張坤，孫秀芹

（1.濟寧醫(yī)學(xué)院 研究生院，山東 濟寧 272000；2.濟寧市第一人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，山東 濟寧 272100）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是育齡婦女最常見的生殖內(nèi)分泌疾病，根據(jù)在中國10個省進行的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，19～45 歲的中國漢族婦女中該病的發(fā)病率為5.6%[1]。PCOS 臨床表現(xiàn)呈高度異質(zhì)性，卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥、稀發(fā)或無排卵為其基本特征，并常伴有胰島素抵抗、肥胖及血脂異常等代謝綜合征，同時易并發(fā)子宮內(nèi)膜癌變、心血管系統(tǒng)疾病等遠期并發(fā)癥，給患者社會、心理及經(jīng)濟帶來嚴重負擔(dān)[2-3]。近年來隨著基因測序技術(shù)的迅速發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)microRNA（miRNA）在PCOS 患者與正常人群存在差異表達，因此miRNA 有望成為PCOS 早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，亦可能成為PCOS 的治療靶點[1]。本文就miRNA 與PCOS 相關(guān)性作一綜述，以期為進一步的病因研究及臨床診斷提供參考。

1 miRNA 的定義

miRNA 是經(jīng)過Dicer 加工之后的一類長約23 個核苷酸序列的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核細胞中，通過其位于5，端2～8 個特定的seed 核苷酸序列與靶mRNA 的3，非編碼區(qū)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平（降解mRNA 或阻遏翻譯）對基因進行表達調(diào)控，包括參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡及癌變等活動，在多種病理過程中扮演著重要角色[4]。通過用于miRNA 鑒定及分類的數(shù)據(jù)庫，已鑒定出1 527 種人類miRNA 并可至少調(diào)節(jié)30%的基因表達[2，5]。

2 miRNA 與卵泡發(fā)育異常

盡管PCOS 的臨床和生化指標(biāo)存在典型的異質(zhì)性，但卵泡發(fā)育異常被認為是其共同特征[2]?？p隙連接介導(dǎo)卵母細胞與顆粒細胞相連，顆粒細胞為排卵前卵母細胞的發(fā)育、募集、選擇提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑，顆粒細胞異常的增殖、凋亡勢必會影響卵母細胞的發(fā)育障礙，導(dǎo)致卵巢多囊樣改變[5]。

2.1 miRNA 在顆粒細胞中異常表達

XU 等[6]通過miRNA 芯片和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)鑒定PCOS 患者顆粒細胞中miRNA 譜與正常女性中的表達差異。結(jié)果顯示，在59 個miRNA 譜中，PCOS 患者有21 個miRNA 表達上調(diào)，38 個表達下調(diào)，這提示異常表達的miRNA參與了PCOS 的發(fā)生，并通過差異表達的miRNA 識別出主要與Notch 信號通路、PI3K/Akt 通路、Wnt通路有關(guān)。XUE 等[7]同樣利用基因芯片技術(shù)檢測到7 種miRNA 在顆粒細胞中呈差異性表達，7 個全部上調(diào)，無下調(diào)，并通過qRT-PCR 驗證指出miR-3188 和miR-3135b 表達明顯上調(diào)，并與促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）呈負相關(guān)，其中miR-3188 更與肥胖程度呈正相關(guān)。以上研究表明，miRNA 的表達失調(diào)可能與PCOS 的發(fā)生發(fā)展密切 相關(guān)。

2.2 特定miRNA 促進顆粒細胞增殖

死亡相關(guān)蛋白激酶1 是依賴Caspase-3 死亡信號通路中的一個調(diào)節(jié)因子，在細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，還可激活JAK2/STAT3 等多種有絲分裂和抗凋亡信號通路協(xié)同增強細胞凋亡[8]。此外，死亡相關(guān)蛋白激酶1 還可觸發(fā)PI3K/Akt 和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）信號通路的激活，參與顆粒細胞的凋亡[9]。PCOS 患者顆粒細胞中高表達的miR-141-3p 作用于靶基因死亡相關(guān)蛋白激酶1 的3，-UTR 位點，導(dǎo)致死亡相關(guān)蛋白激酶1 mRNA 及蛋白表達降低，從而促進顆粒細胞增殖[10]。

轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒O1（factor forkhead box O1,FOXO1）是miR-183-96-182 簇靶基因，其編碼蛋白可降低細胞增殖速率并促進細胞周期轉(zhuǎn)變，利用siRNA 選擇性敲除該簇可通過上調(diào)叉頭盒蛋白來降低顆粒細胞的增殖，PCOS 患者顆粒細胞中高表達的miR-183-96-182 簇明顯抑制FOXO1 mRNA 及蛋白水平，促使顆粒細胞增殖，并向S 期轉(zhuǎn)換，影響卵泡發(fā)育導(dǎo)致排卵障礙[11]。miR-183-96-182 簇抑制物可降低顆粒細胞增殖的相對速率，類似的結(jié)果在乳腺癌細胞中也有報道[12]。

Notch 信號通路因該基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成缺刻而得名，在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調(diào)節(jié)細胞、組織、器官的分化和發(fā)育，可與絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivation protein kinase,MAPK）/ERK 信號通路協(xié)同，是許多細胞過程中廣泛使用的信號途徑，包括細胞遷移、黏附、增殖與凋亡[13]。Notch 3 和MAPK 3 的mRNA 和蛋白表達與miR-483-5p 呈負相關(guān)，顆粒細胞中高表達的miR-483-5p 與上述2 種基因3，UTR 相結(jié)合抑制蛋白表達，進而促使顆粒細胞的增殖[14]。

除了高表達miRNA 可調(diào)控顆粒細胞增殖與凋亡外，低表達的miRNA 亦可激活顆粒細胞增殖通路。miR-145 可抑制細胞增殖并促進其凋亡，已被證實具有抑癌作用，在肝癌、胃癌、乳腺癌及視網(wǎng)膜母細胞瘤中被證實表達下調(diào)[4，15]。CAI 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS 患者顆粒細胞中低表達的miR-145 最終導(dǎo)致了顆粒細胞的異常增殖，其潛在機制與靶向抑制胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）有關(guān)。同時該研究還指出，高濃度的胰島素可進一步降低miR-145 的表達，上調(diào)IRS1 蛋白的表達，促進細胞增殖。此外，ZHONG 等[17]報道，PCOS 患者中表達下調(diào)的miR-19b 通過靶向結(jié)合并促進胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）表達，促進細胞周期蛋白D1和CDK1的表達來促進顆粒細胞增殖，同時，進一步驗證了胰島素可進一步降低miR-19b 的表達，促進細胞增殖。同時，GENG 等[18]報道，胰島素可以抑制miR-99a 的表達，尤其是在濃度超過80ng/ml 時，PCOS 患者低表達的miR-99a 抑制靶基因IGF-1R 蛋白的翻譯過程而非轉(zhuǎn)錄階段，阻止顆粒細胞凋亡。由此可見，低表達的miR-145、miR-19b 和miR-99a 促進了顆粒細胞的增殖，而高胰島素又導(dǎo)致其低表達，兩者相互關(guān)聯(lián)，形成惡性循環(huán)。此外，JIANG 等[19]研究指出，miR-324-3p 在PCOS 大鼠卵巢中的表達明顯降低，可通過靶向激活WNT2B 促進顆粒細胞增殖。

綜上所述，特定miRNA 在顆粒細胞中的異常表達，可導(dǎo)致顆粒細胞的異常增殖最終導(dǎo)致異常卵泡發(fā)育和卵泡過度形成，將為病因研究提供新的基礎(chǔ)。

3 miRNAs 與胰島素抵抗

機體在生理水平的胰島素下對葡萄糖的吸收和利用效能的下降稱之為胰島素抵抗，為維持相對正常的血糖水平機體代償性增加胰島素含量繼而形成高胰島素血癥[1]。高胰島素血癥除可能導(dǎo)致糖尿病、肥胖等并發(fā)癥外，還可作用于卵巢性激素合成通路的P450系統(tǒng)，影響雄激素合成的有關(guān)限速酶，使雄激素/雌激素比例失調(diào)，干擾卵泡發(fā)育[20-21]。

3.1 miRNA 影響GLUT4 的表達

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4,GLUT4）是胰島素敏感性蛋白，介導(dǎo)脂肪細胞葡萄糖的易化擴散，維持脂肪組織糖代謝穩(wěn)態(tài)，當(dāng)血糖水平較低時，GLUT4 被儲存在脂肪細胞內(nèi)，阻止GLUT4 到達細胞表面并將葡萄糖轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，反之當(dāng)血糖水平較高時GLUT4 在接收到胰島素產(chǎn)生的細胞內(nèi)信號后被轉(zhuǎn)運到細胞膜表面，導(dǎo)致葡萄糖的攝取，因此需要有足夠細胞內(nèi)保留和對胰島素刺激的快速反應(yīng)才能發(fā)揮其維持血糖穩(wěn)態(tài)的功能，與2 型糖尿病或PCOS 胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)[22]。YANG 等[23]利用定量PCR 技術(shù)顯示，在伴有胰島素抵抗的PCOS 小鼠模型中，miR-33b-5p 水平與健康對照組相比顯著高表達，且與通過免疫印跡技術(shù)得到的GLUT4 蛋白量呈負相關(guān)。高遷移非組蛋白2 基因可直接與GLUT4 的5'啟動子區(qū)結(jié)合促進其表達，也可通過結(jié)合基因間接促進GLUT4 表達。高表達的miR-33b-5p 通過靶向沉默高遷移非組蛋白2 進而減少GLUT4 表達，影響胰島素敏感性，導(dǎo)致血糖升高。相反，隨著miR-33b-5p 抑制劑濃度的增加，其表達水平逐漸下降，而高遷移非組蛋白2、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 及GLUT4 mRNA和蛋白水平呈濃度依賴性升高。同樣，XIAO 等[24]在RNA 雜交鼠脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)，高表達的miR-93 與GLUT4 3，UTR 末端結(jié)合位點相結(jié)合明顯抑制GLUT4基因轉(zhuǎn)錄從而阻遏GLUT4 蛋白表達。

3.2 miRNA 直接促進胰島素生成

miRNA 除可通過影響GLUT4 在脂肪細胞內(nèi)的表達升高血糖外，還可通過增加胰島素的釋放，來參與高胰島素血癥的發(fā)生。P85 蛋白是磷脂酰肌醇-3-激酶的調(diào)節(jié)亞基，在胰島素信號通路中發(fā)揮重要作用。LIU 等[25]實驗證實，PCOS 患者中miR-29 家族表達量下調(diào)與胰島素抵抗相關(guān)，AICAR 是一種可通透細胞膜AMP-activated protein kinase 的激活劑，通過下調(diào)miR-29 表達從而增加其靶基因P85的表達，增強卵巢組織中胰島素信號通路途徑，促進胰島素的釋放。IGF-1 是一種分子結(jié)構(gòu)類似于胰島素的多肽蛋白激素，通過與IGF-1 受體（跨膜受體）的結(jié)合可以發(fā)揮與胰島素類似的生物效應(yīng)，已被證明可以增加肝臟和肌肉對胰島素的敏感性。DONG 等[26]實驗發(fā)現(xiàn)，通過miR-122 模擬物放大miR-122 表達可通過直接靶向IGF-1 mRNA 的3'UTR 顯著下調(diào)IGF-1，當(dāng)miR-122靶向的IGF-1 3'UTR 位點發(fā)生突變時，這種效應(yīng)基本消除。提示miR-122 通過與IGF-1 的結(jié)合并抑制其表達，沉默了IGF1 的生理作用，降低了胰島素敏感性。同時，IGF-1 除可通過增加胰島素敏感性外，還可通過抑制糖異生過程來抑制高血糖[27]。表明miR-122 可通過不同維度造成胰島素抵抗及血糖升高。此外，與健康對照組及PCOS 非胰島素抵抗組患者相比，胰島素抵抗PCOS 患者血清中miR-320 表達水平下降，miR-320 可使IRS 表達降低進而抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）通路的磷酸化來調(diào)節(jié)胰島素抵抗[28]。而與之相矛盾的是，EL-SHAL 等[29]研究顯示miR-320 在PCOS 胰島素抵抗性脂肪細胞中的表達水平呈上調(diào)趨勢，這可能與PCOS 的異型性、對照組差異性等有關(guān)。因此，miR-320 在PCOS 患者中的表達差異以及參與胰島素抵抗和糖代謝的機制還需進一步證實。

綜上所述，miRNA 可通過影響GLUT4 在脂肪細胞內(nèi)的表達和增加胰島素釋放等不同方式途徑參與PCOS 患者胰島素抵抗高胰島素血癥的發(fā)生。

4 miRNA 與高雄激素血癥

在女性中，雄激素的生物合成主要發(fā)生在卵巢和腎上腺皮質(zhì)中，雄激素水平的增高和/或雄激素受體活性增強均可引起高雄激素血癥，進而抑制卵泡的生長和成熟，導(dǎo)致排卵不暢、多毛、痤瘡等臨床 癥狀[30]。

4.1 miRNA 可抑制芳香化酶表達

黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體屬于G 蛋白偶聯(lián)受體超家族，表達于卵泡膜細胞和顆粒細胞，在卵巢組織中，顆粒細胞與卵泡膜細胞各司其職，當(dāng)受到黃體生成素（luteinizing hormone,LH）刺激時，LH 通過黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體發(fā)揮作用[4]。卵泡膜細胞可生成關(guān)鍵酶來參與雄激素的生物合成，包括細胞色素P450-17α 酶（cytochrome P450 17α-hydroxylase,CYP17）、3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD）等，膽固醇在CYP11A 和CYP17 的催化下生成孕烯醇酮并進一步轉(zhuǎn)化為脫氫表雄酮，繼而在3β-HSD 的催化下生成雄烯二酮，成為雙氫睪酮及睪酮的前體，也可游離至顆粒細胞經(jīng)CYP19 轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫迹枷慊福╝romatase,CYP19）是細胞色素P450 酶系中的一種，可以催化雄烯二酮、睪酮脫去19 位碳并使A 環(huán)芳構(gòu)化，分別形成雌二醇和雌酮，它是雌激素生物合成的限速酶，其表達受到Creb1 的調(diào)控[1]。WANG 等[31]發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者高雄激素誘導(dǎo)miR-27a-3p 的表達，進而靶向抑制Creb1及其下游Cyp19a1基因的表達，抑制雌二醇的產(chǎn)生，造成雌激素和雄激素失衡。

此外，IGF1 還可通過促進促性腺激素釋放激素的表達來增強Gn 的釋放，并可協(xié)同LH 作用于卵泡膜細胞受體增加雄激素的表達，而IGF2 可協(xié)同F(xiàn)SH提高顆粒細胞芳香化酶的表達使雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，為卵泡的最終成熟提供支持[32]。PCOS 小鼠模型過表達的miR-186 可靶向促進IGF1 的表達而抑制IGF2 表達[33]。推測IGF1 的增殖通過促進雄激素生成、IGF2 的減少通過影響雌激素生成（卵泡晚期正反饋被削弱），共同作用于PCOS 的發(fā)生發(fā)展。

4.2 miRNA 可并聯(lián)高胰島素血癥及高雄激素血癥

盡管高胰島素血癥和高雄激素血癥是PCOS 的兩個主要特征，但兩者之間的因果關(guān)系仍存在爭議。在XUE 等[7]的實驗中，PCOS 患者中低表達的miR-92a可同時促進雄激素生成相關(guān)的CYP17基因以及胰島素生成相關(guān)的IRS-2基因的表達，造成雄激素以及胰島素分泌增加，這提示兩通路之間存在交叉，但具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，miRNA 可直接或間接影響雄激素合成限速酶導(dǎo)致激素失調(diào)，并與胰島素抵抗之間存在關(guān)聯(lián)，這將有助于進一步闡明高雄激素血癥與胰島素抵抗之間的關(guān)系。

5 miRNA 可作為PCOS 的生物標(biāo)志物

外周血miRNA 具有數(shù)量多、在血清中穩(wěn)定、具備抗核酸酶活性及易檢測等生理特性，可成為PCOS的無創(chuàng)性生物診斷標(biāo)志物，但因血清是由多種組織器官釋放的化學(xué)物質(zhì)所組成，確定其特異性細胞來源是相對較為困難的，且miRNA 進入血液循環(huán)的特定機制仍未明了[17]。

最近一項PCOS 患者和12 例健康女性、11 例健康男性（每組有6 名受試者肥胖）的病例對照研究顯示，血清中有6 個miRNA 在PCOS 患者中表達增加而對照組中降低。對激素水平進一步分析表明，睪酮水平僅與miR-153、miR-140-5p 呈正相關(guān)，提示miRNA 受肥胖與雄激素的影響，且表達水平隨肥胖及雄激素嚴重程度而增加[33]。SONG 等[34]選擇21 例PCOS 患者并挑選同數(shù)量與研究組年齡、體重指數(shù)相匹配的健康群眾進行橫斷面研究，微陣列分析PCOS血清表達譜發(fā)現(xiàn)miR-4522、miR-324-3p 及miR-6767-5p 表達下調(diào)＜0.67 倍，然后采用qRT-PCR 技術(shù)揭示只有miR-6767-5p 及miR-4522 在PCOS 中是顯著降低的，且與性激素結(jié)合球蛋白、月經(jīng)次數(shù)呈正相關(guān)，與空腹血糖呈負相關(guān)，GO 功能分析系統(tǒng)表明細胞周期、免疫系統(tǒng)與其相關(guān)。此外，借助于受試者工作特征曲線及曲線下面積進行敏感性分析表明，兩者的結(jié)合可區(qū)分PCOS 患者和健康對照組。

綜上所述，通過檢測血清中明顯改變的miRNA將成為PCOS 的一種新的診斷方式，或?qū)⒖商娲F(xiàn)行的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)或2018年中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會婦科內(nèi)分泌學(xué)所指定的最新診斷指南，無需依靠多項診斷指標(biāo)的疊加[35]。然而其缺點在于無法反應(yīng)卵巢基礎(chǔ)狀態(tài)，仍需進一步研究其作用及重要性。

6 總結(jié)

基于上述研究結(jié)果，miRNA 的異常表達確實與PCOS 的顆粒細胞異常增殖凋亡、胰島素抵抗、高雄激素血癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。然而，目前的研究還無法區(qū)分miRNA 表達的改變是PCOS 的原因還是結(jié)果，1 個miRNA 可能針對多個mRNA，而1 個mRNA 3'UTR 可能由不同的miRNA 調(diào)控，從而進一步復(fù)雜化了問題，并且，大多數(shù)的研究規(guī)模較小，多停留在生物信息學(xué)分析層面，甚至存在矛盾的研究結(jié)果。因此，隨著miRNA 分子生物學(xué)機制研究的逐漸深入，表觀遺傳機制以及PCOS 變異的miRNA 譜的闡明可深入了解這種高度異質(zhì)性疾病。因此，miRNA 作為一種新的PCOS 調(diào)控因子，是重要的候選基因，可在PCOS 的發(fā)病機制、病理生理學(xué)診斷和治療中提供新的思路。