陳龍，周紅軍，江?？?，郝麗，陳鏵耀，周新華

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院化學化工學院，廣東省普通高校農(nóng)業(yè)綠色精細化學品重點實驗室，廣東廣州510225）

農(nóng)業(yè)有害生物嚴重影響農(nóng)作物生長，使用農(nóng)藥是保證農(nóng)作物高產(chǎn)的重要前提。傳統(tǒng)農(nóng)藥在使用過程中受蒸發(fā)、降解、流失等因素影響，作用于靶標的含量極低，由此帶來對非靶標生物傷害及環(huán)境污染等諸多負面問題[1]。

農(nóng)藥緩釋技術(shù)是指通過加工使農(nóng)藥在特定時間、特定環(huán)境按需釋放，它被認為是解決農(nóng)藥降解、持效期短、利用率低等問題的有效途徑之一[2-3]。以天然高分子多糖、蛋白質(zhì)等為原料制備納米粒子、微球、微膠囊等對農(nóng)藥活性成分進行包封，具有無毒、高效、易降解等優(yōu)點，是農(nóng)藥緩/控釋的重要手段[4-5]。目前，對農(nóng)藥緩釋制劑的研究多數(shù)集中于對有效成分的高效負載及控制釋放。Liu等[6]以聚乳酸為原料，采用雙乳液法制備微膠囊對農(nóng)藥進行負載，載藥率可高達40%；Chen等[7]將木質(zhì)素與烯丙基型單體接枝，利用硫醇交聯(lián)劑在微乳液液滴界面上通過硫醇烯自由基反應(yīng)形成納米膠囊對疏水的活性物質(zhì)進行包封，有效減緩了農(nóng)藥活性成分的光降解、氧降解，同時使藥物的釋放具有pH響應(yīng)，可有效提高利用率。

在實際使用過程中，農(nóng)藥制劑多數(shù)以水為分散介質(zhì)進行噴霧，而植物葉面的疏水性是造成農(nóng)藥有效作用率極低的一個重要因素。因此，提升農(nóng)藥與葉面的親和性將有利于農(nóng)藥的靶向輸送[8]。Yu 等[9]以聚乳酸作為阿維菌素（AVM）載體制備了一種親和性的納米農(nóng)藥緩釋顆粒，利用聚乳酸與黃瓜葉面之間的氫鍵及靜電作用賦予其葉面親和能力，使其更容易在葉面潤濕。

多巴胺（DA）是一種具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的芳香族化合物，對多種表面具有極強的黏附性，將DA作為農(nóng)藥載體，有望提高農(nóng)藥與葉面親和性[10]。Gao等[11]通過氧化聚合在吡蟲啉上沉積聚多巴胺層，聚脲涂覆后形成載藥微膠囊，結(jié)果表明多巴胺的親水氨基、兒茶酚基團等可增強微膠囊的葉面潤濕能力，使葉面接觸角大幅度降低。

本研究通過甲基丙烯酸甲酯（MMA）對羧甲基纖維素（CMC） 進行疏水改性制備CMC-g-PMMA，利用疏水自組裝包覆AVM，形成CMC-g-PMMA@AVM 微膠囊，再通過多巴胺與CMC 間的氫鍵、靜電作用對CMC-g-PMMA@AVM 微膠囊進行包覆得到葉面親和型阿維菌素微膠囊（DA/CMC-g-PMMA@AVM）。本研究獲得的微膠囊不僅具有緩釋功能，而且葉面滯留大，葉面潤濕性能強，這對提高農(nóng)藥利用率、使用安全性、減少環(huán)境污染均具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

CMC，300～800mPa·s，阿 拉 丁 試 劑 公 司；MMA、DA，分析純，麥克林試劑公司；AVM，工業(yè)級，純度為95%，河北威遠生物化工有限公司；過硫酸鉀、溴化鉀，分析純，廣州化學試劑廠；丙酮、無水乙醇，分析醇，天津大茂化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

紫外分光光度計，T6 新世紀型，北京普析通用儀器有限責任公司；激光粒度儀，90 Plus PALS型，美國布魯克海文儀器公司；傅里葉變換紅外光譜分析儀，Specturm-100型，美國珀金埃爾默有限公司；同步熱分析儀，TGA2 型，美國梅特勒-托利多儀器公司；接觸角儀，Theat 型，瑞士百歐林儀器公司；掃描電子顯微鏡，SU8010 型，日本日立電子儀器有限公司；光化學反應(yīng)儀，DS-GHX-V型，上海杜斯儀器有限公司。

1.3 DA/CMC-g-PMMA@AVM的制備

1.3.1 CMC-g-PMMA的制備[12]

稱取2.0g CMC至三口燒瓶，加入50mL去離子水磁力攪拌溶解；油浴加熱至80℃，加入0.5g的過硫酸鉀，活化10min；2.0mL的MMA通過恒壓滴定漏斗滴加，反應(yīng)6h，冷卻后置于超低溫冰箱12h，冷凍干燥，得到CMC-g-PMMA 粗產(chǎn)品，然后用丙酮做溶劑于索氏提取器提純24h，得到純化CMCg-PMMA。合成機理如圖1所示。

1.3.2 DA/CMC-g-PMMA@AVM的制備

稱取0.25g AVM 溶解于無水乙醇，定容至25mL 得到10mg/mL 的AVM 乙醇溶液；稱取0.2g CMC-g-PMMA 溶解于90mL 去離子水中，加入5mL AVM 乙醇溶液，磁力攪拌30min，AVM 在疏水作用下進入CMC-g-PMMA 膠束內(nèi)部，得到CMC-g-PMMA@AVM 微膠囊；加入0.1g DA，定容至100mL，攪拌24h，得到DA/CMC-g-PMMA@AVM微膠囊。

圖1 CMC-g-PMMA的合成機理

1.4 結(jié)構(gòu)表征

掃描電子顯微鏡用于觀察樣品的表面形貌，樣品分散于導電膠上面，并進行噴金處理；采用熱重分析儀測試樣品的熱穩(wěn)定性，設(shè)置升溫速率為10℃/min，測試范圍為40～600℃，以氮氣為保護氣，設(shè)定流速為20mL/min；利用紅外光譜儀分析樣品的結(jié)構(gòu)，采用KBr 壓片法在450～4000cm-1波長范圍內(nèi)掃描。

1.5 性能測定

1.5.1 載藥性能測試

取3～5mL DA/CMC-g-PMMA@AVM 溶液置于離心管，以12000r/min 離心10min，取上清液1mL于棕色容量瓶，無水乙醇定容至25mL，用紫外分光光度計在245nm 下測吸光度并根據(jù)標準曲線A=0.03319C+0.00591（R2=0.999）計算出阿維菌素的濃度，根據(jù)式(1)計算阿維菌素的包封率EE[13]。

式中，mtotal,AVM為體系A(chǔ)VM 總質(zhì)量；mfree,AVM為體系中未包封的阿維菌素質(zhì)量。

1.5.2 葉面滯留量、接觸角與表面張力測試

葉面滯留量測試：將室內(nèi)種植的黃瓜葉剪成1.5cm×1.5cm 均一大小、表面平整的小塊。剪好的黃瓜葉浸泡在樣品溶液中，用鑷子垂直拉起，待葉面無液滴滑落時置于分析天平稱重，根據(jù)式(2)計算葉面滯留量（LRC）。

式中，M0和M1分別代表浸泡前后葉子的質(zhì)量；A代表葉子的面積。

表面張力測試：研究多巴胺的添加對體系表面張力的影響。以CMC-g-PMMA@AVM 和DA/CMCg-PMMA@AVM 為母液，配制不同AVM 濃度的稀釋液，利用接觸角儀通過懸滴法測試不同AVM 濃度下樣品溶液的表面張力。

接觸角測試：接觸角儀用于測試樣品溶液與黃瓜葉面之間的接觸角。取室內(nèi)種植的黃瓜葉片，在不損傷葉面組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上剪成平整小塊，置于玻璃片上。將5～10μL的樣品液滴加至黃瓜葉面，穩(wěn)定后記錄接觸角值。

1.5.3 藥物緩釋性能測試

取5mL DA/CMC-g-PMMA@AVM 溶液置于截留分子量為5000 的透析袋中，放入100mL 的棕色錐形瓶中，加入不同pH的40%乙醇水溶液作為緩沖液，置于25℃搖床，振蕩。每間隔一定時間，取1mL 的緩沖液于25mL 容量瓶中，用40%乙醇水溶液定容，并及時加入1mL 相應(yīng)的乙醇水溶液至錐形瓶。使用紫外分光光度計測得緩沖液吸光度，根據(jù)標準曲線：A=0.0329C－0.00263（R2=0.999）計算AVM濃度，由式(3)計算累積釋放率（Ri）。

式中，ci為不同時間AVM 質(zhì)量濃度，mg/L；mAVM為錐形瓶中AVM的總質(zhì)量。

1.5.4 光穩(wěn)定性測試

使用光化學反應(yīng)儀對AVM 的光穩(wěn)定性進行測試。 AVM 乙 醇 溶 液（10mg/mL）、 CMC-g-PMMA@AVM與DA/CMC-g-PMMA@AVM用去離子水稀釋至AVM 濃度為100mg/L，將100mL 稀釋的待測液置于石英管內(nèi)，放置在距離紫外光源20cm處，調(diào)節(jié)紫外光源（Emax=365nm）功率為300W，磁力攪拌下對其進行光照，每間隔一定時間取1mL樣品溶液至棕色容量瓶，無水乙醇定容至25mL。紫外分光光度計測量樣品在波長245nm 下的吸光度，根據(jù)標準曲線：A=0.03319C+0.00591 （R2=0.999），計算樣品溶液中AVM 的濃度。由式(4)得到AVM的殘余率（RR）。

式中，c0為AVM的初始濃度，ci為不同光照時間后樣品中的AVM濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外分析

圖2 紅外光譜圖

圖2 展示了CMC、DA、CMC-g-PMMA、DA/CMC-g-PMMA@AVM 和AVM 的紅外譜圖。如圖所示，相對于CMC，CMC-g-PMMA 在1736cm-1處出現(xiàn)羰基的特征吸收峰，表明PMMA成功接枝[14]。在DA/CMC-g-PMMA@AVM 紅外譜圖中，出現(xiàn)了對應(yīng)苯環(huán)的特征吸收峰875cm-1、809cm-1和747cm-1，說明DA 成功包覆于CMC-g-PMMA@AVM 表面，而CMC 中羧基的不對稱面內(nèi)彎曲振動吸收峰由1601cm-1偏移至1610cm-1，且在1523cm-1出現(xiàn)新吸收峰，這表明DA的氨基與CMC上的羧基存在強靜電相互力[15]。通過對比DA/CMC-g-PMMA@AVM與AVM 的紅外譜圖可知，DA/CMC-g-PMMA@AVM中出現(xiàn)了AVM 中C O C 的特征吸收峰987cm-1，說明AVM已負載于DA/CMC-g-PMMA微膠囊內(nèi)。

2.2 熱重分析

圖3 展 示 了CMC 和CMC-g-PMMA 的TG 與DTG圖。CMC在242℃開始分解，分解溫度峰出現(xiàn)在289℃；而CMC-g-PMMA 則在155℃處開始分解，分解溫度峰分別為235℃、292℃和367℃。初始分解溫度的降低及分解溫度峰出現(xiàn)在235℃是由于PMMA 上甲基支鏈熱穩(wěn)定性較差，分解溫度較低引起的[16]；367℃處分解峰與文獻中報道的PMMA 的主鏈的分解溫度峰相近，說明MMA 在引發(fā)劑的作用下發(fā)生了聚合[17]；而292℃處出現(xiàn)分解溫度峰則是由于CMC 的主鏈分解，相對于未改性的CMC分解峰溫289℃略有提高，這是由于PMMA在CMC 側(cè)基上的引入對CMC 主鏈起到了保護作用，這也說明了PMMA的成功接入。

2.3 掃描電鏡分析

圖3 CMC和CMC-g-PMMA的TG和DTG圖

圖 4 展 示 了 CMC-g-PMMA、 CMC-g-PMMA@AVM和DA/CMC-g-PMMA@AVM的掃描電鏡圖和通過Image-Pro-Plus 6.0 軟件統(tǒng)計得到的粒徑分布圖。CMC-g-PMMA 為平均粒徑130nm 的球形粒子，這是由于CMC 分子鏈上引入共聚的PMMA后具有兩親性，在水溶液中受疏水作用自組裝形成球形膠束，且由于CMC 含大量帶負電荷的羧基，分子間斥力較大，粒子分散均一。當AVM加入CMC-g-PMMA 后，平均粒徑由130nm 下降至120nm，且在粒子表面觀察到明顯的塌陷。AVM的進入使PMMA 的疏水作用增強，親水端受到的牽引力增大，粒子收縮，粒徑減小[18]，且在該過程中，CMC-g-PMMA 膠束的界面平衡被破壞，形成核- 殼結(jié)構(gòu)的載藥微膠囊。 由DA/CMC-g-PMMA@AVM 的電鏡圖和粒徑分布圖可知，DA 加入后，仍能觀察到粒子表面的塌陷，這說明DA并未對粒子的架構(gòu)造成影響；粒子球形規(guī)整度升高，平均粒徑由120nm增加至126nm，這是由于在氫鍵及靜電作用下CMC-g-PMMA@AVM 微膠囊表面被DA 包覆，DA 中的苯環(huán)與體系中游離AVM 之間存在π-π 堆疊作用，微膠囊外層對AVM 作用力增強[19]，球形規(guī)整度升高，粒徑增大。

2.4 包封率分析

圖4 CMC-g-PMMA、CMC-g-PMMA@AVM和DA/CMC-g-PMMA@AVM的掃描電鏡圖及其粒徑分布圖

表1 不同DA添加量對包封率的影響

探究了不同DA添加量對CMC-g-PMMA@AVM包封率的影響。從表1 可知，CMC-g-PMMA 對AVM 能起到較好的包封效果，包封率為73.35%，這是由于PMMA 具有較強的疏水性，對疏水的AVM 能起到束縛作用。加入0.05g DA 后，包封率上升至83.89%，且隨著多巴胺含量升高，包封率逐漸增大。這是由于DA 分子上帶有大量的氨基，其與CMC-g-PMMA 分子鏈上的羧基發(fā)生靜電結(jié)合，減少了粒子表面的負電荷，使CMC-g-PMMA與帶負電的AVM 之間的靜電排斥力減小，AVM 更容易進入微膠囊內(nèi)部[20]。同時，DA 作為一種芳香類物質(zhì)，它與CMC-g-PMMA 結(jié)合后，分子鏈上的苯環(huán)與AVM 存在π-π堆疊作用，體系中游離的AVM容易吸附在微膠囊表面，使包封率升高。

2.5 葉面潤濕性能分析

圖5 展示了不同DA 添加量對液滴在黃瓜葉面接觸角的影響。當DA 添加量由0 增加至0.15g 時，液滴與葉面接觸角由80.66°下降至67.19°，說明DA與植物表面具有較強的親和力。同時，對AVM水乳液、 CMC-g-PMMA@AVM 和DA/CMC-g-PMMA@AVM 藥液在黃瓜葉面的滯留量進行測試，結(jié)果如圖6 所示，葉面滯留量分別為14.07mg/cm2、16.89mg/cm2和18.37mg/cm2。相對于AVM 水乳液，CMC-g-PMMA@AVM 的葉面滯留量提高了20.04%，這是因為CMC 中含有大量的羥基，可以與黃瓜葉表面的蠟質(zhì)層（主要由脂肪酸、脂肪醇等組成[21]）形成氫鍵，提高了液滴在葉面的黏附性。CMC-g-PMMA@AVM 在氫鍵及靜電作用下用DA（0.10g）包覆后，葉面滯留量由16.89mg/cm2上升至18.37mg/cm2，相對AVM 水乳液提高30.56%，這是由于多巴胺具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，與葉面形成了較強的氫鍵作用，且?guī)д姾傻陌被c葉面帶負電的脂肪酸和脂肪醇之間存在靜電引力，增強了液滴在葉面的黏附性[22]。

圖5 樣品在黃瓜葉面的接觸角

圖6 AVM水乳液、CMC-g-PMMA@AVM與DA/CMC-g-PMMA@AVM的葉面滯留量

圖7 不同條件下制備的DA/CMC-g-PMMA@AVM在不同AVM濃度下的表面張力

圖7 展示了不同AVM 濃度下的CMC-g-PMMA@AVM與DA/CMC-g-PMMA@AVM溶液的表面張力。根據(jù)表面張力的變化可知，DA 加入后，CMC-g-PMMA@AVM 的臨界膠束濃度由500mg/L下降至250mg/L。臨界膠束濃度受液滴與空氣界面層富集的單分子影響。CMC-g-PMMA@AVM 液滴中，親水的羧基、羥基向液滴內(nèi)部收縮，而疏水的PMMA 則在界面富集。加入DA 后，疏水的苯環(huán)同樣可以在界面發(fā)生富集，與PMMA 協(xié)同作用形成液滴與空氣界面單分子層，因此臨界膠束濃度降低，DA/CMC-g-PMMA@AVM 在低濃度下仍能在葉面鋪展，具有較強的抗稀釋性。

2.6 光穩(wěn)定性分析

眾所周知，DA對紫外光具有較強的吸收作用，將其包覆于CMC-g-PMMA@AVM 表面有利于提高AVM 的抗紫外光解性能。圖8 展示了紫外照射下AVM 溶液、CMC-g-PMMA@AVM 和DA/CMC-g-PMMA@AVM 中AVM 的殘留率。照射60min 后，AVM溶液、CMC-g-PMMA@AVM中AVM的殘留率分別為14.03%、40.65%，這是由于包封對AVM 與紫外光之間起到了物理隔絕作用，避免了強光對AVM的照射[23]。DA的加入，AVM抗紫外性能得到進一步提升，照射60min 后，AVM 殘留率仍有59.55%，這是由于DA中含有苯環(huán)、氨基等發(fā)色基團，對紫外光具有良好的吸收作用[24]。

圖8 紫外照射下AVM溶液、CMC-g-PMMA@AVM和DA/CMC-g-PMMA@AVM中AVM的殘留率

2.7 響應(yīng)性釋放性能分析

圖9 DA/CMC-g-PMMA@AVM在不同pH條件下AVM的釋放曲線及zeta電位的變化

對AVM 包 封 后，DA/CMC-g-PMMA@AVM 微膠囊越穩(wěn)定，越有利于AVM的持續(xù)釋放。如圖9(a)所示，DA/CMC-g-PMMA@AVM 中AVM 的釋放具有pH 響應(yīng)性。當DA/CMC-g-PMMA@AVM 處于pH=5條件下時，AVM快速釋放。研究表明，體系中分散介質(zhì)的穩(wěn)定性與其表面攜帶的電荷量大小密切相關(guān)，當zeta 電位的絕對值大于15mV，則認為該體系較穩(wěn)定。由圖9(b)可知，當pH=5 時，體系所帶的電荷量僅為0.06mV，接近等電點，這是由于溶液中CMC 含有大量的羧基，而DA 含有氨基，在pH=5 條件下，羧基的去質(zhì)子化程度與氨基的質(zhì)子化程度相近，兩者之間的結(jié)合程度較高。當粒子表面的電荷量接近于零時，粒子間的作用力極低，易發(fā)生沉降，破壞DA/CMC-g-PMMA@AVM 的球形結(jié)構(gòu)，使微膠囊對AVM 的約束力降低，在透析袋內(nèi)外滲透壓的作用力快速逃逸。在pH=3 條件下，體系的zeta 電位為4.86mV，同樣不穩(wěn)定易發(fā)生沉降，但由于該環(huán)境下氨基的質(zhì)子化程度較高，對帶負電荷的AVM 存在靜電吸引力，因此釋放速率相對于pH=5條件下較慢。pH=7、pH=9條件下，AVM 的釋放速率相對速率相近，且相對緩慢。這是由于羧基的去質(zhì)子化程度升高，微膠囊表面攜帶的負電荷量增大，體系較穩(wěn)定，且微膠囊內(nèi)部的帶負電的AVM受表層負電荷的排斥，逃逸難度增大，釋放速率較慢。

為探究其釋放機理，運用了Zero-order、Firstorder、Higuchi model 及Weibull model 對AVM 釋放過程進行了擬合。由表2 可知，不同pH 環(huán)境下AVM 的釋放過程與Weibull 模型擬合度最高，R2均大于0.97，pH=3、pH=5、pH=7 和pH=9 條件下a0分別為0.5128、0.6922、0.4756 和0.5653。研究表明，當0.35＜a0＜0.69時，AVM的擴散過程不同于滲透作用下的釋放，當a0值大于0.69 且小于0.75時，釋放過程為Fick 擴散[25]。pH=5 條件下，a0值大于0.69 小于0.75，且與First-order 也有較高的擬合度（R2=0.9796），說明該過程為Fick擴散，主要受濃度影響[26]。如果釋放過程符合Higuchi 模型，釋放機制則被認為是來自載體的藥物的純擴散過程而沒有載體的侵蝕或膨脹[27]。在其他pH 條件下，0.35＜a0＜0.69，且與First order、Higuchi model 均有一定的擬合度，說明AVM 的載體結(jié)構(gòu)并未被破壞，微膠囊相對較穩(wěn)定，AVM 主要是在滲透壓作用下，通過微膠囊內(nèi)部的孔道釋放，該過程受微膠囊形態(tài)、孔道大小、長短等因素影響。

表2 模型擬合結(jié)果

3 結(jié)論

通過疏水改性CMC，多巴胺包覆得到了具有pH 響應(yīng)性、葉面親和的DA/CMC-g-PMMA@AVM微膠囊。由于DA與AVM之間存在π-π堆疊作用，DA 的添加量對AVM 的包封率具有顯著影響，DA越多，包封率越高。DA 的包覆使藥液與黃瓜葉面的接觸角由80.66°下降至67.19°，葉面滯留量相對于AVM 水乳液提升30.65%，且具有較強抗稀釋性； DA/CMC-g-PMMA@AVM 相對于CMC-g-PMMA@AVM、AVM 水乳液賦予AVM 更好的抗紫外光分解性能，可顯著提高體系中AVM 殘留率。該載藥體系的藥物釋放曲線較符合Weibull 模型，AVM 釋放具有pH 響應(yīng)，能夠通過pH 調(diào)控藥物的釋放；在pH=5 下釋放速率最快，符合Fick 擴散機理；而受微膠囊形態(tài)、孔道大小、長短等因素影響，在其他pH 條件下AVM 的釋放速率較慢。因此，將DA/CMC-g-PMMA 應(yīng)用于農(nóng)藥加工，可增強藥液葉面親和性，減少流失，控制釋放，提高利用率。