李晶晶，史宏志，楊興有，周駿，白若石，秦艷青，陽葦麗

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95號(hào) 450002；

2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京市通州區(qū)萬盛南街99號(hào) 100024；

3 四川省煙草公司，成都市高新區(qū)世紀(jì)城路936號(hào) 600041；

4 四川省煙草公司達(dá)州市公司，達(dá)州市達(dá)川區(qū)七里溝 635000

近年來，由于國(guó)際控?zé)煹挠绊懞蛧?guó)內(nèi)消費(fèi)升級(jí)的提速，具有香氣醇厚豐滿、滿足感強(qiáng)、有害成分含量低等特點(diǎn)的雪茄煙異軍突起，為廣大消費(fèi)者所接受，具有良好的市場(chǎng)發(fā)展前景[1]。雪茄煙由茄衣、茄套和茄芯三部分組成[2]，其中茄芯是雪茄煙的核心組分，對(duì)雪茄口味的貢獻(xiàn)率可達(dá)65%～70%[3]，決定了雪茄煙吸食過程中的香味風(fēng)格和整體層次[4]。目前，我國(guó)主要的雪茄芯葉產(chǎn)區(qū)有四川德陽、達(dá)州、海南儋州、湖北來鳳[5]。發(fā)酵是雪茄煙葉特有的初加工工藝，調(diào)制后的新煙需經(jīng)過3～5周的高溫發(fā)酵和18～36個(gè)月的醇化來改善煙葉品質(zhì)[6]。但同時(shí)發(fā)酵也是煙葉中一類重要有害物質(zhì)煙草特有亞硝胺（TSNAs）產(chǎn)生和積累的重要時(shí)期，初步分析表明，發(fā)酵后雪茄煙葉的TSNAs含量比發(fā)酵前的煙葉大幅升高[7-8]。關(guān)于TSNAs的形成規(guī)律和機(jī)理，在其他類型煙草中已有較為系統(tǒng)的研究，主要是煙葉調(diào)制和貯藏過程中生物堿類物質(zhì)與亞硝基反應(yīng)生成的復(fù)合物[9-10,11,12]。在雪茄煙發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度、濕度是影響煙葉質(zhì)量變化的關(guān)鍵因素，同時(shí)也會(huì)對(duì)煙草特有亞硝胺的形成產(chǎn)生互作影響，但目前該方面研究較為欠缺。本研究通過在人工控制條件下設(shè)置不同發(fā)酵溫度與濕度互作試驗(yàn)，分別在發(fā)酵前后取樣，探究環(huán)境溫度和濕度對(duì)煙葉TSNAs形成的影響，以明確不同因子對(duì)雪茄芯葉發(fā)酵過程中TSNAs形成的貢獻(xiàn)，為抑制發(fā)酵過程中TSNAs的形成與積累提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為傳統(tǒng)雪茄芯葉什煙1號(hào)。供試煙葉為四川省煙草公司提供的2017年調(diào)制后質(zhì)量均勻一致的上一等級(jí)煙葉。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地點(diǎn)位于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草栽培實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)設(shè)置發(fā)酵溫度和發(fā)酵濕度2個(gè)因素，發(fā)酵溫度設(shè)置39℃、42℃、45℃和48℃ 4個(gè)水平，發(fā)酵濕度設(shè)置70%、80%和90% 3個(gè)水平，共12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)三次。

取樣：自發(fā)酵之日開始取樣，每隔4天取樣一次，至20 d后結(jié)束發(fā)酵取完發(fā)酵后樣品為止。取得的樣品冷凍干燥后磨碎過孔徑0.25 mm的篩，留取混合樣品測(cè)定TSNAs及其前體物生物堿和硝酸鹽含量。

1.3 樣品測(cè)定方法

TSNAs含量由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPELC-MS/MS）法（SPE-LC: Spark Holland,Symbiosis Pico）；（MS/MS: AB Sciex triple quad 5500）[13]。

生物堿測(cè)定參照J(rèn)ack和Bush[14]的方法。

硝酸鹽含量測(cè)定采用戴亞和方力[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 2010，SPSS 22.0 與 Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉發(fā)酵前后4種TSNA及其總量的變化

2.1.1 發(fā)酵條件對(duì)煙葉4種TSNA含量的影響

圖1 不同發(fā)酵條件下煙葉4種TSNA含量變化Fig.1 Changes of 4 TSNA contents in tobacco leaves under different fermentation conditions

由圖1和表1可知，溫度相同時(shí)，4種TSNA含量隨環(huán)境濕度的增加顯著降低；同一濕度條件下，發(fā)酵后煙葉4種TSNA含量在39℃～42℃變化不大，42℃之后隨溫度的升高逐漸增加；在48℃-RH 70%條件下，NNN、NNK、NAB、NAT含量分別達(dá)到最大值2237.24 ng/g、155.66 ng/g、109.61 ng/g、2737.74 ng/g。相關(guān)分析結(jié)果表明，發(fā)酵過程中環(huán)境濕度與NNN、NNK、NAB、NAT的含量存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，貢獻(xiàn)率分別為38.10%、70.31%、48.39%和48.79%，其中對(duì)NAT的影響達(dá)到極顯著水平。溫度主要影響了NNN和NNK的積累，對(duì)其含量的貢獻(xiàn)率達(dá)37.08%和48.48%。二者的交互作用對(duì)四種TSNA的影響較小。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行逐步回歸分析（表2），結(jié)果顯示在本試驗(yàn)條件下，發(fā)酵過程中4種TSNA含量變化的91.01% ～ 99.03%可由發(fā)酵溫度和濕度共同揭示。

2.1.2 發(fā)酵條件對(duì)煙葉TSNAs總量的影響

由圖1-E可以看出，同一濕度條件下，各處理煙葉的TSNAs含量隨溫度的增加逐漸升高，而同一溫度條件下則隨著濕度的增加呈下降趨勢(shì)，此外，低于42℃條件下，TSNAs的含量變化比較緩慢，溫度超過42℃之后，隨溫度的升高煙葉TSNAs含量顯著增加，且增長(zhǎng)幅度隨濕度降低而升高。對(duì)各處理煙葉的TSNAs含量進(jìn)行相關(guān)分析（表1），結(jié)果顯示影響煙葉TSNAs含量的主要因素是發(fā)酵濕度，貢獻(xiàn)率為57.01%，其次是溫度，貢獻(xiàn)率28.33%，二者的交互作用僅為 14.66%。回歸方程 m=3461.67+315.28 t -1491.80 h +186.08 t2+392.20 h2-395.71 t*h（R2=0.9799），說明本試驗(yàn)條件下，發(fā)酵過程中TSNAs含量變化有97.99%歸因于溫濕度的作用。

表1 不同發(fā)酵條件煙葉TSNAs含量的相關(guān)系數(shù)及差異性分析Tab.1 Correlation coefficient and difference analysis of TSNAs content in tobacco leaves under different fermentation conditions

表2 不同發(fā)酵條件煙葉TSNAs含量的變化趨勢(shì)Tab.2 Variation of TSNAs content in tobacco leaves under different fermentation conditions

2.2 發(fā)酵條件對(duì)煙葉4種TSNA及其總量的變化量

不同發(fā)酵條件下各處理煙葉4種TSNA及其總量均大幅增加（表3），且各處理間差異顯著。濕度相同時(shí)，隨溫度增加，煙葉4種TSNA及總TSNAs增加量顯著上升，同一溫度下隨濕度增加則表現(xiàn)為相反的變化趨勢(shì)?？俆SNAs含量在48 ℃-RH 70%時(shí)增加量最高，為 3913.46 ng/g，增幅294.96%，42 ℃ -RH 90%時(shí)最低，為182.82 ng/g，增幅13.78%，其余處理增幅多集中在40% ～100%。48℃-RH 70%條件下發(fā)酵的煙葉4種TSNA增加量最大，增幅在143.70% ～464.42%之間，其中NNN增幅最大，NNK增幅最小。變化幅度最低的處理是42℃-RH 90%，此條件下煙葉增幅不超過20%。

表3 煙葉發(fā)酵前后TSNAs變化量的方差分析Tab.3 Analysis of variance of TSNAs variation quantitybefore and after tobacco fermentation

表4 不同溫濕度條件發(fā)酵后煙葉生物堿和硝酸鹽含量Tab.4 Content of alkaloids and nitrate in tobacco leaves during the fermentation process under different temperature and humidity conditions %

2.3 不同溫濕度條件對(duì)生物堿和硝酸鹽含量的影響

表4顯示了不同溫濕度條件發(fā)酵后煙葉TSNAs的前體物生物堿和硝酸鹽的含量。由表可知，發(fā)酵后煙葉中的煙堿及生物堿總量隨溫度的增加先降低后升高，隨濕度的增加逐漸上升；硝酸鹽含量與TSNAs的變化規(guī)律相反，均表現(xiàn)為同一濕度條件下隨溫度的增加逐漸降低，而同一溫度條件下隨著濕度的增加呈上升趨勢(shì)，對(duì)各處理煙葉的生物堿總量和硝酸鹽含量進(jìn)行方差分析，除假木賊堿外，各處理差異均達(dá)到極顯著水平，且發(fā)酵溫度、濕度及其交互作用均對(duì)硝酸鹽含量的影響最大，其次是生物堿總量。

表5 不同溫濕度條件發(fā)酵后煙葉生物堿和硝酸鹽含量方差分析表Tab.5 Variance analysis of alkaloid and nitrate contents in tobacco leaves fermented under different temperature and humidity conditions

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵是雪茄煙葉獨(dú)特的調(diào)制后加工環(huán)節(jié)，也是雪茄煙TSNAs形成不容忽視的時(shí)期。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，發(fā)酵后煙葉TSNAs含量顯著增加，其前體物生物堿和硝酸鹽類物質(zhì)顯著減少，且隨發(fā)酵濕度的增加，煙葉TSNAs的增加量持續(xù)下降，各處理之間的差異達(dá)到極顯著水平，這與前人的研究結(jié)果一致[16]。相關(guān)分析等結(jié)果顯示，發(fā)酵濕度對(duì)煙葉TSNAs含量的影響最大，貢獻(xiàn)率達(dá)57.01%，結(jié)合TSNAs前體物生物堿和硝酸鹽含量的變化趨勢(shì)，推測(cè)可能是由于高濕環(huán)境下，煙葉中的硝態(tài)氮為水溶態(tài)而相對(duì)穩(wěn)定，不易生成揮發(fā)性亞硝酸鹽或NO等氣態(tài)氮氧化物，與生物堿反應(yīng)產(chǎn)生的TSNAs含量隨之減少。

基于雪茄煙堆垛發(fā)酵過程中容易產(chǎn)生高溫的情況，本文選取39 ～ 48℃溫度段進(jìn)行試驗(yàn)。研究結(jié)果表明，在3種環(huán)境濕度條件下，煙葉4種TSNAs及其總量均與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，隨著發(fā)酵溫度的升高顯著增加，這與SHI等[17]的研究結(jié)果一致。當(dāng)溫度低于42℃時(shí)，煙葉TSNAs含量積累緩慢，溫度超過42℃后，煙葉TSNAs含量顯著增加，這可能是由于高溫促進(jìn)硝酸鹽類物質(zhì)發(fā)生亞硝化反應(yīng)，進(jìn)而與生物堿反應(yīng)造成TSNAs累積，也可能是因?yàn)樵诟邷貤l件下促進(jìn)了硝態(tài)氮向氣態(tài)氮氧化物的形成。這也是我們下一步的研究重點(diǎn)。根據(jù)本試驗(yàn)的研究結(jié)果，在溫度低于45℃、濕度高于80%條件下發(fā)酵后煙葉TSNAs增加量較小，因此，適當(dāng)降低發(fā)酵溫度或增加發(fā)酵濕度是抑制發(fā)酵過程中TSNAs產(chǎn)生和積累的有效手段。