劉航，楊威，鞠鑫，姚雪梅，扶教龍，李良智

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州215009）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，能源與環(huán)境問題日益突出，化石燃料作為不可再生資源日益減少[1]。將豐富廉價(jià)的生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成生物燃料或生物基化學(xué)品等已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。眾所周知，我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)纖維廢棄物[2]。由于木質(zhì)纖維素本身有較高的結(jié)晶度，且分子間和分子內(nèi)有大量氫鍵的存在，通常需經(jīng)有效的預(yù)處理后再進(jìn)行水解轉(zhuǎn)化[3]。目前，離子液體作為一種“綠色、可設(shè)計(jì)”的溶劑，已經(jīng)廣泛用于纖維廢棄物的預(yù)處理[4]。為簡(jiǎn)化工藝，國內(nèi)外研究者對(duì)離子液體中纖維素的原位酶解更加關(guān)注。β-葡萄糖苷酶能夠直接將纖維二糖水解為兩分子葡萄糖，是纖維素酶解的關(guān)鍵限速步驟[5]。然而，離子液體往往導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶完全或者部分地失活[6]。因此探索提高離子液體中β-葡萄糖苷酶活性的方法對(duì)解決能源與環(huán)境問題，實(shí)現(xiàn)能源的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

2002年，Swatloski 等[7]首次發(fā)現(xiàn)離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯化鹽（[BMIM]Cl）可有效溶解纖維素，隨后用離子液體預(yù)處理纖維素的研究大量開展。2008年，Kamiya等[8]報(bào)道了將纖維素、離子液體及纖維素酶進(jìn)行“一鍋法”處理的原位酶解技術(shù)，纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率在24h內(nèi)可達(dá)到70%。由于“一鍋法”的工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。然而，纖維素酶在離子液體中易失活，其中β-葡萄糖苷酶作為水解纖維二糖的關(guān)鍵酶在離子液體中的失活受到了關(guān)注，如Goswami 等[9]發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶在0.9mol/L 離子液體1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽（[C2C1im]Cl）中損失了30%的活性。另一方面，由于β-葡萄糖苷酶在纖維素酶多組分中的重要性，近年來國內(nèi)外研究人員對(duì)提高β-葡萄糖苷酶在原位酶解體系中的活性開展了多方面研究。例如，研究發(fā)現(xiàn)添加2mmol/L Zn2+可以提高β-葡萄糖苷酶92%的活性[10]。此外，由于表面活性劑能使酶在反應(yīng)體系中均勻分散、促進(jìn)酶與底物的結(jié)合、降低底物的表面張力及增強(qiáng)高分子聚合物纖維素的親水性，添加表面活性劑成為提高纖維素酶活性的常用手段。如通過添加非離子型表面活性劑PEG6000孵育72h，β-葡萄糖苷酶的活性提高超過2 倍[11]；添加離子型表面活性劑SDS 使纖維素酶糖化[BMIM]Cl 預(yù)處理后的稻草秸桿的效率提高18.76%[12-13]。但是，目前關(guān)于上述方法在離子液體體系中對(duì)β-葡萄糖苷酶及纖維二糖水解過程的影響報(bào)道較少，更缺乏該過程的機(jī)理性研究。

本文作者課題組前期已經(jīng)初步研究了類芽胞桿菌sp.LLZ1 纖維素酶在離子液體[EMIM]DEP 存在時(shí)的失活規(guī)律[14]。本文研究首先比較了在離子液體[EMIM]DEP、表面活性劑及二者共同存在的環(huán)境下類芽孢桿菌sp.LLZ1β-葡萄糖苷酶活性的變化規(guī)律。隨后通過動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定、熒光光譜、圓二色譜和差示掃描量熱（DSC）等方法對(duì)[EMIM]DEP和表面活性劑影響β-葡萄糖苷酶活性的具體機(jī)制進(jìn)行了解析。最后，在離子液體和表面活性劑同時(shí)存在的條件下研究了以纖維二糖作為底物的原位酶解進(jìn)程。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

類芽孢桿菌sp.LLZ1（Paenibacillussp. LLZ1）篩選自蘇州市上方山國家森林公園，接種于固體斜面培養(yǎng)基，于4℃冰箱保存。

1.1.2 試劑

[EMIM]DEP 購于上海成捷化學(xué)有限公司；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）購于上海生工生物工程有限公司；鼠李糖脂購于西安博聯(lián)特化工有限公司；纖維二糖購于上海源葉生物技術(shù)有限公司；其他試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

F-4500 型熒光光度計(jì)購于日本日立公司；Chirascan-plus 圓二色譜儀購自英國應(yīng)用光物理公司；DSC2010 差示掃描量熱儀購自美國TA 儀器；Tecan Infinite F50 酶標(biāo)儀購于上海帝肯貿(mào)易有限公司；SBA-40C 生物傳感分析儀購于山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基

斜 面 培 養(yǎng) 基：K2HPO40.5g/L， MgSO4·7H2O 0.5g/L，CMC-Na 10.0g/L，剛果紅0.4g/L，蛋白胨2.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，瓊脂15.0g/L，pH=7.0。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：Na2HPO43.0g/L，NH4NO30.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl20.5g/L，MCC 5.0g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，pH=7.0。

1.3 培養(yǎng)方法

從斜面培養(yǎng)基中挑取菌株接種于250mL 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，以30℃、200r/min 培養(yǎng)7 天。產(chǎn)酶培養(yǎng)基置于4℃離心機(jī)中以6000g 離心15min 并使用0.22μm微孔濾膜過濾培養(yǎng)液，得到酶液。

1.4 分析方法

1.4.1β-葡萄糖苷酶活性分析

用0.1mol/L、pH=6.0乙酸緩沖液配制的5mmol/LpNPG 作為底物，置于40℃水浴中預(yù)熱15min，加入0.5mL的酶液，40℃反應(yīng)1h，向反應(yīng)體系中加入2mL、1mol/L 的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。在410nm處測(cè)定對(duì)硝基苯酚的生成量。在相同條件下測(cè)定對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蒸餾水代替酶液作為空白對(duì)照。β-葡萄糖苷酶活力定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

分析表面活性劑和離子液體對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響：向酶活測(cè)定體系中加入表面活性劑使表面活性劑終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，加入[EMIM]DEP 使[EMIM]DEP 終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。不添加表面活性劑和離子液體為對(duì)照組。

1.4.2 動(dòng)力學(xué)曲線和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

動(dòng)力學(xué)曲線和動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用濃度為0.1～20mmol/L的pNPG作為底物進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)體系包括0.5mL 的酶液、0.5mL 的底物和乙酸緩沖液配制的表面活性劑，使表面活性劑終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，[EMIM]DEP 終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。40℃孵育15min 后，采用pNPG 法檢測(cè)對(duì)硝基苯酚的生成量。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[式(1)]計(jì)算得到米氏常數(shù)（Km）和酶促反應(yīng)最大速度（Vmax），初始反應(yīng)速率(V0)以反應(yīng)前15min 的平均速率計(jì)算。[S]為底物濃度。

1.4.3 圓二色譜

利用圓二色譜儀測(cè)定表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。分別配制表面活性劑溶液，通過向其中加入酶液使表面活性劑的終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，40℃水浴1h。圓二色譜儀采用波長(zhǎng)為190～250nm 的掃描范圍，檢測(cè)池為10mm，掃描3次。在室溫下測(cè)量，圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶劑空白差減，利用軟件對(duì)β-葡萄糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行分析。

1.4.4 熒光光譜

分別配制表面活性劑溶液，通過向其中加入酶液使表面活性劑的終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，[EMIM]DEP 終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，40℃水浴1h，利用熒光光度計(jì)測(cè)定其熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，激發(fā)狹縫為15nm，發(fā)射狹縫為15nm,響應(yīng)時(shí)間為0.1s，室溫下掃描范圍為300～420nm。

1.4.5 差示掃描量熱法

β-葡萄糖苷酶和表面活性劑與[EMIM]DEP 的結(jié)合使用DSC2010 差示掃描量熱儀進(jìn)行測(cè)定，熱分析圖記錄溫度從40～90℃，掃描速率為15℃/h。β-葡萄糖苷酶的蛋白濃度為0.2g/L，表面活性劑終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，[EMIM]DEP 終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。對(duì)量熱數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到平均展開焓（ΔH）和中點(diǎn)溫度（Tm）。

1.4.6 纖維二糖的原位酶解

使用1g/L 的纖維二糖作為底物，向其中加入酶液，在0.1mol/L、pH=6.0的乙酸緩沖液中進(jìn)行纖維二糖的水解，并向混合物中加入優(yōu)化濃度后的[EMIM]DEP 和鼠李糖脂，β-葡萄糖苷酶的蛋白濃度為0.2g/L。40℃、50r/min 水浴搖床震蕩，0、60min、120min、180min和240min收集樣品，使用SBA-40C 生物傳感分析儀測(cè)定產(chǎn)物葡萄糖的生成量。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體中添加表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1 添加表面活性劑和［EMIM］DEP對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

首先考察了鼠李糖脂等幾種表面活性劑對(duì)類芽孢桿菌sp.LLZ1β-葡萄糖苷酶活性的影響，結(jié)果如圖1所示。在未添加離子液體的條件下，分別添加0.1%鼠李糖脂、Span20、PEG4000、Tween80 可使β-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性提高了11.95%、9.27%、10.07%和10.21%，而添加Triton X-100和SDS使酶活降低了3.31%和21.08%。添加5%[EMIM]DEP 使β-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性增強(qiáng)了12.00%，進(jìn)一步分別添加0.1%鼠李糖脂和Span20增強(qiáng)了21.85%和12.07%，而PEG4000 和Tween80 加入僅僅增加了8.57%和5.25%。添加Triton X-100 和SDS 的β-葡萄糖苷酶相對(duì)活性降低了4.59%和10.63%。結(jié)果顯示加入5%[EMIM]DEP和0.1%鼠李糖脂的β-葡萄糖苷酶活性相較于其他實(shí)驗(yàn)組最高為121.08%。鼠李糖脂是生物表面活性劑，能顯著降低水的表面張力，使底物更容易被利用。Chang 等[15]使用1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[AMIM]Cl）和鼠李糖脂預(yù)處理的稻草秸稈轉(zhuǎn)化為還原糖的效率為36.21%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率16.16%。 Span20、PEG4000、Tween80 和Triton X-100 屬于非離子表面活性劑，其本身不帶電荷，在水溶液中不會(huì)產(chǎn)生靜電斥力，能夠能降低溶液的表面張力，對(duì)酶與底物的結(jié)合影響較弱[16]。SDS 是陰離子表面活性劑，使底物表面的負(fù)電荷增多，增加底物與酶之間的靜電斥力，降低了酶與底物的結(jié)合能力，從而降低了酶活[17]。當(dāng)[EMIM]DEP與SDS共同作用時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性相比于SDS單一作用時(shí)增強(qiáng)，這可能是因?yàn)閇EMIM]DEP能減弱SDS分子極性頭部上所帶的電荷對(duì)周圍分子的作用范圍，從而減弱靜電斥力。

2.2 離子液體中添加表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

由于在離子液體的存在下只有添加鼠李糖脂和Span20 對(duì)β-葡萄糖苷酶的活性有增強(qiáng)作用，進(jìn)一步測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可能發(fā)現(xiàn)該結(jié)果的解釋。如圖2 和表1 所示，對(duì)照組β-葡萄糖苷酶的Km值為3.79mmol/L，添加0.1%Tween80、PEG4000、Span20和鼠李糖脂的β-葡萄糖苷酶Km值分別為3.36mmol/L、2.93mmol/L、2.29mmol/L 和1.84mmol/L，降低了11.35%、22.69%、39.58%和51.45%。米氏常數(shù)Km值反映了酶與底物親和力的大小，Km值越大，酶與底物的親和力越小。由此可知，在實(shí)驗(yàn)組中，加入表面活性劑使β-葡萄糖苷酶和底物pNPG的親和力變大，與底物更緊密的結(jié)合也有助于增強(qiáng)蛋白質(zhì)在離子液體中的穩(wěn)定性。

圖2 表面活性劑存在下β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)曲線

表1 表面活性劑存在下β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)方程和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

離子液體[EMIM]DEP 協(xié)同表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶影響的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖3和表2所示。離子液體環(huán)境中，β-葡萄糖苷酶的Km值為2.21mmol/L，比對(duì)照組減小了41.69%。在5%[EMIM]DEP 體系中分別加入0.1%Span20 和鼠李糖脂的Km值分別為1.77mmol/L 和1.68mmol/L。相對(duì)于對(duì)照組降低了53.30%和55.67%。由此可知，無論是離子液體還是離子液體與表面活性劑復(fù)配都能增加β-葡萄糖苷酶與底物的親和力。在本實(shí)驗(yàn)中，離子液體體系中添加0.1%鼠李糖脂使β-葡萄糖苷酶的Km值減小最多，這與第2.1 節(jié)中5%[EMIM]DEP 協(xié)同0.1%鼠李糖脂對(duì)β-葡萄糖苷酶的活性增強(qiáng)最多這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這可能是因?yàn)樘囟ǖ谋砻婊钚詣└淖兞甩?葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)，使酶與底物更容易結(jié)合，同時(shí)減少了酶在底物上的無效吸附。

圖3 表面活性劑和［EMIM］DEP存在下β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)曲線

表2 表面活性劑和[EMIM]DEP存在下β-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)方程和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 加入表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

使用圓二色譜分析表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果如圖4所示，α-螺旋的兩個(gè)標(biāo)志條帶可以在208nm和225nm處觀察到[18]。使用0.1%鼠李糖脂、Span20、PEG4000、Tween80和Triton X-100處理后β-葡萄糖苷酶的圓二色譜條帶強(qiáng)度略有變化。使用SDS處理后該條帶強(qiáng)度明顯降低。表3中對(duì)β-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步計(jì)算也證實(shí)了這一結(jié)果。經(jīng)0.1%鼠李糖脂、Span20、PEG4000 和Tween80 處理后，β-葡萄糖苷酶的α-螺旋分別增加了1.00%、0.78%、0.72%和0.80%。添加Triton X-100對(duì)α-螺旋沒有明顯的影響。添加SDS導(dǎo)致α-螺旋急劇減少了5.72%，同時(shí)β-折疊增加了20.09%，結(jié)果清楚地表明SDS 處理使β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)的無序性增加，致使酶活受到抑制。由于離子液體[EMIM]DEP的咪唑環(huán)在210nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收，對(duì)圓二色譜的測(cè)定有極強(qiáng)的干擾，本研究嘗試使用透析的方法將[EMIM]DEP 從溶液中透析出來，但是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%以內(nèi)的[EMIM]DEP 對(duì)β-葡萄糖苷酶是可逆抑制，而在本實(shí)驗(yàn)中[EMIM]DEP 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，所以無法通過檢測(cè)酶活的方法確定透析是否可以徹底除去酶中的[EMIM]DEP，因此離子液體存在下的圓二色譜檢測(cè)未能進(jìn)行。

圖4 表面活性劑存在下β-葡萄糖苷酶的CD圖譜

表3 表面活性劑存在下β-葡萄糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4 加入表面活性劑對(duì)β-葡萄糖苷酶芳香族氨基酸側(cè)鏈的影響

在280nm 的波長(zhǎng)下對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行熒光激發(fā)，獲得了反映其內(nèi)部的色氨酸、酪氨酸變化的光譜圖[19]。如圖5(a)所示，在不同表面活性劑的影響下，β-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)不同。β-葡萄糖苷酶-蒸餾水體系中β-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)在352nm處，β-葡萄糖苷酶-鼠李糖脂的最大發(fā)射波長(zhǎng)為363nm，發(fā)生了紅移；β-葡萄糖苷酶-Span20、β-葡萄糖苷酶-PEG4000、β-葡萄糖苷酶-Tween80 的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為354nm、351nm 和351nm，變化不大；而β-葡萄糖苷酶-SDS 的最大發(fā)射波長(zhǎng)在336nm處，發(fā)生了藍(lán)移；由于Triton X-100 會(huì)對(duì)熒光光譜產(chǎn)生干擾，無法準(zhǔn)確得到Triton X-100 處理后β-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)。加入離子液體后如圖5(b)所示，β-葡萄糖苷酶-[EMIM]DEP 和β-葡萄糖苷酶-[EMIM]DEP-鼠李糖脂的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為363nm和366nm，β-葡萄糖苷酶-[EMIM]DEP-SDS 的最大發(fā)射波長(zhǎng)為349nm，與上述結(jié)果趨勢(shì)一致。

Span20、PEG4000 和Tween80 是非離子表面活性劑，在溶液中不產(chǎn)生靜電斥力，只改變疏水相互作用，對(duì)酶的構(gòu)象改變微小，因此熒光峰的位置變化很小。SDS是陰離子表面活性劑，使β-葡萄糖苷酶中發(fā)色基團(tuán)色氨酸和酪氨酸的疏水性增強(qiáng)，所處的微環(huán)境發(fā)生變化，改變了β-葡萄糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而降低了β-葡萄糖苷酶的活性[20]。β-葡萄糖苷酶在5%[EMIM]DEP和0.1%鼠李糖脂的作用下向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)較大的距離，是因?yàn)槊傅鞍變?nèi)部的色氨酸殘基逐漸暴露，酶的構(gòu)象發(fā)生了一定的變化。

圖5 熒光光譜圖

2.5 加入鼠李糖脂和[EMIM]DEP 對(duì)β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性的影響

DSC可以用于確定酶蛋白的平衡熱力學(xué)穩(wěn)定性和折疊機(jī)制。根據(jù)第2.1 節(jié)和第2.2 節(jié)可知，5%[EMIM]DEP 協(xié)同0.1%鼠李糖脂作用對(duì)β-葡萄糖苷酶的活性增強(qiáng)效果最為明顯，且最大程度增加底物和酶的親和力，因此本研究對(duì)5%[EMIM]DEP 協(xié)同0.1%鼠李糖脂處理后的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了DSC分析，結(jié)果如圖6所示。吸熱峰表明β-葡萄糖苷酶在中點(diǎn)溫度60.7℃時(shí)熱誘導(dǎo)展開，平均展開焓為393.1J/g。添加5%[EMIM]DEP 和0.1%鼠李糖脂改變了這種吸熱轉(zhuǎn)變，中點(diǎn)溫度Tm增加至61.4℃，平均展開焓ΔH增加至395.5J/g。一般來說，蛋白質(zhì)分子的Tm值是一個(gè)確定的參數(shù)，可以指示蛋白的穩(wěn)定性強(qiáng)弱等特性。研究表明，生物表面活性劑能影響蛋白質(zhì)的解鏈，且蛋白質(zhì)與表面活性劑的相互作用通常是由于靜電作用[21]。該結(jié)果證明了當(dāng)體系中添加了鼠李糖脂后，酶蛋白的解鏈能量增加，因此解鏈溫度升高。結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)添加的鼠李糖脂與酶分子間的結(jié)合確實(shí)改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。

圖6 鼠李糖脂和［EMIM］DEP存在下β-葡萄糖苷酶的熱分析圖

2.6 纖維二糖原位酶解的時(shí)間進(jìn)程

纖維二糖的積累會(huì)對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶產(chǎn)生反饋抑制，繼而降低纖維素酶降解纖維素的效率。強(qiáng)化β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維二糖的水解可以有效地緩解這種抑制[22]。因此，提高β-葡萄糖苷酶活性可以提高纖維素酶促水解的效率。由上述實(shí)驗(yàn)可知，5%[EMIM]DEP協(xié)同0.1%鼠李糖脂提高β-葡萄糖苷酶的效果最好，因此選取5%[EMIM]DEP和0.1%鼠李糖脂進(jìn)行纖維二糖的酶解。結(jié)果如圖7所示，在最初的60min，對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率為45.67%，而添加5%[EMIM]DEP和0.1%鼠李糖脂的轉(zhuǎn)化率為58.33%，提高了12.66%。當(dāng)水解時(shí)間為180min 時(shí)，對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率為72.23%，添加5%[EMIM]DEP 和0.1%鼠李糖脂的轉(zhuǎn)化率為94.26%，相對(duì)于對(duì)照組提高了21.93%。在240min 時(shí)的水解率相對(duì)于180min 的水解率幾乎沒有提高，這可能是因?yàn)棣?葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成產(chǎn)物葡萄糖會(huì)對(duì)β-葡萄糖苷酶活性產(chǎn)生反饋抑制[23]。

3 結(jié)論

圖7 纖維二糖原位酶解的時(shí)間進(jìn)程

本文考察了表面活性劑和離子液體[EMIM]DEP對(duì)類芽孢桿菌sp.LLZ1β-葡萄糖苷酶活性的影響。研究結(jié)果表明， 0.1% 鼠李糖脂、 Span20、PEG4000、Tween80 和5%[EMIM]DEP 能增強(qiáng)β-葡萄糖苷酶的活性；用5%[EMIM]DEP協(xié)同0.1%表面活性劑處理β-葡萄糖苷酶，鼠李糖脂和Span20 均能增強(qiáng)β-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性。其中，5%[EMIM]DEP 和0.1%鼠李糖脂使β-葡萄糖苷酶的相對(duì)活性增加了21.85%。圓二色譜表明經(jīng)表面活性劑處理后β-葡萄糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；熒光光譜顯示添加表面活性劑和[EMIM]DEP 使β-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移或藍(lán)移；DSC表明5%[EMIM]DEP和0.1%鼠李糖脂協(xié)同作用提高了β-葡萄糖苷酶的中點(diǎn)溫度和平均展開焓。最后在0.1%鼠李糖脂和5%[EMIM]DEP環(huán)境中進(jìn)行纖維二糖的酶促水解，葡萄糖的生成量增加了21.93%。本研究有效地增強(qiáng)β-葡萄糖苷酶在[EMIM]DEP 中的活性，從而提高原位酶解的效率，研究可為廢棄生物質(zhì)的資源化利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。