李桂琳，姜 艷，劉 林，李澤生,3，高 燕，郭彩留，周侯光*

（1.云南省德宏州熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南瑞麗678600；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院昆明650000；3.泉州市秉尚石斛科技有限公司，福建泉州362011；4.保山市隆陽區(qū)茶葉技術(shù)推廣站，云南保山678000）

石斛為蘭科Orchidaceac 石斛屬DendrobiumSwartz 附生植物，是蘭科最大的屬之一，約1 000種，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)至大洋洲。我國有74 種和2 變種，產(chǎn)秦嶺以南諸省區(qū)，尤其云南南部為多［1-2］。我國自上個世紀(jì)80 年代就開始研究和利用石斛，生物堿和多糖是石斛主要的活性成分，有明顯的免疫增強(qiáng)活性和抗癌活性，具有提高免疫力、抗氧化和抗腫瘤等多種作用。同時，其花期長，花色艷麗，具有較高的觀賞和藥用價值。近年來由于環(huán)境的惡化和原生境遭到破壞，一些石斛原生種已瀕臨滅絕，具有育種價值的石斛原生種種質(zhì)資源的收集難度越來越大；加之過度開采，石斛種質(zhì)資源破壞嚴(yán)重，野生石斛已瀕臨滅絕。在石斛種質(zhì)資源保護(hù)過程中，獲得種苗的途徑主要有野生苗、扦插苗和組培苗，其中組培苗的無菌播種是最快的方法，能夠在最短的時間內(nèi)獲得較多的種質(zhì)。獲得優(yōu)質(zhì)的種子是石斛組織培養(yǎng)育苗成功的關(guān)鍵，也是人工恢復(fù)資源的重要基礎(chǔ)。

目前關(guān)于石斛育種的相關(guān)研究報道較多，鄭寶強(qiáng)等［3］對中國原生種石斛蘭的育種價值進(jìn)行了分析，李振堅(jiān)等［4］報道了瀕危石斛蘭開花與授粉生物學(xué)特性，李永清等［5］研究了石斛蘭人工授粉結(jié)實(shí)性，龔建英等［6］報道了4 種石斛種間雜交、自交親和性及蒴果生長動態(tài)，羅煥明等［7］報道了6 種石斛屬植物的人工授粉，朱波等［8］報道了鐵皮石斛（D. Kimuraet Migo）花粉活力與種質(zhì)創(chuàng)制，高楊等［9］報道了鐵皮石斛自交和雜交親和性的細(xì)胞學(xué)研究，李景蕻等［10］研究了不同授粉方式對鐵皮石斛蒴果發(fā)育及種子萌發(fā)的影響，練強(qiáng)等［11］、李守領(lǐng)等［12］、李桂琳等［13］、耿秀英等［14］、高燕等［15］分別研究了齒瓣石斛（D.Paxt.）、金釵石斛（D.Lindl）、球 花 石 斛（D.Rchb. f.）、鼓 槌 石 斛（D.Lindl）的開花習(xí)性與人工授粉技術(shù)。為獲得更多品質(zhì)優(yōu)良的種源，有效保護(hù)瀕危種質(zhì), 并實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用，筆者選擇翅萼石斛、棒節(jié)石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛、黃花石斛，對其花器官形態(tài)和人工授粉技術(shù)進(jìn)行研究，以了解不同種石斛花器官特征，掌握其人工授粉技術(shù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下：

1 材料和方法

1.1 材料

從緬甸引入的翅萼石斛（D. cariniferumRchb.f.）、棒節(jié)石斛（D. findlayanumPar. et Rchb. f.）、玫瑰石斛（D. crepidatumLindl. ex Paxt.）、晶帽石斛（D. crystallinumRchb. f.）、黃花石斛（D. dixanthumRchb. f.），種植于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所石斛種質(zhì)資源圃（瑞麗）和梁河縣

1.2 方法

1.2.1 石斛花器官特性觀察

（1）石斛開花習(xí)性研究：觀察瑞麗與梁河不同種植環(huán)境下，5 種石斛花芽萌動期、現(xiàn)蕾期、始花期、盛花期、末花期、單花壽命、鮮花瓶插壽命。

（2）石斛花器官特性研究：顯微鏡觀察種植在瑞麗的5 種石斛花器官的合蕊柱長、寬、深、粘液厚；花粉粒長、寬、厚；10 ?；ǚ哿Ｖ亍?/p>

1.2.2 石斛人工授粉試驗(yàn)

參照金釵石斛人工授粉方法［13］，在選擇優(yōu)良母株的前提下，盛花期早晨10：00 前和下午4：00以后操作。授粉時，用牙簽輕輕挑開藥帽，牙簽輕沾花粉粒放到待授粉花朵的柱頭上，輕壓使其與柱頭緊密接觸。每節(jié)只授1～2 朵花，每束授粉不超過10 朵花，摘掉弱小花序和多余花朵，授粉后3 d 內(nèi)不澆水，雨天不授粉。

（1）蒴果的生長習(xí)性研究：觀察授粉后的花柄、花瓣、子房變化情況，描述授粉成功和失敗的區(qū)別，觀察形成蒴果的過程，觀測膨大期、伸長生長期、成熟期、采收期。

（2）蒴果形態(tài)特征研究：觀測果形、蒴果粒重、果直徑、果柄長、果長，顯微鏡觀察種子。分析蒴果的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

（3）花期對石斛坐果率的影響：從開花第1 d起至花謝為止，選擇生長旺盛、花朵大的花進(jìn)行自花授粉試驗(yàn)，研究花期對石斛坐果率的影響。以開花第1 d 為對照，試驗(yàn)設(shè)5 個處理，3 次重復(fù)，每個處理授粉100 朵花，觀察石斛坐果率，探索最佳授粉時間。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

（4）授粉方式對石斛坐果率的影響：以同株自花授粉為對照，試驗(yàn)設(shè)2 組處理，3 次重復(fù)，每組授粉100 朵花，觀察坐果率，探索授粉方式對石斛坐果率的影響。試驗(yàn)以同株自花授粉為對照，設(shè)2 種處理，3 次重復(fù)，處理1 為同株異花授粉，處理2 為異株異花授粉。

表1 花期對石斛坐果率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛花器官特性

2.1.1 開花習(xí)性

不同種石斛花期不一致，一般情況從花芽萌動到現(xiàn)蕾需要1 個月，現(xiàn)蕾到始花需要15～20 d，不同種石斛盛花期差異較大，花期長的盛花期長，如翅萼石斛花期有25～30 d，盛花期有3 個月；花期短的盛花期短，如棒節(jié)石斛花期7～8 d、玫瑰石斛7～8 d、晶帽石斛7～8 d、黃花石斛7～9 d，盛花期只有1 個月。同一種石斛受種植地溫度影響，開花時間也不一樣，溫度高的地方花期會提前10～15 d，溫度低的地方花期會稍晚10～15 d；如瑞麗年平均溫度21℃，梁河年平均溫度18.8℃，瑞麗冬季平均溫度比梁河高5～8℃，花期一般會比梁河種植的花期提前10～15 d（表2）。

2.1.2 花器官特性

5 種石斛屬植物的合蕊柱長1.85～3.58 mm，寬1.67～2.30 mm，深0.67～2.55 mm，粘液厚0.46～0.72 mm，花粉粒長1.37～2.63 mm，寬1.15～1.75 mm，厚0.44～0.51 mm，10 粒重0.0052～0.0165 g（表3）。從以上數(shù)據(jù)分析，參試石斛合蕊柱長寬全部大于花粉粒，粘液的厚度大于花粉粒厚，由此確定同一石斛的合蕊柱能夠容納下本種花粉粒，粘液覆蓋花粉粒。

表2 不同品種石斛開花習(xí)性

表3 不同品種石斛花器官的形態(tài)特征

2.2 石斛坐果習(xí)性

2.2.1 蒴果生長習(xí)性

蒴果生長習(xí)性同羅煥明和李桂琳［21-22］的描述，若授粉失敗，4～5 d 后花瓣萎蔫，子房變黃，7 d 后花柄脫落；若授粉成功，7 d 后花柄不脫落，子房變綠膨大，15 d 以后形成蒴果，15～25 d 迅速增大，之后趨于緩和，30 d 后蒴果穩(wěn)定生長，伸長生長期約120 d。不同品種蒴果成熟期不一樣，黃花石斛只有30 d，11 月蒴果全部開裂，若不及時采收將失去利用價值。翅萼石斛的成熟期較長，有90～120 d，采收期在翌年1-2 月。其它品種的成熟期60 d，采收期棒節(jié)石斛10-11 月，玫瑰石斛為11 至翌年2 月，晶帽石斛為1-2 月（表4）。

表4 不同品種石斛坐果習(xí)性

2.2.2 蒴果形態(tài)特征

不同種石斛蒴果形狀不一，翅萼石斛長圓形具3 菱，棒節(jié)石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛紡錘形，黃花石斛細(xì)長紡錘形，蒴果形態(tài)數(shù)據(jù)詳見表5。參試種石斛蒴果重0.42～13.92 g，果直徑3.84～26.8 mm，果 柄 長0.82.15～4.15 cm，果 長5.4～8.21 cm，果皮厚0.56～7.3 mm，翅萼石斛最大、最重，黃花石斛細(xì)長最小、最輕；同一種石斛蒴果大小受母株長勢影響較大，粗壯的蒴果飽滿、種子成熟，細(xì)弱的蒴果小、種子發(fā)育不全，甚至有空果。單果種子無數(shù)粒，有黃色、綠黃色和淡黃色，肉眼觀察粉狀，顯微觀察整粒種子紡錘形，種胚橢圓形淡黃色，外包透明的種皮?？梢杂米儺愊禂?shù)來衡量蒴果的整齊度,不同種蒴果的重量變異系數(shù)最小為13.08%，最大為34.89%，表明同一種石斛蒴果和不同種石斛蒴果的重量差異較大；不同種蒴果的果直徑變異系數(shù)最小為6.09%，最大為13.81%，其中只有棒節(jié)石斛和玫瑰石斛超過10%，而且在14%以內(nèi)，表明不同種石斛蒴果的果直徑在種內(nèi)保持較好的一致性；不同種蒴果的果柄長變異系數(shù)最小為12.85%，最大為21.76%，表明同一種石斛蒴果和不同種石斛蒴果的果柄長差異較大；不同種蒴果的果長變異系數(shù)最小為5.96%，最大為11.62%，表明同一種石斛蒴果和不同種石斛蒴果的果長在種內(nèi)一致性較好；不同種果皮厚變異系數(shù)最小為18.86%，最大為34.71%，表明同一種石斛蒴果和不同種石斛蒴果的果皮厚差異較大。

表5 蒴果形態(tài)特征

2.2.3 花期對石斛坐果率的影響

花期對石斛坐果率的影響較大，花期長的授粉期限長，花期短的授粉期限短（表6）。如翅萼石斛花期有25～30 d，其授粉期限有20 d，1～20 d 的坐果率在22.33%～54.67%，其中第10 d 授粉效果較好，第25 d 以后授粉效果最差；黃花石斛的花期有7～9 d，其授粉期限有5 d ，1～5 d 的坐果率在35.67%～79.00%，其中第1～3 d 授粉效果較好，第6 d 以后授粉效果最差；棒節(jié)石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛的花期有7～8 d，其授粉期限有4 d，1～4 d 的坐果率分別為棒節(jié)石斛55.00%～86.67%，玫瑰石斛56.67%～89.00%，晶帽石斛72.67%～87.00%，其中棒節(jié)石斛第1～3 d 授粉效果較好，第5 d 以后授粉效果最差；玫瑰石斛第1～2 d 授粉效果較好，第5 d 以后授粉效果最差；晶帽石斛第1～4 d 授粉效果較好，第5 d 以后授粉效果最差。從總體數(shù)據(jù)來看，同一種石斛不同花期坐果率差異較大，不同種石斛之間的差異也大，參試種石斛的授粉坐果率均處于較高水平。

表6 不同品種石斛不同花期坐果率（LSD法多重比較）

2.2.4 授粉方式對石斛坐果率的影響

翅萼石斛同株自花授粉、同株異花授粉、異株異花授粉坐果率分別為51.67%、57.67%、67%，方差分析結(jié)果（表7），異株異花授粉效果最好。玫瑰石斛同株自花授粉、同株異花授粉、異株異花授粉坐果率分別為93.33%、81.33%，57.33%，方差分析結(jié)果，自花授粉效果最好，其次是同株異花授粉，最差是異株異花授粉。棒節(jié)石斛同株自花授粉、同株異花、異株異花授粉坐果率分別為73%、80.67%、89.67%；晶帽石斛同株自花授粉、同株異花授粉、異株異花授粉坐果率分別為87.33%、94.33%，81.67%；黃花石斛同株自花授粉、同株異花、異株異花授粉坐果率分別為75.33%、73.33%、74%。方差分析結(jié)果，3 種石斛3種授粉方式的坐果差異不大，可以根據(jù)需要選擇授粉方式。從總體數(shù)據(jù)來看，5 種石斛的3 種授粉方式的坐果率都處于較高水平，授粉過程中可以根據(jù)實(shí)際需要選擇授粉方式。人工授粉蒴果畸形率1%～11%，其中自花授粉畸形率1%～5%，同株異花授粉畸形率1%～8%，異株異花授粉畸形率2%～11%。

表7 不同石斛不同處理坐果率（LSD法多重比較）

3 結(jié)論

從總體數(shù)據(jù)來看，參試種石斛的授粉坐果率都處于較高水平，同一種石斛不同花期坐果率差異較大，不同種石斛之間的差異也大；花期對石斛坐果率的影響較大，翅萼石斛花期較長，開花第5～10 d 授粉效果最好，開花第1 d 柱頭的粘液分泌較少，影響了花粉與合蕊柱的親和力，開花20 d 以后不建議人工授粉；棒節(jié)石斛、玫瑰石斛、晶帽石斛和黃花石斛人工授粉坐果率較高，1～4 d 授粉效果較好，第5 d 以后不宜人工授粉。5種石斛3 種授粉方式的坐果率都處于較高水平，授粉過程中可以根據(jù)實(shí)際需要選擇授粉方式。翅萼石斛和棒節(jié)石斛異株異花授粉效果最好，人工授粉最好采用異株異花授粉；玫瑰石斛、晶帽石斛和黃花石斛異株異花、同株自花授粉和同株異花授粉的差異不明顯，育種時根據(jù)需要選擇不同的授粉方式。建議石斛人工授粉最好在盛花期進(jìn)行。

同時對石斛屬的金釵石斛（D. nobileLindl.）、密花石斛（D. densiflorumLindl.）、小 黃花石斛（D. jenkinsiiLindl.）、美花石斛（D. loddigesiiRolfe）、串珠石斛（D. falconeriHook.）、兜唇石斛[D. aphyllum（Roxb.）C. E. Fischer]、長蘇石斛（D. brymerianumRchb. f.）、流蘇石斛（D. fimbriatumHook.）等開展同樣試驗(yàn)，其中密花石斛、小黃花石斛、美花石斛、串珠石斛都未有坐果，兜唇石斛最高坐果率只有12.44%、長蘇石斛23.5%、流蘇石斛10.38%、金釵石斛14%～71%。

李振堅(jiān)等［4］報道大苞鞘石斛（D. wardianumWarner）株內(nèi)、株間的自花授粉結(jié)實(shí)率均為80.95%，晶帽石斛株內(nèi)、株間自花授粉結(jié)實(shí)率為5.49% 和0，鼓槌石斛、兜唇石斛、流蘇石斛（D.Hook.）、齒瓣石斛的株內(nèi)自花授粉結(jié)實(shí)率為0，株間自花授粉結(jié)實(shí)率為94.44%、100%、61.90%、23.86%。李永清等［5］報道棒節(jié)石斛同株異株異花授粉坐果率為50%～53%，鼓槌石斛異株異花、同株異花授粉結(jié)實(shí)率分別為53.3%和0、細(xì)莖石斛[ D.（L.）Sw. ]同株異花授粉坐果率為0。

以上數(shù)據(jù)可見，同一種石斛在不同授粉方式、不同授粉人、不同授粉時間等，其人工授粉結(jié)果都不一樣。不同種石斛，有的種不論何種方式和任何人授粉，其坐果率都較高，有的種無論采取何種方式都不會坐果，有的種的坐果率都較低。對石斛人工授粉是否坐果，授粉時間和授粉方式只是提高坐果率的方法，是否坐果關(guān)鍵還要看此種石斛自身的親和性。

為此，筆者又從不同種石斛花器官特性進(jìn)行研究，結(jié)果同一種石斛柱頭長寬全部大于花粉粒，粘液的厚度大于花粉粒厚。由此確定，同一種石斛柱頭能夠容納下本種的花粉粒，粘液覆蓋花粉粒。從花器官特性找出影響石斛自身親和性的關(guān)系也不大，具體原因有待后續(xù)研究尋證。