(jié)扎腎下腹主動(dòng)脈引起遠(yuǎn)端肢體缺血缺氧，再灌注時(shí)伴隨大量的氧自由基流經(jīng)腎臟，造成腎臟急性損傷。該法可用于評(píng)價(jià)活性氧族在再灌注損傷中的致病作用，旨在模擬人血液低灌注狀態(tài)下的腎損傷，與臨床患者病情較為貼近。值得注意的是，腹主動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)應(yīng)把控好結(jié)扎程度及時(shí)間，避免血流量大幅度波動(dòng)。

1.4 遠(yuǎn)端臟器缺血誘導(dǎo)法

肝、腸等遠(yuǎn)端臟器的缺血再灌注損傷常累及腎臟，急性腎損傷則是其中的一個(gè)重要并發(fā)癥[10]。崔龍海等[11]采用Pringle法制備大鼠肝臟I /R損傷模型，主要通過(guò)暴露大鼠肝門(mén)部，夾閉肝十二指腸韌帶使其缺血30 min，松開(kāi)后再灌注2 h成模，病理組織觀察可見(jiàn)腎小球及腎間質(zhì)水腫，腎小管上皮細(xì)胞腫大、變形等。此外，研究表明腸道功能障礙亦與腎臟損傷緊密聯(lián)系，孫倩等[12]通過(guò)夾閉小鼠腸系膜上動(dòng)脈1 h、恢復(fù)供血2 h完成，結(jié)果可見(jiàn)腸缺血再灌注后引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞水腫、壞死，與影響Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)。

遠(yuǎn)端臟器缺血損傷誘發(fā)急性腎功能障礙，以肝、腸缺血再灌注模型為主。該法模擬了臨床手術(shù)臟器損傷的病理生理狀態(tài)，呈遞進(jìn)性變化；目前臟器之間的作用機(jī)制還不明確，肝、腸等臟器缺血損傷同時(shí)易引發(fā)多器官功能障礙綜合征、腎損傷程度難以把控，采用該法展開(kāi)急性腎損傷研究仍存在一定難度。

1.5 失血性休克法

失血性休克是臨床手術(shù)創(chuàng)傷常見(jiàn)的急重病癥，因大量失血導(dǎo)致機(jī)體周身循環(huán)障礙，腎臟是最易受累的器官之一。實(shí)驗(yàn)失血性休克模型致急性腎損傷多采用放血定壓法，放血時(shí)，?？刂苿?dòng)物血壓在4 ～ 6 kPa范圍，Cardoso等[13]通過(guò)該法實(shí)現(xiàn)失血性急性腎損傷豬模型的塑造，手術(shù)插管放血控制血壓5.33 kPa內(nèi)，維持30 min后回輸血液完成,且研究發(fā)現(xiàn)加壓素類(lèi)似物可能有助于預(yù)防失血性休克所致的急性腎損傷。

該法與臨床失血性休克致AKI的病理機(jī)制相似，可用于評(píng)價(jià)該類(lèi)藥物的療效及作用機(jī)理。急性大量失血可產(chǎn)生大量氧自由基，再回血復(fù)蘇時(shí)流經(jīng)腎臟，通過(guò)氧化損傷其細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、不斷加重腎臟損傷程度。但該模型手術(shù)操作較為復(fù)雜、失血量多，宜采用大鼠、家兔、犬等較大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，存在較多不穩(wěn)定因素(體溫、麻醉程度、插管位置、血液流動(dòng)性、血壓變化等)，有待于研究者加強(qiáng)其實(shí)驗(yàn)方案。

1.6 其他誘導(dǎo)法

缺血再灌注型急性腎損傷模型還可見(jiàn)去甲腎上腺素滴注法、肌注甘油法、注射油酸法等。去甲腎上腺素滴注法通過(guò)使Beagle犬等動(dòng)物的腎血管收縮引發(fā)[14]；肌注甘油法通過(guò)使肌肉溶血、釋放肌紅蛋白所致；注射油酸法通過(guò)自身藥物毒性使腎組織結(jié)構(gòu)病變，此三者共性為誘導(dǎo)腎臟微循環(huán)障礙構(gòu)建AKI模型。此類(lèi)方法操作簡(jiǎn)單，病程穩(wěn)定，可實(shí)行動(dòng)態(tài)觀察，模擬人類(lèi)腎微循環(huán)障礙所致的漸進(jìn)性腎損害；但注射甘油、油酸等物質(zhì)對(duì)機(jī)體毒性較大，往往并發(fā)其他臟器損害，不利于臨床藥物篩選研究，后期還需對(duì)其注射劑量、注射方式進(jìn)行調(diào)整。

2 藥物誘導(dǎo)型

由藥物誘導(dǎo)的急性腎損傷模型主要以自身毒性物質(zhì)與腎臟反應(yīng)所致，常見(jiàn)造模方法：氨基糖苷類(lèi)抗生素誘導(dǎo)法、造影劑誘導(dǎo)法、順鉑誘導(dǎo)法、氯化汞誘導(dǎo)法、其他藥物誘導(dǎo)法等，給藥以注射方式為主，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可見(jiàn)大小鼠、家兔和犬。

2.1 氨基糖苷類(lèi)抗生素誘導(dǎo)法

氨基糖苷類(lèi)抗生素存在較強(qiáng)的毒性反應(yīng)，其中以腎毒性占首位。該類(lèi)藥物主要以原形通過(guò)腎臟排泄，積聚于溶酶體內(nèi)、與磷脂成分結(jié)合，使藥物大量蓄積在腎皮質(zhì)，引起腎小管腫脹甚至急性壞死[15]。實(shí)驗(yàn)常采用慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素誘導(dǎo)急性腎損傷，或腹腔注射、或靜脈注射，成模率高。Salama等[16]用腹腔注射慶大霉素(50 mg/kg)連續(xù)15 d，可引起大鼠急性腎損傷，并見(jiàn)腎小管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Rodriguez等[17]驗(yàn)證得生長(zhǎng)激素釋放肽-6(growth hormone releasing peptide-6，GHRP6)與表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)可對(duì)過(guò)量卡那霉素引發(fā)的腎炎起修復(fù)保護(hù)作用。安玉香等[18]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)豚鼠腹腔注射鏈霉素150 mg/kg，連續(xù)造模10 d后出現(xiàn)腎小球和腎小管壞死。

氨基糖苷類(lèi)抗生素誘導(dǎo)的急性腎損傷模型均由于藥物在腎皮質(zhì)的不斷蓄積而引發(fā)免疫清除損傷。此類(lèi)方法可以用于臨床上氨基糖苷類(lèi)抗生素致AKI的病理機(jī)制研究，但存在造模周期較長(zhǎng)、藥物誘導(dǎo)多發(fā)其他病癥、毒性程度不一、劑量較難把控、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高等問(wèn)題，需要實(shí)驗(yàn)者仔細(xì)考量和監(jiān)測(cè)。

2.2 順鉑誘導(dǎo)法

順鉑(Cisplatin，CP)為抗癌類(lèi)代表藥，超劑量或反復(fù)應(yīng)用該藥可使20% ～ 30%患者產(chǎn)生腎毒性[19]。唐偉等[20]利用順鉑染毒方式建立AKI兔模型，腎損傷程度與染毒劑量相關(guān)，以耳緣靜脈注射1.0 mg/kg體質(zhì)量連續(xù)5 d為推薦造模方式，經(jīng)機(jī)體代謝產(chǎn)生的鉑離子如何與腎組織作用還有待于進(jìn)一步研究。

該模型利用順鉑的腎毒性作用可復(fù)制出與臨床類(lèi)似的AKI模型，有助于研究順鉑及其衍生物對(duì)腎損傷的作用機(jī)理。順鉑致AKI模型多見(jiàn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物，造模方式有腹腔注射與靜脈注射，以腹腔注射吸收快為首選方式。雖然順鉑誘導(dǎo)法被廣泛應(yīng)用于AKI模型塑造，但同時(shí)面臨著一系列問(wèn)題與挑戰(zhàn)，Per?e等[21]指出該模型存在腎損傷程度評(píng)價(jià)的不確定性；動(dòng)物致死量的不可控性；腎損傷病理相似度的差異性等問(wèn)題。此外，順鉑的毒性作用較強(qiáng)，還可致慢性腎衰竭乃至全身毒性。

2.3 造影劑誘導(dǎo)法

造影劑的自身毒性、滲透壓易使腎功能不全或糖尿病患者發(fā)生急性腎功能衰竭[22]。目前以含碘制劑致腎病為主，其高滲與低滲造影劑均可對(duì)組織造成不同程度損害。該模型通過(guò)先造成基礎(chǔ)腎功能不全后給予造影劑使其建模成功。Liu等[23]對(duì)SD大鼠先以股靜脈注入吲哚美辛(10 mg/kg)和L-NG-硝基精氨酸甲酯(10 mg/kg)預(yù)處理，30 min后靜脈推注低滲非離子造影劑碘己醇，結(jié)果顯示模型大鼠出現(xiàn)顯著腎小管壞死且伴隨高水平血肌酐、尿素氮。

造影劑誘導(dǎo)的急性腎病主要與腎缺血、腎小管毒性損傷、氧自由基損傷、炎性反應(yīng)、腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)受損等發(fā)病因素有關(guān)[24]。實(shí)驗(yàn)造影劑腎病模型適用于研究造影劑腎病的病理機(jī)制及藥物的療效評(píng)價(jià)，但該模型注射造影劑前均先以藥物或手術(shù)誘導(dǎo)腎功能不全狀態(tài)得以成功，無(wú)法完全模擬臨床造影劑腎病患者的病變狀態(tài)，且造影劑注射后觀察時(shí)間無(wú)準(zhǔn)確限定，對(duì)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果存在一定誤差。

2.4 氯化汞誘導(dǎo)法

氯化汞是典型的腎毒性試劑，通過(guò)氯化汞誘導(dǎo)的腎損傷被廣泛應(yīng)用于AKI模型研究。氯化汞毒性較強(qiáng)，造模常選用較大型動(dòng)物，可見(jiàn)大鼠、家兔、犬。肖玉華等[25]研究發(fā)現(xiàn)給比格犬兩側(cè)肩部及股部位皮下注射1% 氯化汞溶液(以每只2.0 mg/kg連續(xù)注射7 d)可成功塑造急性腎損傷模型。

氯化汞進(jìn)入機(jī)體后，降解的Hg2+可蓄積于近端腎小管上皮細(xì)胞導(dǎo)致急性腎小管壞死。該法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，可呈現(xiàn)明顯的腎組織病理?yè)p傷；但該物質(zhì)的毒性不僅僅限于腎臟，同時(shí)影響其他組織器官，使其模型復(fù)雜化，不利于AKI病理機(jī)制的研究。

2.5 其他藥物誘導(dǎo)法

由腎毒性引起腎臟急性衰竭的藥物較多，實(shí)驗(yàn)造模還可見(jiàn)蛇毒誘導(dǎo)法、魚(yú)膽誘導(dǎo)法、氟化鈉誘導(dǎo)法、雙氧鈾誘導(dǎo)法等，由于此類(lèi)造模劑價(jià)格昂貴、不易獲取，目前已較少采用。腎毒性藥物常有多器官損害表現(xiàn)，給藥劑量須嚴(yán)格篩選，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也應(yīng)考慮其承受能力，推薦選用較大型動(dòng)物如家兔、犬等。

3 感染型

嚴(yán)重感染和感染性休克是誘發(fā)急性腎損傷的最常見(jiàn)病因之一，流行病學(xué)研究顯示以膿毒癥所致的全身性炎癥感染是臨床感染性AKI的最主要誘因[26]，目前感染性腎損傷模型主要以膿毒癥展開(kāi)研究，通過(guò)外源性手術(shù)或毒素致使動(dòng)物感染，進(jìn)而損及腎臟，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可見(jiàn)大鼠、小鼠、家兔、犬等。

3.1 內(nèi)毒素誘導(dǎo)法

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)組分，可激活體內(nèi)多種炎癥因子的釋放，進(jìn)而引起機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)。邵俊等[27]以?xún)?nèi)毒素休克誘導(dǎo)急性腎損傷家兔模型，通過(guò)耳緣靜脈持續(xù)緩慢勻速泵入內(nèi)毒素(2.5 mL/kg)30 min左右，觀察到平均動(dòng)脈壓(MAP)下降至基礎(chǔ)的40%時(shí)認(rèn)為造模成功。

3.2 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)誘導(dǎo)法

盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，是建立感染性腎病模型廣泛應(yīng)用的造模方法。Cai等[28]對(duì)大鼠盲腸末端和回盲瓣之間結(jié)扎，以針穿過(guò)結(jié)扎的中央段，擠出少量盲腸內(nèi)容物，再將盲腸重新置入腹腔內(nèi)縫合完成。通過(guò)使糞便流入腹腔致多種細(xì)菌感染腹腔引起嚴(yán)重的膿毒癥，以建立經(jīng)典膿毒癥所致的AKI模型。

感染性腎病模型以膿毒癥致全身性感染為首要代表，內(nèi)毒素與盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)是塑造膿毒癥致AKI模型的經(jīng)典方法，可為研究感染性腎病的病理機(jī)制及探索新的治療靶點(diǎn)提供思路和線索。但該類(lèi)模型的膿毒癥僅能模擬革蘭氏陰性菌膿毒癥，其感染程度無(wú)法控制，可呈漸進(jìn)性多器官病變，缺乏評(píng)價(jià)成模的標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)期間存在較高的手術(shù)死亡率，亟需研究者對(duì)此再行改進(jìn)與規(guī)整。目前感染性急性腎損傷模型還有廣闊的發(fā)展空間，除膿毒癥感染外，免疫缺陷病、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、瘧疾等感染性疾病也常易引發(fā)急性腎損傷，有待于深入研究。

4 小結(jié)

4.1 急性腎損傷模型特點(diǎn)總結(jié)

急性腎損傷的各類(lèi)模型在臨床相似性、難易度、穩(wěn)定性、可行性上均各占優(yōu)勢(shì)，同時(shí)又存在模型塑造過(guò)程中的不足。缺血再灌注型以造模周期短為主要優(yōu)勢(shì)，動(dòng)物選擇多樣，成模率高，以外源性手術(shù)誘導(dǎo)AKI模型為主，與臨床該病的發(fā)病特點(diǎn)尚存差異，常應(yīng)用于AKI發(fā)病機(jī)制及藥物療效評(píng)價(jià)研究[29-30]；藥物誘導(dǎo)型以貼近臨床腎毒性藥物病理機(jī)制為主要優(yōu)勢(shì)，可靈活選用造模劑，以靜脈注射或腹腔注射完成，難度在于藥物劑量及毒性程度的把控，常選用較大型動(dòng)物，多應(yīng)用于腎毒性藥物的防治研究[31]；感染型以高發(fā)率膿毒癥感染為主，可促進(jìn)感染性腎病的病理機(jī)制、藥物治療研究[32-33]，但目前這類(lèi)模型研究較少，且操作難度、死亡率均較高，有待于進(jìn)一步拓展。此三類(lèi)造模方法的共同點(diǎn)均是加劇細(xì)胞免疫應(yīng)激反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)腎組織、功能的快速紊亂。

4.2 思考

急性腎損傷，是臨床住院及重癥患者高發(fā)的一類(lèi)腎病綜合征，全球發(fā)病率為2100/100萬(wàn)[34]。其病死率高、并發(fā)癥多、病因復(fù)雜，開(kāi)展其藥物研究十分迫切。建立合適的急性腎損傷模型有助于挖掘該病的病理機(jī)制與開(kāi)拓新的治療靶點(diǎn)，目前的急性腎損傷模型還有待于改進(jìn)：1.常用模型動(dòng)物的腎組織與人體腎組織結(jié)構(gòu)存在差異(以鼠、兔等為常用模型)；2.模型多從某一角度出發(fā)(急性腎損傷為復(fù)雜的臨床綜合征)；3.感染型AKI模型研究較少(僅以膿毒癥感染為主)；4.模型是否成功無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(腎損傷程度、持續(xù)時(shí)間)等。就模型動(dòng)物而言，可加大其他種源動(dòng)物的研究，如實(shí)驗(yàn)用小型豬，該動(dòng)物的腎組織構(gòu)造與人體相似；如斑馬魚(yú)，該動(dòng)物體型小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作，可實(shí)現(xiàn)整體、細(xì)胞、分子的一體化觀察，是一種興起的新型模式動(dòng)物；就造模而言，急性腎損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，往往夾雜多種病因，造模時(shí)應(yīng)嘗試幾種模型的結(jié)合應(yīng)用；就感染性模型而言，感染病菌類(lèi)型、感染部位、感染時(shí)間、感染程度等均是應(yīng)投入實(shí)驗(yàn)研究的重要內(nèi)容；就造模成功標(biāo)準(zhǔn)而言，目前對(duì)于腎損傷標(biāo)志物的建立多有不足，應(yīng)與臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)相結(jié)合，還應(yīng)注意模型后期持久性、穩(wěn)定性的觀察。本文所歸納的AKI模型主要為實(shí)驗(yàn)常用模型，可能存在遺漏與不足，旨在為研究者提供參考與思路，盡快實(shí)現(xiàn)急性腎損傷模型塑造的突破，為促進(jìn)臨床急性腎損傷的藥物研究奠定基礎(chǔ)。