余露軍，李建軍，蔡磊，魏遠(yuǎn)征，苗宗余，黃韌

(廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所，廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

實(shí)驗(yàn)動物被國際學(xué)界公認(rèn)為“活的精密儀器”，質(zhì)量控制及其標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)驗(yàn)動物的必然要求。魚類具有種類多、繁殖力強(qiáng)、遺傳容易控制、飼育設(shè)施要求簡單等諸多優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)魚在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)、生態(tài)學(xué)等研究中應(yīng)用廣泛[1-2]，全球?qū)嶒?yàn)魚用量僅次于大小鼠，我國僅斑馬魚生產(chǎn)和使用單位已超過300家，但實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量良莠不齊，相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果可靠性難以保障，迫切需要制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)加以規(guī)范和引導(dǎo)。

國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會下達(dá)的《2009年第二批國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》批準(zhǔn)制定《實(shí)驗(yàn)動物 魚類環(huán)境與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》，技術(shù)歸口單位為全國實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC281)，計(jì)劃編號為20091329-T-469，起草單位為廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所(以下簡稱“動監(jiān)所”)、中國科學(xué)院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心(以下簡稱“CZRC”)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所(以下簡稱“珠江所”)、上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心(以下簡稱“動物中心”)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所。CZRC負(fù)責(zé)斑馬魚(Daniorerio)研究資源的收集、保藏和分享，在遺傳分析、繁殖技術(shù)及病原控制上有良好的工作積累，也是國內(nèi)斑馬魚品系保存量最多的單位[3]。動物中心長期開展斑馬魚病原、養(yǎng)殖環(huán)境等方面的研究工作。珠江所于1987年開始劍尾魚(Xiphophorushelleri)實(shí)驗(yàn)動物化研究，在劍尾魚生物學(xué)特性、病原、營養(yǎng)和環(huán)境要求等方面積累了大量數(shù)據(jù)，劍尾魚RR-B近交系為我國自主培育的第一個超過20代的近交魚[4]。動監(jiān)所自1997年開始諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)實(shí)驗(yàn)動物化研究，先后建立了蝦虎魚遺傳、微生物、營養(yǎng)和環(huán)境需求等質(zhì)控方法，是目前國際上實(shí)驗(yàn)動物化程度最高的海水實(shí)驗(yàn)魚類[2]。本文以上述單位研究工作為基礎(chǔ)，綜述實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀，以期為我國實(shí)驗(yàn)用斑馬魚、劍尾魚、蝦虎魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供建議和參考。

1 研究背景與現(xiàn)狀

1.1 我國實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制現(xiàn)狀

目前，來自觀賞魚市場或自然水域的實(shí)驗(yàn)魚直接應(yīng)用于科學(xué)研究的現(xiàn)象難以杜絕，不同實(shí)驗(yàn)室間相互引種復(fù)壯也常有發(fā)生，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚遺傳背景混亂。另外，由于場地和經(jīng)費(fèi)的限制，大部分實(shí)驗(yàn)魚房為開放環(huán)境，魚房條件、病原控制措施以及風(fēng)險(xiǎn)防范意識差異較大。對國內(nèi)19個實(shí)驗(yàn)魚代表性實(shí)驗(yàn)室的調(diào)研結(jié)果顯示，烈性傳染病雖極少發(fā)生，但實(shí)驗(yàn)魚病害問題也較為普遍，如斑馬魚常見病害及其在各實(shí)驗(yàn)室的發(fā)生率為：豎鱗病(67%)、紅鰓病(50%)、下頜紅鰓(42%)、脊椎彎曲(25%)、爛尾(25%)、游動異常(25%)、白點(diǎn)病(8%)；除CZRC等少數(shù)實(shí)驗(yàn)室堅(jiān)持開展病原監(jiān)測外，很多實(shí)驗(yàn)室對此重視不夠，實(shí)驗(yàn)魚疾病發(fā)生、傳播風(fēng)險(xiǎn)較大。

各實(shí)驗(yàn)室對實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖設(shè)施和水環(huán)境控制較為重視，大多具有較好的硬件基礎(chǔ)，除紅鯽、劍尾魚采用自制玻璃缸并配套水處理養(yǎng)殖系統(tǒng)外，其他更小個體實(shí)驗(yàn)魚的養(yǎng)殖均為商品化的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，配套水質(zhì)過濾、硝化處理、紫外消毒等水處理措施，部分斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)還配備了超濾、反滲透、電導(dǎo)率自動調(diào)節(jié)及監(jiān)控設(shè)備。大部分實(shí)驗(yàn)室關(guān)注水溫、pH、電導(dǎo)率三個水環(huán)境指標(biāo)，而對非離子氨、亞硝酸鹽等水質(zhì)指標(biāo)檢測較少；而魚房環(huán)境指標(biāo)則主要是通過空調(diào)和抽風(fēng)機(jī)進(jìn)行溫度和濕度控制，以滿足實(shí)驗(yàn)魚和實(shí)驗(yàn)人員的基本需求。

1.2 國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀

歐美等國制訂一系列實(shí)驗(yàn)魚使用指南，如《Guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing》(研究、教學(xué)和測試用魚的使用和管理指南，加拿大動物保護(hù)協(xié)會，2005)[5]、《Guidelines for the Use of Fishes in Research》(研究用魚使用指南，美國，2014)[6]、《Guidelines for health and welfare monitoring of fish used in research》(研究用魚的健康和福利監(jiān)測指南，挪威，2006)[7]、《A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (BrachydanioRerio)》(實(shí)驗(yàn)室使用斑馬魚指南，美國，2000)[8]、《Guidance on the housing and care of zebrafish》(斑馬魚養(yǎng)殖和管理指南，英國，2013)[9]等。但上述指南多是原則性的(提出一些基本要求)或資料性的(方向性建議、指導(dǎo))，多數(shù)指標(biāo)參數(shù)未明確規(guī)定，不利于規(guī)范執(zhí)行。

在國內(nèi)，2009年《實(shí)驗(yàn)動物 魚類環(huán)境與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》國家標(biāo)準(zhǔn)(20091329-T-469)獲得立項(xiàng)；2013年12月20日北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布了實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)，包括實(shí)驗(yàn)用魚 微生物學(xué)等級及監(jiān)測、寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測、遺傳質(zhì)量控制、病理診斷、配合飼料、環(huán)境條件6個部分[10-15]；2016年12月29日湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)發(fā)布了《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系遺傳質(zhì)量控制》(DB43/T 1191-2016)[16]。

2 實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究的思考

2.1 種質(zhì)

2.1.1 種質(zhì)鑒定的必要性

“種”的準(zhǔn)確是實(shí)驗(yàn)動物的基本要求，也是動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信的前提。通過數(shù)據(jù)庫(www.fishbase.org)檢索發(fā)現(xiàn)斑馬魚、劍尾魚和諸氏鯔蝦虎魚同屬的已定種分別有20種、28種和31種，部分近緣種體型、體色極其相似，且部分種間可能無生殖隔離。為了解國內(nèi)斑馬魚、劍尾魚和諸氏鯔蝦虎魚種質(zhì)資源狀況，工作組對國內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚使用單位及觀賞魚交易市場進(jìn)行實(shí)地調(diào)研和取樣，結(jié)果表明國內(nèi)存在大量Danio屬、Xiphophorus屬和Mugilogobius屬魚類。利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對采集樣本進(jìn)行種質(zhì)鑒定，已鑒定出Danio屬魚類有6種(其中5種可定種)、Xiphophorus屬魚類2種、Mugilogobius屬魚類2種。根據(jù)采集的樣本發(fā)現(xiàn)Danio屬其他魚類與斑馬魚體型非常相似；采集的2種Xiphophorus屬在體色、體型上與劍尾魚相似，且已證實(shí)市場上存在劍尾魚(X.helleri)和月光魚(X.maculatus)的雜交種；2種Mugilogobius屬魚類(M.abei，M.myxodermus)不僅在體型體色上與諸氏鯔蝦虎魚相似，且部分生態(tài)位重疊，極易發(fā)生混雜。因此，引進(jìn)實(shí)驗(yàn)魚時(shí)有必要進(jìn)行種質(zhì)鑒定。

2.1.2 種質(zhì)鑒定方法

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定雖為經(jīng)典的物種分類方法，但由于實(shí)驗(yàn)魚可量性狀和一些質(zhì)量性狀在不同養(yǎng)殖條件下可能出現(xiàn)較大差異，本標(biāo)準(zhǔn)僅將形態(tài)學(xué)中的可數(shù)性狀作為檢測指標(biāo)。同時(shí)，線粒體DNA條形碼序列是一段位于細(xì)胞色素C氧化酶亞單位I(COI)基因5’端655 bp的序列，Hebert等[17]于2003年首次提出DNA條形碼概念，隨后啟動了全球動物物種DNA條形碼測序計(jì)劃，現(xiàn)在已經(jīng)建立了以線粒體COI基因序列為依據(jù)的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(http://www.boldsystems.org)并廣泛應(yīng)用于物種鑒定，因此建議將DNA條形碼檢測方法作為實(shí)驗(yàn)魚形態(tài)鑒別不可檢驗(yàn)時(shí)的補(bǔ)充方法。

Hebert等[17]將DNA條形碼序列歧義度小于2.7%作為鳥類種內(nèi)判別閾值；Lambert等[18]研究結(jié)果顯示種內(nèi)DNA條形碼序列歧義度在0% ～ 1.24%之間；通常認(rèn)為DNA條形碼序列歧義度種內(nèi)差異小于1%[19]。本實(shí)驗(yàn)室對市場采集的魚類進(jìn)行DNA條形碼檢測，Danio屬樣本與斑馬魚、Xiphophorus屬樣本與劍尾魚、Mugilogobius屬樣本與諸氏鯔蝦虎魚序列歧義度差異均極顯著(P< 0.01)，斑馬魚、劍尾魚、諸氏鯔蝦虎魚種內(nèi)DNA條形碼序列歧義度0% ～ 0.76%(未發(fā)表數(shù)據(jù))，但考慮到樣本量有限，且國內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚使用單位較多，來源也較復(fù)雜，因此建議實(shí)驗(yàn)魚種內(nèi)DNA條形碼序列歧義度閾值定為1%。

2.2 遺傳質(zhì)量管理

實(shí)驗(yàn)魚培育過程中存在遺傳污染、突變、漂變等情況，有必要對實(shí)驗(yàn)魚遺傳質(zhì)量進(jìn)行管理。國內(nèi)19個代表性實(shí)驗(yàn)室調(diào)研結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)室對實(shí)驗(yàn)魚遺傳質(zhì)量關(guān)注度不高，檢測方法尚不成熟，均不進(jìn)行日常遺傳質(zhì)量檢測，僅實(shí)驗(yàn)魚基因插入或敲除時(shí)才會對特定基因進(jìn)行檢測。文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國外暫無實(shí)驗(yàn)魚遺傳質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)，僅少量實(shí)驗(yàn)室利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記開展實(shí)驗(yàn)魚遺傳多樣性評價(jià)。由此可見，遺傳質(zhì)量檢測仍為當(dāng)前實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制中的薄弱環(huán)節(jié)，鑒于國家標(biāo)準(zhǔn)的通用性、實(shí)用性和可操作性，建議通過遺傳管理措施，盡可能保證實(shí)驗(yàn)魚遺傳質(zhì)量，具體措施如：①實(shí)驗(yàn)魚種源宜引自行業(yè)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)魚種源單位或?qū)嶒?yàn)室；②引種數(shù)量和傳代方式宜根據(jù)實(shí)驗(yàn)魚應(yīng)用方向確定，如需保持群體較高遺傳雜合度，引種數(shù)量應(yīng)不少于25對，采用非近親交配方式繁殖后代；③如需保持群體較高遺傳純合度，引種數(shù)量根據(jù)需要確定，采用全同胞兄妹、雌核發(fā)育等方式繁殖后代；④實(shí)驗(yàn)魚引種、傳代過程應(yīng)建立包括種名、來源、數(shù)量、雌雄比例、繁殖生產(chǎn)情況等信息的譜系檔案；⑤常用實(shí)驗(yàn)魚最佳繁殖年齡均在6 ～ 15月齡，此階段實(shí)驗(yàn)魚繁殖量大、產(chǎn)卵質(zhì)量最佳，傳代親本宜選自此階段的實(shí)驗(yàn)魚。

2.3 微生物和寄生蟲

實(shí)驗(yàn)魚疾病直接影響實(shí)驗(yàn)魚的養(yǎng)殖成功與否，同時(shí)會引起實(shí)驗(yàn)魚生理生化指標(biāo)異常，從而影響實(shí)驗(yàn)魚在免疫學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用[20-22]，部分病原還可能危及實(shí)驗(yàn)人員健康[23]。實(shí)驗(yàn)魚病原控制指標(biāo)，首先應(yīng)符合我國動物疫病相關(guān)法規(guī)規(guī)定，不能攜帶人魚共患病原，同時(shí)需對實(shí)驗(yàn)魚傳染性強(qiáng)、致死率高的病原加以控制。

2.3.1 斑馬魚病原控制指標(biāo)與要求

CZRC連續(xù)多年病原檢測服務(wù)結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是引起斑馬魚敗血癥的主要病原；動物中心對上海地區(qū)斑馬魚病原檢測結(jié)果也證實(shí)嗜水氣單胞菌為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢出率和致死率較高的病原[24]。值得注意的是，嗜水氣單胞菌為條件致病菌，廣泛棲息于自然水體中，有致病株和無毒株之分[25]。鑒于致病性嗜水氣單胞菌對斑馬魚具有較大的危害性，且為2008年農(nóng)業(yè)部公告《一、二、三類動物疫病病種名錄》(以下簡稱“疫病名錄”)規(guī)定的二類水生動物疫病(細(xì)菌性敗血癥)的病原，屬于可能造成重大經(jīng)濟(jì)損失，需要采取嚴(yán)格控制、撲滅等措施，防止擴(kuò)散的病原，因此建議將致病性嗜水氣單胞菌規(guī)定為斑馬魚必檢指標(biāo)。

國外學(xué)者研究表明，多種分枝桿菌能自然感染斑馬魚，引起斑馬魚內(nèi)臟器官肉芽腫等病變，但只有海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)對斑馬魚具有高致病性[26-28]。CZRC、珠江所以及國際斑馬魚中心(https://zebrafish.org/wiki/health/disease_manual/bacterial_diseases)檢測結(jié)果顯示，海分枝桿菌是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)斑馬魚常見病原，影響斑馬魚正常繁殖，甚至導(dǎo)致斑馬魚死亡。同時(shí)，海分支桿菌還屬于人魚共患病原，國外已有感染實(shí)驗(yàn)人員的報(bào)道[23]?；诤７种U菌對斑馬魚和實(shí)驗(yàn)人員的危害考慮，建議將海分支桿菌規(guī)定為斑馬魚必檢指標(biāo)。

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)為我國“疫病名錄”規(guī)定的三類水生動物疫病的病原，可通過飲食或創(chuàng)口接觸等感染人類，屬于人魚共患病病原[29]。劉春等[30]研究結(jié)果表明，遲緩愛德華菌能自然感染野生斑馬魚，引起斑馬魚大量死亡，但實(shí)驗(yàn)室內(nèi)斑馬魚尚無感染該病原的報(bào)道。鑒于遲緩愛德華菌對實(shí)驗(yàn)室內(nèi)斑馬魚潛在的傳播感染風(fēng)險(xiǎn)，建議將遲緩愛德華菌規(guī)定為斑馬魚必要時(shí)檢測指標(biāo)。

多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)是水產(chǎn)養(yǎng)殖以及觀賞魚行業(yè)最為嚴(yán)重的病原之一，為我國“疫病名錄”規(guī)定的三類水生動物疫病的病原[31]。斑馬魚對該病原敏感，感染會導(dǎo)致大量死亡[32]。調(diào)研發(fā)現(xiàn)國內(nèi)個別實(shí)驗(yàn)室發(fā)生過引種未經(jīng)隔離的斑馬魚感染多子小瓜蟲，造成大量死亡的案例。鑒于多子小瓜蟲對斑馬魚危害極大，常造成毀滅性的損失，建議將其規(guī)定為斑馬魚必檢指標(biāo)。

微孢子蟲(Pseudolomaneurophilia)是斑馬魚最常見的病原之一[33-34]，CZRC和珠江所均從斑馬魚檢出過該病原。斑馬魚感染初期并無明顯癥狀，只有嚴(yán)重感染時(shí)，才會導(dǎo)致斑馬魚脊椎彎曲，影響斑馬魚神經(jīng)生物學(xué)和骨骼發(fā)育生物學(xué)等方面的研究結(jié)果[35]。綜合微孢子蟲的危害程度和國內(nèi)檢出情況，建議將微孢子蟲規(guī)定為斑馬魚必要時(shí)檢測指標(biāo)。

此外，柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)等病原感染實(shí)驗(yàn)室內(nèi)斑馬魚的情況也偶有發(fā)生(http://www.zfish.cn/inforscan/252.html)，但僅水質(zhì)異常、魚體受傷等情況下出現(xiàn)，建議根據(jù)養(yǎng)殖狀況進(jìn)行適時(shí)自查與監(jiān)測。

2.3.2 劍尾魚病原控制指標(biāo)與要求

珠江所對劍尾魚20多年病原研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)劍尾魚病原菌主要有嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌等[4,36]，其中嗜水氣單胞菌感染引起的細(xì)菌性敗血癥危害較大，而其他病原大多在水質(zhì)異常、魚體損傷時(shí)易發(fā)生繼發(fā)性感染。劍尾魚寄生蟲病原有多子小瓜蟲、車輪蟲等，但多與水源及外來生物攜帶病原有關(guān)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)管理得當(dāng)情況下較少發(fā)生[4,37]。鑒于致病性嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲分別為我國“疫病名錄”規(guī)定的二類和三類水生動物疫病病原，且對劍尾魚具有較強(qiáng)的致病性，建議將致病性嗜水氣單胞菌和多子小瓜蟲規(guī)定為劍尾魚必檢指標(biāo)，其他病原根據(jù)養(yǎng)殖狀況適時(shí)檢測。

2.3.3 蝦虎魚病原控制指標(biāo)與要求

動監(jiān)所對蝦虎魚病原調(diào)查結(jié)果表明，致病性嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌和創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)在野外和馴養(yǎng)環(huán)境下能自然感染蝦虎魚，引起蝦虎魚出血、潰爛等病癥，其中遲緩愛德華菌對蝦虎魚具有強(qiáng)致病性[38-39]，但實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蝦虎魚封閉群連續(xù)多年監(jiān)測均未檢出上述致病菌[2]，表明這些病原可能為野外環(huán)境條件下的條件致病菌。鑒于致病性嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌分別為我國“疫病名錄”規(guī)定的二類和三類水生動物疫病的病原，且考慮到遲緩愛德華菌對蝦虎魚的強(qiáng)致病性，建議將致病性嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌規(guī)定為蝦虎魚必檢指標(biāo)，將創(chuàng)傷弧菌規(guī)定為蝦虎魚必要時(shí)檢測指標(biāo)。此外，在馴養(yǎng)過程中，老齡化蝦虎魚偶有眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲(Amyjoodiniurnocellaturn)感染的情況，且考慮到刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)對海水魚類危害極大，為我國“疫病名錄”規(guī)定的二類水生動物疫病的病原，因此建議將刺激隱核蟲規(guī)定為蝦虎魚必檢指標(biāo)，眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲為必要時(shí)檢測指標(biāo)。

2.4 飼料質(zhì)量要求

實(shí)驗(yàn)動物飼料質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量密切相關(guān)。已有不少學(xué)者在實(shí)驗(yàn)魚的營養(yǎng)需求和飼料配方等方面開展了研究工作，如魏遠(yuǎn)征等[40-41]研究了蝦虎魚飼料營養(yǎng)需求，確定了蝦虎魚飼料配方；吳淑勤等[4]研究了劍尾魚飼料營養(yǎng)需求，并比較了投喂配合飼料與生物餌料對劍尾魚性腺發(fā)育的影響，探討了配合飼料投喂策略；杭州環(huán)特生物科技有限公司對斑馬魚開口飼料營養(yǎng)需求和配方開展了研究；美國Zeigler公司生產(chǎn)斑馬魚專用飼料。然而，由于配合飼料僅少量實(shí)驗(yàn)室采用，需求量少，商品化生產(chǎn)較為困難，加之大量研究表明投喂生物餌料的實(shí)驗(yàn)魚在生長速度和存活率方面明顯優(yōu)于人工配制的微粒飼料，尤其在開口階段[42]，因此國內(nèi)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)魚生產(chǎn)和養(yǎng)殖過程中仍以生物餌料為主。生物餌料包括輪蟲、鹵蟲、草履蟲以及橈足類和枝角類等，其中輪蟲、鹵蟲、草履蟲是最常使用的生物餌料。生物餌料攜帶病原微生物可能感染實(shí)驗(yàn)魚，影響實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量和存活。為防止生物餌料引入病原，建議生物餌料應(yīng)以不攜帶實(shí)驗(yàn)魚應(yīng)排除的微生物和寄生蟲作為基本要求，且其培育用海水應(yīng)符合NY 5052的規(guī)定，淡水應(yīng)符合 GB 5749 的規(guī)定，以免有毒有害物質(zhì)通過食物鏈傳遞至實(shí)驗(yàn)魚。

2.5 環(huán)境指標(biāo)及要求

養(yǎng)殖環(huán)境對實(shí)驗(yàn)魚具有重要影響，如水溫直接影響魚類生長、繁殖及免疫能力等各項(xiàng)生理活動，適宜的水溫是魚類生存和健康的重要保障[43-45]；pH則會引起鰓組織損傷，降低精子活力，破壞卵膜結(jié)構(gòu)，對魚類生長發(fā)育、繁殖產(chǎn)生重要影響[46-47]；鹽度直接影響滲透壓調(diào)節(jié)，與魚類生長、繁殖、疾病及存活密切相關(guān)[48-49]；溶解氧是魚類生存和生長發(fā)育的關(guān)鍵因子，水體溶解氧過低，會導(dǎo)致魚體缺氧，從而影響其攝食率、消化率、免疫力等，嚴(yán)重時(shí)窒息死亡[50]；非離子氨和亞硝酸鹽不僅影響魚類血液指標(biāo)和免疫機(jī)能，嚴(yán)重時(shí)還會導(dǎo)致魚類中毒死亡[51-52]。雖然魚類生活在水中，但光照強(qiáng)度和光周期對魚類繁殖和疾病等方面也具有重要影響[53]。基于上述研究結(jié)果，建議實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對養(yǎng)殖水溫、日水溫差、電導(dǎo)率、pH、溶解氧、鹽度、非離子氨、亞硝酸鹽、水面照度及明暗交替時(shí)間等水環(huán)境指標(biāo)進(jìn)行控制，同時(shí)對飼養(yǎng)間溫度、最低工作照度、噪聲等環(huán)境指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定。

2.5.1 飼養(yǎng)間環(huán)境指標(biāo)

(1)室溫和日室溫差：飼養(yǎng)間溫度超出要求的水溫范圍較多或日室溫差較大，則水溫難以控制，故需控制飼養(yǎng)間氣溫和日室溫差?？紤]到水體比熱容較大，水溫晝夜溫差波動幅度較氣溫小，為降低能耗，飼養(yǎng)間溫度控制范圍可略大于水溫(± 2℃)，建議日室溫差不超過6℃。

(2)噪聲：大量研究表明，魚類對長期的噪音具有適應(yīng)能力[54-56]。Matthews等[53]、Barney等[57]研究表明斑馬魚能適應(yīng)養(yǎng)殖房的水泵、水流等環(huán)境噪音，音樂等噪音也不會引起斑馬魚的異常行為反應(yīng)。斑馬魚在70 dB噪聲持續(xù)刺激下，其行為(運(yùn)動速度和轉(zhuǎn)次)無明顯變化[58]；虹鱒分別在117 dB和149 dB噪聲暴露5個月后，平均體重、體長、特定生長速率、肥滿度、飼料利用率及成活率均無顯著差異[59]。國外實(shí)驗(yàn)室對斑馬魚生產(chǎn)和使用過程中環(huán)境噪音的管理通常是基于人類的健康和舒適度而定[53]。GB 22337-2008《社會生活環(huán)境噪聲排放標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定社會生活噪聲排放晝間限值為70 dB，實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)間實(shí)測噪聲大多為60 ～ 67 dB，此噪聲下實(shí)驗(yàn)魚的行為、生長及繁殖指標(biāo)均無異常。因此，建議實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)間噪聲應(yīng) ≤ 70 dB。

(3)最低工作照度：工作照度是滿足管理操作人員工作需求的照度，實(shí)驗(yàn)魚與陸生實(shí)驗(yàn)動物管理人員的工作照度需求一致，建議參照GB 14924-2010《實(shí)驗(yàn)動物 環(huán)境及設(shè)施》設(shè)定工作照度應(yīng)≥200 lx。

2.5.2 水環(huán)境指標(biāo)

(1)水溫：Spence等[60]對孟加拉國斑馬魚原產(chǎn)地9個不同地區(qū)的水溫監(jiān)測結(jié)果顯示，斑馬魚原產(chǎn)地水溫范圍為16.5 ～ 33℃，表明斑馬魚對溫度具有廣泛性的適應(yīng)性；Matthews等[53]研究結(jié)果表明斑馬魚養(yǎng)殖水溫在24 ～ 30℃狀態(tài)最佳，建議斑馬魚養(yǎng)殖水溫宜為24 ～ 30℃。根據(jù)吳淑勤等[4]研究結(jié)果，建議劍尾魚水溫宜為20 ～ 30℃。同時(shí)，根據(jù)動監(jiān)所近20年的養(yǎng)殖實(shí)踐，建議蝦虎魚水溫宜為22 ～ 30℃。

(2)日水溫差：魚類屬于變溫動物，體溫隨著水溫的升降而變化，因此水溫波動會引起魚體一系列應(yīng)激反應(yīng)，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚發(fā)病、甚至死亡。理論上日水溫差越小越好，但結(jié)合養(yǎng)殖實(shí)踐和可操作性，建議日水溫差控制在4℃內(nèi)較合適。

(3)電導(dǎo)率：Avdesh等[61]推薦斑馬魚電導(dǎo)率適宜范圍為300 ～ 1500 μS/cm；根據(jù)國內(nèi)主要斑馬魚和劍尾魚養(yǎng)殖魚房調(diào)研結(jié)果，其養(yǎng)殖水電導(dǎo)率控制在500 μS/cm左右。由于養(yǎng)殖水源的地域性差異，考慮可操作性，建議斑馬魚和劍尾魚養(yǎng)殖水電導(dǎo)率范圍為300 ～ 1500 μS/cm。

(4)pH：根據(jù)Avdesh等[61]研究結(jié)果，斑馬魚適宜pH范圍為6.8 ～ 7.5；《劍尾魚養(yǎng)殖手冊》推薦劍尾魚適宜pH范圍為6.8 ～ 8.3[62]；GB 11607-89《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定海水魚養(yǎng)殖pH值范圍為7.0 ～ 8.5，而天然海水的pH值常穩(wěn)定在7.9 ～ 8.4。根據(jù)養(yǎng)殖實(shí)踐，建議蝦虎魚pH值控制在7.0 ～ 8.5。

(5)溶解氧：GB 11607-89《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》要求海淡水魚溶解氧每天必須有16 h以上大于5 mg/L，其余任何時(shí)候不得低于3 mg/L。為保障實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量，建議實(shí)驗(yàn)魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖水溶解氧大于5 mg/L。由于實(shí)驗(yàn)魚仔魚為半靜水養(yǎng)殖，生物餌料、殘餌和糞便會導(dǎo)致水體溶氧降低，但增氧可能影響實(shí)驗(yàn)魚仔魚的活動，結(jié)合實(shí)踐情況，建議實(shí)驗(yàn)魚仔魚靜水養(yǎng)殖溶解氧不低于3 mg/L。

(6)鹽度：李建軍等[63]研究表明，蝦虎魚繁殖適宜鹽度范圍為10.0 ～ 20.0，生長鹽度適宜范圍為0.0 ～ 40.0，而世界大洋的平均鹽度為35.0，故建議蝦虎魚養(yǎng)殖鹽度宜為10.0 ～ 35.0。

(7)非離子氨濃度：GB 11607-89《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定分子態(tài)氨濃度應(yīng)小于0.02 mg/L，這是理想、安全的水質(zhì)氨指標(biāo)，氨濃度在0.02 mg/L以下時(shí)一般不會導(dǎo)致魚類發(fā)病。而海水魚類對氨氮具有一定的耐受性，蝦虎魚氨氮的安全濃度為0.91 mg/L[64]，可適當(dāng)提高海水實(shí)驗(yàn)魚的非離子氨濃度限值。因此，建議斑馬魚、劍尾魚養(yǎng)殖水非離子氨濃度≤ 0.02 mg/L，蝦虎魚非離子氨≤0.04 mg/L。

(8)亞硝酸鹽濃度：亞硝酸鹽是氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物，亞硝酸鹽對魚類有毒性。水體中亞硝酸鹽濃度過高時(shí)，可通過滲透與吸收作用進(jìn)入魚類血液，將魚紅血球中的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，從而使血液喪失載氧能力。一般淡水中亞硝酸鹽濃度 ≤ 0.2 mg/L對魚類無毒性[61]，較高的鹽濃度(較高的離子強(qiáng)度)能減低亞硝酸對魚的毒性，即海水中亞硝酸鹽毒性較小，故蝦虎魚推薦亞硝酸鹽≤ 0.4 mg/L。

(9)水面照度及晝夜明暗交替時(shí)間：斑馬魚適宜的水面照度為54 ～ 324 lx，明暗交替時(shí)間14 h / 10 h[53]；根據(jù)國內(nèi)外研究結(jié)果和國內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚房調(diào)研情況，晝夜明暗交替時(shí)間14 h / 10 h是目前最常用的參數(shù)。劍尾魚和蝦虎魚水面照度及晝夜明暗交替時(shí)間參照斑馬魚范圍，可正常繁殖和生長。因此，建議斑馬魚、劍尾魚、蝦虎魚水面照度為54 ～ 324 Lux，明暗交替時(shí)間14 h / 10 h。

3 展望

近年，隨著實(shí)驗(yàn)魚在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，我國實(shí)驗(yàn)魚科研隊(duì)伍及養(yǎng)殖規(guī)模也在逐年擴(kuò)大。然而，由于無統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制方法加以規(guī)范，各實(shí)驗(yàn)魚研究人員的專業(yè)背景、研究方向各不相同，其對實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制的理念和認(rèn)知存在一定差異，導(dǎo)致國內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚的質(zhì)量良莠不齊，不利于我國實(shí)驗(yàn)魚的開發(fā)、應(yīng)用。目前，斑馬魚、劍尾魚、蝦虎魚在種質(zhì)、遺傳、微生物和寄生蟲、飼料及環(huán)境質(zhì)量控制方面已開展大量前期研究，并在實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖過程中得到反復(fù)實(shí)踐驗(yàn)證，建議加快推進(jìn)實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)制定進(jìn)度，為規(guī)范我國實(shí)驗(yàn)魚的生產(chǎn)和使用提供依據(jù)；同時(shí)也為提高我國實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量、促進(jìn)我國科學(xué)研究水平提供保障。