汪偉，彭減，林碩，謝銳，巨曉潔，劉壯，褚良銀

（1四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都610065；2四川大學(xué)高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610065）

及時(shí)檢測(cè)對(duì)環(huán)境和人體健康有害的痕量化學(xué)物質(zhì)對(duì)于疾病診斷[1-2]和環(huán)境保護(hù)[3-4]等有著至關(guān)重要的作用。Pb2+是含量最豐富的有毒重金屬污染物之一，由于其在生物體中容易積累，即使是微量的Pb2+也會(huì)引起腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷以及腦部疾病，尤其是對(duì)處于發(fā)育期間的兒童危害極大。因此，許多國(guó)家和組織均對(duì)水環(huán)境中Pb2+的濃度具有非常嚴(yán)格的要求。例如，我國(guó)規(guī)定工業(yè)廢水中Pb2+的濃度必須小于2.42×10-6mol/L，而世界衛(wèi)生組織規(guī)定飲用水中Pb2+的濃度必須小于4.83×10-8mol/L。由于Pb2+對(duì)人體的重大危害作用，使得及時(shí)檢測(cè)水環(huán)境中的痕量Pb2+具有十分重要的意義。

目前用于Pb2+的分析檢測(cè)方法主要有電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[5]、原子吸收光譜法[6]、電化學(xué)法[7]和熒光探針[8]等，這些方法主要通過將Pb2+濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為光信號(hào)和電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。但是，通常來(lái)說這些技術(shù)所使用的檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴、樣品制備耗時(shí)，并且其操作和分析過程繁瑣，需要專業(yè)的人員操作儀器并分析解讀檢測(cè)信號(hào)。而電化學(xué)法雖然方法簡(jiǎn)單、成本低廉，但是易受其他金屬離子的干擾，難以實(shí)現(xiàn)高選擇性Pb2+檢測(cè)[9-10]；而熒光探針?biāo)玫降纳锩竿ǔr(jià)格昂貴，且不易儲(chǔ)存[11]。此外，上述方法往往難以實(shí)現(xiàn)對(duì)于待測(cè)物的可視化定量檢測(cè)。因此，仍需開發(fā)一種能將Pb2+濃度信號(hào)有效轉(zhuǎn)換為易于檢測(cè)讀取的可視化輸出信號(hào)的新型便捷檢測(cè)方法。

環(huán)境刺激響應(yīng)性智能水凝膠材料可響應(yīng)環(huán)境中的多樣化刺激信號(hào)變化，并改變自身的化學(xué)物理特性[12-13]，這就為將分析物質(zhì)信號(hào)有效轉(zhuǎn)換為多樣化的輸出信號(hào)提供了靈活的策略[14-17]?；诖?，本文通過將具有Pb2+響應(yīng)特性的聚(N-異丙基丙烯酰胺-共聚-苯并-18 冠-6 丙烯酰胺)（PNB）智能微凝膠與H 型微通道相結(jié)合，構(gòu)建了一種能便捷、靈敏、可視化檢測(cè)水溶液中痕量Pb2+濃度的新型智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片。該微流控檢測(cè)芯片能基于PNB智能微凝膠的Pb2+響應(yīng)性體積相變和H型微通道中的流體流動(dòng)行為，將Pb2+濃度信號(hào)有效轉(zhuǎn)換為微通道中指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)水溶液中Pb2+濃度的可視化、靈敏定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM，純度＞98%）、苯并-18-冠-6丙烯酰胺（B18C6Am）、偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（V50，分析純），梯希愛化城工業(yè)發(fā)展有限公司；N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA，分析純）、亞甲基藍(lán)（分析純）、羅丹明B（分析純）、硝 酸 鋰（LiNO3）、硝 酸 鈉（NaNO3）、硝 酸 鉀（KNO3）、硝酸鎂[Mg(NO3)2]、硝酸鈣[Ca(NO3)2]、硝酸鍶[Sr(NO3)2]、硝酸鋇[Ba(NO3)2]、硝酸鉻[Cr(NO3)3]、硝酸鈷[Co(NO3)2]、硝酸鎳[Ni(NO3)2]、硝酸銅[Cu(NO3)2]、硝 酸 鋅[Zn(NO3)2]、硝 酸 鎘[Cd(NO3)2]、硝酸鉛[Pb(NO3)2]，成都市科龍化工試劑廠；聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184）及固化劑，美國(guó)Dow Corning 公司；光刻膠（SU-8 2035）、顯影液（SU-8 Developer），美國(guó)MicroChem 公司；硅片，波蘭ITME公司；光掩膜（25400dpi），昆山明確電子有限公司；純水（＞18.2Ω），Millopore Elix-10純水系統(tǒng)。以上試劑除NIPAM 經(jīng)進(jìn)一步精制再使用外，其余試劑均直接使用。

UVEC-411A 紫外點(diǎn)光源，深圳藍(lán)譜里克科技有限公司；G2 Pro 掃描電鏡，復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；GE-5 愛國(guó)者顯微鏡，華旗資訊數(shù)碼科技有限公司；MFCS-FLEX 3C 微流體控制系統(tǒng)、FLU-L 流量傳感器，法國(guó)Fluigent 公司；OAI 150 型平行曝光機(jī)，美國(guó)OAI 公司；WS-650MZ-23NPP 勻膠機(jī)，美國(guó)Laurell 公司；BP-2B 型烘膠臺(tái)，北京創(chuàng)世威納科技有限公司；MK1000-24V DC-5.0A-B/TS62控溫?zé)崤_(tái)，美國(guó)Instec公司；ZK-82BB 電熱真空干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；PDC-32G-2 等離子體清洗系統(tǒng)，美國(guó)Harrick 公司；FA2004 電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；Millipore Elix-10 純水系統(tǒng)，Millipore公司。

1.2 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的構(gòu)建

基于軟光刻技術(shù)[18]，以具有良好光學(xué)透明性的PDMS 為基材[19]，構(gòu)建具有H 型微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片。其主要制作步驟包括：首先用乙醇和去離子水超聲清洗硅片；然后，在硅片表面通過勻膠機(jī)旋涂得到具有一定厚度的SU-8 膠，再利用烘膠臺(tái)進(jìn)行前烘處理，使得SU-8 膠中有機(jī)物揮發(fā)和冷卻固化；接著，在紫外平行光下曝光，并且進(jìn)行后烘，使得曝光區(qū)域的SU-8 膠交聯(lián)；待硅片冷卻后經(jīng)顯影得到具有H 型微通道凸起結(jié)構(gòu)的SU-8 膠圖案；最后，通過150℃硬烘、PDMS 澆鑄以及與玻片緊密鍵合，從而構(gòu)建得到具有H型微通道結(jié)構(gòu)的PDMS微流控芯片。

制得PDMS微流控芯片后，通過結(jié)合具有圓形透光微孔的光掩膜，在微流控芯片內(nèi)原位聚合制備具有Pb2+響應(yīng)特性的圓柱狀PNB智能微凝膠。具體步驟為：首先，將2mmol NIPAM、0.3mmol B18C6Am、0.04mmol MBA、0.185mmol V50 溶解到2mL 去離子水中以配制單體溶液。其次，在光學(xué)顯微鏡協(xié)助下，將光掩膜圓形透光微孔的中心與PDMS微流控芯片中的微凝膠固定柱的中心對(duì)齊，并以光掩膜在下、PDMS 微流控芯片在上的順序用UV 無(wú)影膠將兩者固定在一起。然后，將單體溶液裝入注射器中，并經(jīng)同一個(gè)注射器分流由微流控芯片的入口1和入口2 分別注入其微通道中，同時(shí)將空氣排出。使用紫外點(diǎn)光源由下往上經(jīng)下層光掩膜的圓形透光微孔照射上層微流控芯片中的單體溶液30s，以在微通道中進(jìn)行單體溶液的原位聚合反應(yīng)。紫外光照完畢后，將微流控芯片取出，去掉光掩膜，由入口3通入去離子水沖洗微通道5min以去除未反應(yīng)完的單體，最終得到微通道中結(jié)合有PNB 智能微凝膠的智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片。

1.3 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的結(jié)構(gòu)表征

利用掃描電鏡對(duì)PDMS微流控芯片的微通道結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用光學(xué)顯微鏡對(duì)微流控芯片的微通道結(jié)構(gòu)以及其中的智能微凝膠進(jìn)行形貌表征，利用數(shù)碼相機(jī)對(duì)微流控芯片整體外觀進(jìn)行表征。為了便于觀察智能微凝膠以及微通道結(jié)構(gòu)，在微流控芯片中通入了經(jīng)羅丹明B（0.01mol/L）染色的水溶液。

1.4 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的Pb2+檢測(cè)性能表征

首先，將微流控檢測(cè)芯片置于熱臺(tái)上，并利用注射泵將一個(gè)注射器中的去離子水以2000μL/h 的流速分流由入口1 和入口2 注入微流控檢測(cè)芯片中；同時(shí)，以500μL/h 的流速由入口3 向微流控檢測(cè)芯片通入經(jīng)亞甲基藍(lán)染色的指示液。利用熱臺(tái)調(diào)控微流控檢測(cè)芯片中的溫度，在每個(gè)溫度平衡15min后，記錄該溫度條件下H型微通道中指示液所覆蓋的指示柱的數(shù)目。以1℃為間隔改變微流控檢測(cè)芯片中的溫度，并重復(fù)上述記錄過程。以溫度改變1℃后指示柱被覆蓋數(shù)目變化最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度作為最佳操作溫度。

然后，在最佳操作溫度條件下，研究Pb2+濃度對(duì)H型微通道中指示液的流形以及指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目變化的影響，以確立Pb2+濃度和指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目變化之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中采用微流體控制系統(tǒng)來(lái)控制入口1和入口2中通入的樣品液總流速為2000μL/h、入口3中通入的指示液流速為500μL/h，并采用數(shù)碼光學(xué)顯微鏡對(duì)H型微通道中指示液的流動(dòng)情況以及指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目的變化情況進(jìn)行觀察研究。實(shí)驗(yàn)中采用了左、右兩邊指示柱中分別被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化的絕對(duì)值之和來(lái)指示Pb2+濃度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的設(shè)計(jì)原理

圖1 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的檢測(cè)原理

圖2 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片微通道中的凝膠固定柱、緊縮段和指示柱陣列的掃描電鏡圖

該智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片主要通過將具有Pb2+響應(yīng)性體積相變特性的PNB智能微凝膠與H型微通道結(jié)構(gòu)相結(jié)合，從而將Pb2+濃度變化信號(hào)有效轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單易讀、易可視化檢測(cè)的指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化信號(hào)。該智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片具有的H型微通道結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示，其右下角的支路微通道中結(jié)合有Pb2+響應(yīng)性PNB智能微凝膠，其余三個(gè)支路微通道中具有一個(gè)較小尺寸的緊縮段。該智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片可通過PNB智能微凝膠響應(yīng)Pb2+濃度信號(hào)后的體積變化，來(lái)調(diào)控其所在的支路微通道的流阻，從而調(diào)控H型微通道中指示液的流動(dòng)。當(dāng)PNB 智能微凝膠響應(yīng)Pb2+時(shí)，其PNIPAM 高分子鏈上懸掛的B18C6Am 基團(tuán)能識(shí)別Pb2+，并與之絡(luò)合形成穩(wěn)定的帶正電荷的B18C6Am/Pb2+“主-客體”絡(luò)合物。該絡(luò)合物的形成會(huì)增加智能微凝膠的親水性和絡(luò)合物之間的靜電排斥作用，使得智能微凝膠的體積相轉(zhuǎn)變溫度向高溫遷移，從而使得PNB 智能微凝膠在等溫條件下響應(yīng)Pb2+后體積發(fā)生溶脹［圖1(c)、(d)］[16]。這種體積溶脹減小了PNB 智能微凝膠和微通道壁面之間流體流動(dòng)的縫隙，從而使得流阻增大、流速減小，因此H型微通道兩端的壓力不等，使得指示液發(fā)生流動(dòng)，導(dǎo)致其所覆蓋的指示柱數(shù)目發(fā)生變化［圖1(a)、(b)］。由于當(dāng)Pb2+濃度不同時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)指示液覆蓋面積相同的情況，因此，檢測(cè)時(shí)采用了左、右兩邊被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化的絕對(duì)值之和作為指標(biāo)來(lái)反映Pb2+濃度的變化。而通過方便地采用光學(xué)顯微鏡觀察測(cè)定上述指示柱數(shù)目的變化，則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于水中痕量Pb2+的靈敏、定量、可視化檢測(cè)。

2.2 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的可控構(gòu)建

圖3 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片內(nèi)部微通道結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡圖及具有3個(gè)獨(dú)立H型微通道的微流控芯片數(shù)碼照片

該微流控檢測(cè)芯片主要以PDMS為基材、通過成熟的軟光刻技術(shù)來(lái)構(gòu)建。如圖2(a)所示為H型微通道[圖1(a)]右下角支路微通道中用于固定智能微凝膠的固定柱，其中，支路微通道寬度為300μm，固定柱直徑為100μm；如圖2(b)所示為H型微通道[圖1(a)]其余三個(gè)支路微通道中所具有的緊縮段結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖，其中緊縮段結(jié)構(gòu)的寬度為50μm；而圖2(c)所示則為H 型微通道[圖1(a)]中間指示柱陣列的掃描電鏡圖，其中指示柱直徑為100μm。從以上圖中可以看出，通過軟光刻技術(shù)成功構(gòu)建出了所需的微流控檢測(cè)芯片中的微尺度結(jié)構(gòu)。通過結(jié)合光掩膜以在微通道中微凝膠固定柱的位置原位聚合單體溶液，可以進(jìn)一步在微通道中制備得到圓柱形的PNB智能微凝膠。如圖3(a)所示為結(jié)合有圓柱形智能PNB 微凝膠的H 型微通道的光學(xué)顯微鏡圖，該微通道中充滿了經(jīng)羅丹明B染色的水溶液。從圖3(a)中可以明顯看出，該微流控檢測(cè)芯片具有H型微通道結(jié)構(gòu)，且H型微通道右下角的微凝膠固定柱上結(jié)合有一個(gè)圓柱形的智能微凝膠，而其余三個(gè)支路微通道中則具有一個(gè)較小尺寸的緊縮段結(jié)構(gòu)；此外，該H型微通道中間還具有左、右兩部分的指示柱陣列。如圖3(b)所示為包含有3 個(gè)獨(dú)立的H型微通道的智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的數(shù)碼照片，從該圖中可以看出，即使該微流控芯片內(nèi)部具有3個(gè)獨(dú)立的H型微通道，其整體尺寸仍僅相當(dāng)于一枚硬幣大小，展現(xiàn)出了該微流控芯片的小巧和便攜性。

圖4 不同溫度下指示液覆蓋指示柱情況的光學(xué)顯微鏡圖

2.3 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的最佳操作溫度

該微流控芯片對(duì)Pb2+的靈敏檢測(cè)主要基于PNB智能微凝膠絡(luò)合Pb2+后發(fā)生的體積溶脹所導(dǎo)致的流體流動(dòng)行為變化。為了確定該智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的最佳操作溫度，實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了不同溫度條件下H 型微通道中被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化。如圖4所示為不同溫度條件下H型微通道中指示液流形的變化以及指示液對(duì)指示柱的覆蓋情況的變化。從圖4中可以看出，當(dāng)溫度逐漸由29℃升高至34℃的過程中，由于PNB 智能微凝膠不斷收縮，從而導(dǎo)致右下角支路微通道中供樣品液流動(dòng)的橫截面積增大、流阻減小，使得H型微通道中分布在右側(cè)流動(dòng)的指示液逐漸向左側(cè)流動(dòng)，從而流形發(fā)生變化。而在指示液流形變化的過程中，指示液所覆蓋的指示柱的數(shù)目亦發(fā)生變化。如圖5所示，與其他溫度相比，當(dāng)操作溫度為32℃時(shí)，該微流控芯片展現(xiàn)出了最大的指示柱被覆蓋數(shù)目的變化；因此，選定了32℃作為該微流控芯片的最佳操作溫度。

2.4 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的Pb2+檢測(cè)性能

圖5 不同溫度下指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化（ΔN）情況

為了研究該微流控檢測(cè)芯片的Pb2+檢測(cè)性能，分別向該微流控檢測(cè)芯片中通入去離子水及不同濃度的Pb2+溶液，并記錄Pb2+濃度與H 型微通道中指示液流形以及指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目之間的關(guān)系。如圖6 所示為不同Pb2+濃度下H 型微通道中指示液流形以及指示液覆蓋指示柱情況的光學(xué)顯微鏡圖。從該圖中可以看出，當(dāng)Pb2+濃度由0mol/L（純水）逐漸增大為10-5mol/L 時(shí)，由于PNB 智能微凝膠不斷發(fā)生體積溶脹，從而導(dǎo)致右下角微通道橫截面積減小、流阻增大，使得H型微通道中分布在左側(cè)流動(dòng)的指示液逐漸向右側(cè)流動(dòng)，進(jìn)而指示液流形發(fā)生變化。在此過程中，H型微通道中被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目亦隨之發(fā)生改變。并且，從圖6(a)和圖6(b)中可以看出，即使通入濃度低至10-10mol/L的Pb2+溶液，被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目與通入去離子水（0mol/L）時(shí)相比仍然變化了6 個(gè)，說明該微流控檢測(cè)芯片具有很高的靈敏度。進(jìn)一步地，基于圖7 所示的Pb2+濃度與被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化之間的關(guān)系曲線以及公式，通過方便地觀察H 型微通道中被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化，則可定量、靈敏地分析出樣品液中的Pb2+濃度，其檢測(cè)限可低至10-10mol/L。該方法可以精確檢測(cè)出樣品液中Pb2+濃度所處的數(shù)量級(jí)，而通過進(jìn)一步增加指示柱數(shù)量、減小指示柱尺寸，還可以進(jìn)一步提高該檢測(cè)芯片對(duì)上述Pb2+濃度范圍內(nèi)，因微小Pb2+濃度變化所引起的微小指示液流形變化，從而提高檢測(cè)芯片的靈敏度和準(zhǔn)確性。此外，對(duì)于樣品液中存在顆粒等雜質(zhì)的情況，可通過在檢測(cè)芯片上游設(shè)置一過濾裝置先除去顆粒等雜質(zhì)后，再進(jìn)行樣品液中Pb2+濃度的檢測(cè)。

圖6 不同Pb2+濃度下指示液覆蓋的指示柱情況的光學(xué)顯微鏡圖

圖7 指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化與Pb2+濃度之間的關(guān)系

2.5 智能Pb2+檢測(cè)微流控芯片的抗干擾性能

圖8 干擾離子對(duì)指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化的影響

為了探明該微流控芯片對(duì)Pb2+檢測(cè)的高選擇性，研究了當(dāng)樣品液中加入不同干擾離子時(shí)對(duì)H型微通道中被指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目的影響。如圖8所示，與通入去離子水時(shí)指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目相比，當(dāng)通入的樣品液中含有濃度為10-6mol/L的Ba2+時(shí)，指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目?jī)H變化了1個(gè)；而當(dāng)通入樣品液中含如圖8所示的其余12種干擾離子中的任一種干擾離子（濃度均為10-6mol/L）時(shí)，指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目并不會(huì)發(fā)生變化。相比之下，當(dāng)通入樣品液中含有10-6mol/L的Pb2+時(shí)，指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目變化了16 個(gè)，遠(yuǎn)高于通入干擾離子時(shí)的指示柱數(shù)目變化。上述結(jié)果表明，基于PNB智能微凝膠對(duì)Pb2+的高選擇性，該微流控檢測(cè)芯片亦展示出了對(duì)Pb2+檢測(cè)的高選擇性。

3 結(jié)論

本文通過將PNB 智能微凝膠與具有H 型微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片相結(jié)合，有效地將水溶液中的Pb2+濃度信號(hào)轉(zhuǎn)換為易于可視化檢測(cè)和讀取的指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化，從而構(gòu)建了一種能便捷、靈敏檢測(cè)痕量Pb2+濃度的微流控檢測(cè)芯片。系統(tǒng)研究了該微流控檢測(cè)芯片的形貌結(jié)構(gòu)和H型微通道中的流體流動(dòng)行為，以及Pb2+濃度與指示液覆蓋的指示柱數(shù)目之間的關(guān)系。通過光學(xué)顯微鏡便捷觀察測(cè)量指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化，成功實(shí)現(xiàn)了水溶液中Pb2+濃度的超靈敏檢測(cè)。此外，通過在該檢測(cè)芯片中結(jié)合能響應(yīng)其他刺激信號(hào)（如葡糖糖、K+等）而發(fā)生體積相變的智能凝膠，還可以方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)于不同物質(zhì)的檢測(cè)。因此，該微流控芯片為水環(huán)境中痕量Pb2+的超靈敏可視化檢測(cè)提供了新的策略。