李想，劉艷霞，陳風(fēng)雷，孫光軍，李光雷，王興國，楊興明，鄒焱，張恒，朱經(jīng)偉

1 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550000；

2 中國煙草總公司貴州省公司，貴陽 550000；

3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095

土壤酶是土壤的一個重要組分，參與包括土壤生物化學(xué)過程在內(nèi)的自然界物質(zhì)循環(huán)，在土壤的發(fā)生發(fā)育以及土壤肥力的形成過程中具有重要作用[1]。土壤酶能夠促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)的分解，釋放植物有效養(yǎng)分，土壤酶活性大小對土壤有機(jī)碳的含量具有重要影響[2]。近些年來，土壤酶活性作為表征土壤性質(zhì)的生物活性指標(biāo)，已被廣泛應(yīng)用于評價土壤中碳、氮、磷、硫等營養(yǎng)元素的循環(huán)轉(zhuǎn)化特征，以及評價各種農(nóng)業(yè)措施對土壤供肥特性的影響等方面[3]。

土壤微生物群落多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中所有微生物的種類、基因與環(huán)境相互作用的多樣化程度[4]，主要包括物種、遺傳、結(jié)構(gòu)以及功能多樣性[5]，豐富的微生物群落多樣性不僅能緩解連作障礙，而且是維持土壤健康的保證[6]，同時土壤微生物群落多樣性還可以反應(yīng)土壤肥力特征[7]，對深入認(rèn)識微生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能以及開展微生物多樣性資源的保護(hù)和利用具有重要意義[8]。

不同的施肥處理對土壤的影響是顯著不同的[9]，近年來有大量研究表明，長期施用有機(jī)肥可提高土壤酶活和微生物的數(shù)量、活性[10]。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)長期施用有機(jī)肥可以顯著提高團(tuán)聚體中的酶活性，彭智良等[12]研究表明餅肥腐植酸處理煙田根際與非根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量增加較多，根際放線菌數(shù)量在煙株生長中后期增加較多，施用有機(jī)肥后對土壤中真菌的數(shù)量影響較小。劉艷霞等和滕桂香等研究發(fā)現(xiàn)對苗床期煙苗根際施用生物有機(jī)肥可以提高微生物數(shù)量，使得煙草根系表明形成“微生物生物防御層”，防止或減少病原菌的侵入[13-14]。

21 世紀(jì)以來，新一代高通量測序技術(shù)迅猛發(fā)展，可直接測序16S DNA基因的PCR產(chǎn)物，每次分析獲得的基因序列數(shù)以百萬甚至億萬計(jì)，不僅通量高，而且能夠同時分析上百個不同的樣品，是解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對豐度的重要工具[15]。探究土壤微生物群落在長期不同施肥處理下的發(fā)展變化，對克服煙草連作障礙、針對性的調(diào)節(jié)土壤微生物群落具有重要意義，因此本文采用長期定位不同施肥處理，開展植煙土壤酶活性以及微生物群落多方面的研究，為后續(xù)土壤生物修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

在貴州省五大煙葉種植區(qū)域取樣，分別為畢節(jié)、遵義、黔西南州、黔東南州和銅仁市，供試土壤均為黃壤（表1）。

表1 樣品概況Tab.1 Sample overview

續(xù)表1

1.1.2 供試品種

烤煙品種為云煙85。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用多年定點(diǎn)施肥試驗(yàn)，各施肥處理均處理3年，施肥處理為3種，無機(jī)肥處理（I）：只施用煙草專用復(fù)合肥料（N : P2O5: K2O = 10 : 9 : 24）975 kg·hm-2；有機(jī)肥處理（O）：只施用有機(jī)肥2321.4 kg·hm-2；化肥配施有機(jī)肥（M）：在施用817.5 kg·hm-2煙草專用復(fù)合肥料基礎(chǔ)上加施375 kg·hm-2的有機(jī)肥。各試驗(yàn)點(diǎn)施肥處理相同，各處理氮磷鉀含量保持一致，純有機(jī)肥和無機(jī)配施有機(jī)肥處理磷和鉀不足部分分別用過磷酸鈣和硫酸鉀補(bǔ)齊，純有機(jī)肥處理和無機(jī)配施有機(jī)肥處理中的有機(jī)肥均采用秸稈有機(jī)肥（以玉米秸稈為主要原料和菜粕經(jīng)高溫堆肥發(fā)酵制成），含有 機(jī)質(zhì) 638 g·kg-1、N 42.0 g·kg-1、P2O522.6 g·kg-1和 K2O 10.8 g·kg-1。

1.3 取樣方法

在貴州省五大煙葉種植區(qū)域于煙苗移栽55 d后采用“五點(diǎn)法”采集正常生長煙田的根際土壤樣品，將煙草根系整體取出，輕輕抖動去除根圈土壤。將根及根表附著的土壤一起放入超聲儀中進(jìn)行超聲處理，超聲在水里的土壤即為根際土壤樣品[16]。土壤樣品信息見表1。

1.4 土壤樣品理化性狀測定方法

土壤的全N和有機(jī)碳含量通過Elementar高精度元素分析儀測定；pH采用FiveEasy Plus? pH計(jì)（Mettler Toledo）測定，土壤過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶測定方法參考文獻(xiàn)[17-19]。

1.5 土壤DNA提取及PCR反應(yīng)

土壤DNA采用Soil DNA Isolation Kit（Omega）提取，土壤DNA提取物采用無菌水稀釋至1×10-3μg/μL。以DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物為515F-806R，引物采用515F：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3′。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，使用GeneJET 膠回收試盒（Thermo Scientific）回收產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系以及文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析參見劉艷霞等[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2003 處理，顯著性分析采用 SPSS Base Ver.13.0 統(tǒng)計(jì)軟件 （SPSS，IL，Chicago，美國）進(jìn)行，最小顯著差異法（LSD）或鄧肯（Duncan）新復(fù)極差進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對植煙土壤pH和碳氮的的影響

由表2可見，無機(jī)肥處理的土壤pH值變幅為4.97～6.68，沒有＞7.5的土樣，6.5～7.5的中性土壤只有1個（畢節(jié)的威寧區(qū)域），5.5～6.5的微酸性土壤有12個，＜5.5的酸性土壤有2個，均在黔東南煙區(qū)。有機(jī)肥處理的土壤pH值變幅為5.21～7.10，沒有＞7.5的土樣，6.5～7.5的中性土壤有7個，5.5～6.5的微酸性土壤有7個，＜5.5的酸性土壤有1個（天柱區(qū)域）。化肥配施有機(jī)肥處理的土壤pH值變幅為5.22～7.31，沒有＞7.5的土樣，6.5～7.5的中性土壤有3個，5.5～6.5的微酸性土壤有10個，＜5.5的酸性土壤有2個。貴州5個植煙區(qū)域土壤有機(jī)肥處理的pH值顯著高于無機(jī)肥處理，有機(jī)肥處理的pH值比無機(jī)肥處理增加6.89%，化肥配施有機(jī)肥處理與其他兩處理之間無顯著性差異。

土壤的有機(jī)碳含量采用土壤養(yǎng)分分級評價體系[20]中的有機(jī)質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行判斷（下同），無機(jī)肥處理的土壤有機(jī)碳含量變幅為1.54%～2.96%，土壤有機(jī)碳1.72%～2.87%的樣品有11個，占全部重復(fù)的73.33%。有機(jī)肥處理的土壤有機(jī)碳含量變幅為1.11%～3.69%，土壤有機(jī)碳＞2.87%的樣品有5個，土壤有機(jī)碳1.72%～2.87%的樣品有8個?；逝涫┯袡C(jī)肥處理的土壤有機(jī)碳含量變幅為1.36%～3.03%，土壤有機(jī)碳＞2.87%的樣品有3個，土壤有機(jī)碳1.72%～2.87%的樣品有10個。有機(jī)肥處理的平均有機(jī)碳含量比無機(jī)肥處理增加21.29%，具有顯著性差異，化肥配施有機(jī)肥處理與其他兩處理之間無顯著性差異。

表2 施肥處理對植煙土壤pH、碳氮的影響Tab.2 Effects of fertilizer treatments on pH,carbon and nitrogen content in tobacco growing soil

無機(jī)肥處理的土壤全氮含量變幅為0.14%～0.34%，平均為0.25%，土壤全氮＞0.2%的樣品有11個，占無機(jī)肥處理樣品的73.33%。有機(jī)肥處理的土壤全氮含量變幅為0.14%～0.34%，平均為0.25%，土壤全氮＞0.2%的樣品有13個，占有機(jī)肥處理樣品的86.67%?；逝涫┯袡C(jī)肥處理的土壤全氮含量變幅為0.16%～0.30%，平均為0.23%，土壤全氮＞0.2%的樣品有11個，占化肥配施有機(jī)肥處理樣品的73.33%。貴州省植煙土壤各施肥處理全氮含量無顯著性差異。

2.2 不同施肥處理對貴州省植煙土壤樣品酶活特性的影響

無機(jī)肥處理的土壤過氧化氫酶平均為12.28 mg·g-1·min-1（表3），有機(jī)肥處理的土壤過氧化氫酶平均為13.47 mg·g-1·min-1，化肥配施有機(jī)肥處理的土壤過氧化氫酶平均為11.82 mg·g-1·min-1，遵義、黔西南以及銅仁土壤過氧化氫酶均表現(xiàn)出O＞M＞I，黔東南則表現(xiàn)為相反的趨勢；無機(jī)肥處理的土壤脲酶平均為212.12 IU，有機(jī)肥處理的土壤脲酶平均為261.88 IU，化肥配施有機(jī)肥處理的土壤脲酶平均為255.59 IU，除畢節(jié)外，其他各區(qū)域土壤的有機(jī)肥處理脲酶明顯高于無機(jī)肥處理；無機(jī)肥處理的土壤酸性磷酸酶平均為23.10 U·L-1，有機(jī)肥處理的土壤酸性磷酸酶平均為26.82 U·L-1，化肥配施有機(jī)肥處理的土壤酸性磷酸酶平均為28.63 U·L-1，除黔西南外，其他區(qū)域的化肥配施有機(jī)肥處理土壤酸性磷酸酶活性明顯高于無機(jī)肥處理；無機(jī)肥處理的土壤蔗糖酶平均為14.47 mg·g-1·min-1，有機(jī)肥處理的土壤蔗糖酶平均為17.08 mg·g-1·min-1，化肥配施有機(jī)肥處理的土壤蔗糖酶平均為19.62 mg·g-1·min-1，各區(qū)域（除遵義外）的化肥配施有機(jī)肥處理土壤蔗糖酶活性均明顯高于其他施肥處理?；逝涫┯袡C(jī)肥處理的所有酶活性變異系數(shù)均小于其他施肥處理，有機(jī)肥處理變異系數(shù)除蔗糖酶活性外其他酶活性均小于無機(jī)肥處理。

2.3 不同施肥處理對土壤微生物OTUs的影響

2.3.1 不同施肥處理對土壤微生物總OTUs數(shù)量的影響

有機(jī)肥處理的土壤微生物的OTUs顯著高于無機(jī)肥處理（圖1），比無機(jī)肥處理增加27.63%。

圖1 施肥模式對土壤微生物OTUs總量的影響Fig.1 Effect of fertilization mode on total amount of OTUs in soil microorganism

2.3.2 不同施肥處理對特有土壤微生物OTUs數(shù)量的影響

有機(jī)肥處理土壤微生物特有OTUs數(shù)量比化肥配施有機(jī)肥處理增加43.55%（圖2），是無機(jī)肥處理的2.48倍，化肥配施有機(jī)肥處理土壤微生物特有OTUs數(shù)量是無機(jī)肥處理的1.73倍。特有的OTUs數(shù)量占OTUs總量分別為21.17%（有機(jī)肥處理）、16.98%（化肥配施有機(jī)肥處理）和11.04%（無機(jī)肥處理）。

圖2 施肥模式對土壤微生物特有OTUs的影響Fig.2 Effect of fertilization mode on soil microbial characteristic OTUs

表3 施肥處理對土壤酶活性的影響Tab.3 Effects of fertilizer treatments on soil enzyme activity

2.4 不同施肥處理對土壤微生物屬水平的聚類分析

有機(jī)肥處理與化肥配施有機(jī)肥處理在屬水平聚類關(guān)系最近（圖3），無機(jī)肥處理與其他兩種施肥處理關(guān)系較遠(yuǎn)。無機(jī)肥處理的Gemmatimonadetes屬微生物OTUs豐度高于其他施肥處理，有機(jī)肥處理的micromonospora屬微生物OTUs豐度高于其他施肥處理，化肥配施有機(jī)肥處理sulfuritalea、Sphingobium屬微生物OTUs豐度明顯高于其他施肥處理。

圖3 不同施肥處理下各產(chǎn)區(qū)土壤微生物OTUs豐度聚類圖Fig.3 Cluster diagram of soil microbial OTUs abundance in different producing areas under different fertilizer treatments

2.5 不同施肥處理對土壤微生物門水平物種豐度的影響

由圖4、5中可以看出前10種優(yōu)勢微生物的豐度分布，全省范圍來看有機(jī)肥處理的變形桿菌門（proteobacteria）、酸桿菌門（acidobacteria）相對豐度高于其他處理，各施肥處理的放線菌門（Actinobacteria）相對豐度無明顯差異，無機(jī)肥處理的綠彎菌門（Chloroflexi）相對豐度相對高于其他施肥處理，化肥配施有機(jī)肥處理的擬桿菌門（Bacteroidetes）微生物相對豐度高于有機(jī)肥處理和無機(jī)肥處理，無機(jī)肥處理的芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和硝化螺旋菌門（nitrospirae）相對豐度較高，各施肥處理螺旋體菌門（saccharibacteria）和疣微菌門（verrucomicrobia）相對豐度差異不大。各區(qū)域（除遵義外）的有機(jī)肥處理的變形桿菌門（proteobacteria）相對豐度比無機(jī)肥處理高，遵義、畢節(jié)和黔東南區(qū)域的有機(jī)肥處理酸桿菌門（acidobacteria）相對豐度高于無機(jī)肥處理。

圖4 不同施肥處理下貴州省土壤微生物門水平上的物種相對豐度分布Fig.4 Relative abundance distribution of soil microbial population in phylum level in Guizhou Province under different fertilizer treatments

圖5 不同施肥處理下不同區(qū)域微生物門水平上的物種相對豐度分布Fig.5 Relative abundance distribution in different regions under different fertilizer treatments

3 討論

不同的施肥處理主要影響土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮等指標(biāo)，貴州省15個試驗(yàn)點(diǎn)通過連續(xù)3年的不同施肥處理后，有機(jī)肥處理的pH值顯著高于無機(jī)肥處理，其pH值比無機(jī)肥處理提高6.89%，表明長期施用有機(jī)肥可有效緩解土壤酸化[21]，同時無機(jī)肥處理的微酸性土壤占樣品總數(shù)的75%，由于土壤pH值與土壤抑病性呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，因此長期施用無機(jī)肥的土壤易導(dǎo)致土傳病害的爆發(fā)[22-23]。經(jīng)過3年定點(diǎn)施肥處理，有機(jī)肥處理可以提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，同時其全氮含量與無機(jī)肥處理之間無明顯差異，這與Liu等的研究結(jié)果基本一致[24]。

長期不同施肥處理對土壤的酶活力影響差異較大，本研究發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥（有機(jī)肥和化肥配施有機(jī)肥處理）可明顯提升脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，而無機(jī)肥處理主要提高過氧化氫酶活性。Nayak等[25]研究表明堆肥+化肥處理脫氫酶和脲酶活性明顯高于化肥處理，Poll等[26]也報道施用農(nóng)家肥顯著提高土壤團(tuán)粒的蔗糖酶活性，長期施用有機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)配施均顯著提高土壤脲酶、蔗糖酶以及堿性磷酸酶活性[27]，化肥處理只會顯著提高土壤過氧化氫酶活性[28]，但也有研究發(fā)現(xiàn)生物炭與氮肥配施能夠提高過氧化氫酶的活性[29]，主要原因是本研究采用的有機(jī)物料為發(fā)酵完全的有機(jī)肥，土壤微生物的利用機(jī)制與生物炭顯著不同，進(jìn)而導(dǎo)致土壤過氧化氫酶活性表現(xiàn)存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥可以明顯提高OTUs數(shù)量，尤其是特有微生物的OTUs數(shù)量，有機(jī)肥處理特有的OTUs數(shù)量占OTUs總量的21.17%，高于化肥配施有機(jī)肥處理（16.98%）和無機(jī)肥處理（11.04%），這可能由于有機(jī)肥為微生物提供充足的碳氮營養(yǎng)及其他營養(yǎng)進(jìn)而增加其土壤特有微生物的數(shù)量[30]。研究還發(fā)現(xiàn)三種施肥處理共有OTUs數(shù)量占無機(jī)肥處理OTUs總量的66.02% ，這也說明無機(jī)肥處理的土壤微生物群落容易失衡，種群趨于單一化[31]，土壤微生物群落多樣性、均勻度降低[32]。

土壤微生物OTUs水平聚類分析能夠揭示不同處理間的相似或差異性[16]，本研究通過對不同施肥處理對土壤微生物屬水平的聚類分析發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥處理與化肥配施有機(jī)肥處理關(guān)系最近，無機(jī)肥處理關(guān)系與其他兩種施肥處理比較遠(yuǎn)，進(jìn)而表明有機(jī)肥對微生物群落的影響要大于無機(jī)肥對其的影響[9]，因此可以利用有機(jī)肥改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[10]，有機(jī)肥加入特定功能菌株制成生物有機(jī)肥調(diào)控根際土壤微生物數(shù)量、群落功能多樣性和結(jié)構(gòu)多樣性[11]，再結(jié)合綜合防控措施平衡根際土壤微生物群落進(jìn)而使煙草土傳病害發(fā)病率顯著下降[12]。本研究發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥的處理土壤微生物屬水平上優(yōu)勢微生物豐度種類要少于無機(jī)肥處理（圖3），進(jìn)一步說明施用有機(jī)肥后的土壤微生物群落平衡性要好于只施用化肥的[16]。

土壤功能微生物的多少直接表征土壤營養(yǎng)轉(zhuǎn)化能力以及抗病能力[33]，從圖4中我們發(fā)現(xiàn)，純有機(jī)肥處理的變形桿菌門（proteobacteria）、酸桿菌門（acidobacteria）相對豐度相對高于其他處理。變形桿菌門主要具有固氮功能，變形桿菌門的增多有利于土壤氮素的有效轉(zhuǎn)化[34]，酸桿菌門主要是降解動植物殘體以及參與鐵載體的循環(huán)，酸桿菌門的增多可以一定程度加速土壤微生物鐵載體的循環(huán)，促進(jìn)植物誘導(dǎo)抗性反應(yīng)[35]。前人研究發(fā)現(xiàn)通過添加微生物鐵載體（pseudobactin）處理水稻，可限制稻瘟病菌的進(jìn)一步擴(kuò)散，提高水稻抗病性[36]，也有研究表明有益微生物可通過釋放鐵載體，限制了病原菌的生長[37]，降低了土傳病害的發(fā)生[38]。純無機(jī)肥處理的硝化螺旋菌門（nitrospirae）相對豐度相對高于其他施肥處理，其作為硝化細(xì)菌可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，故而增加土壤硝酸根含量，容易導(dǎo)致土壤的鹽漬化和酸化[39]。

4 結(jié)論

通過長期的有機(jī)肥施用可以緩解土壤酸化、增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、提升土壤的酶活性，有機(jī)肥和化肥配施有機(jī)肥兩種施肥處理均能改善土壤微生物群落的平衡性和豐富度。