李靜，苗龍，周文策,

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730000）

膽結(jié)石疾病是世界范圍內(nèi)的常見病。它在西方國家非常普遍，影響著超過10%的人口[1]，而在過去的幾十年里，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活方式、飲食習(xí)慣的西化，膽結(jié)石在我國的發(fā)病率已接近西方[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來出現(xiàn)了多種非培養(yǎng)的分子技術(shù)方法，包括16s RNA測序、宏基因組測序等；這些技術(shù)在人類微生物組研究中的應(yīng)用，使人們對人體微生態(tài)有了更加全面、深入的認(rèn)識[3]，消化道微生態(tài)與膽結(jié)石形成的關(guān)系也受到廣泛關(guān)注，使結(jié)石形成機(jī)制的研究進(jìn)入了微生物研究新階段。本文主要從消化道微生態(tài)在人體微生態(tài)中的地位、膽結(jié)石發(fā)病機(jī)制的研究概況、膽道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系及腸道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系幾個方面，針對消化道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 消化道微生態(tài)是人體微生態(tài)的重要組成部分

人體內(nèi)每個微生物棲息地都具有獨(dú)特的微生物群落，并且它們之間并不是相互隔離的[4]。之后發(fā)現(xiàn)不僅個體的菌群組成高度個性化，而且它們的時間變異性也具有明顯的個性化特征[5]。消化道微生態(tài)系統(tǒng)作為人體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，擁有人體微生物群落個體差異性、時間空間變異性等特點(diǎn)，且隨時間變化差異性較小，同時其個體差異性主要與遺傳因素相關(guān)[6]。

1.1 消化道微生態(tài)的特點(diǎn)

消化道為長腔型且不同部位生理功能不同，其微生物數(shù)量及優(yōu)勢菌群分布也存在差異。在消化道的不同部位，細(xì)菌的組成和數(shù)量是不同的，胃酸、膽汁和胰腺的分泌物會阻礙大多數(shù)細(xì)菌在胃和小腸近端定殖，在胃和十二指腸（10～103）、小腸（104～107）、大腸（1011～1012）中，大腸的菌群含量最高，占糞便質(zhì)量的60%[7]。除了沿胃腸道軸的菌群組成變化外，表面黏附菌群和管腔菌群也不同，黏膜表面的厭氧菌與好氧菌之比較腔內(nèi)低[8]。消化道微生物群參與多種機(jī)體功能，但其個體差異性大且多變的特點(diǎn)，導(dǎo)致其參與生理功能及疾病發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究明確。

1.2 消化道微生態(tài)與疾病的關(guān)系

眾多研究表明，消化道微生態(tài)失調(diào)與多種疾病相關(guān)：口腔微生物可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位[9]；膽道微生物參與膽結(jié)石的形成[10]，同時與膽道惡性腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[11]；腸道菌群失調(diào)與心血管疾病、肥胖[12]，糖尿病[13]、代謝綜合征[14]、非酒精性肝硬化（NAFLD）[15]、結(jié)直腸惡性腫瘤[16]、膽結(jié)石[17]等疾病之間可能存在直接聯(lián)系。與膽結(jié)石形成相關(guān)的消化道微生物群主要為膽道及腸道微生物群，且這兩者間存在密不可分的聯(lián)系。

2 膽結(jié)石發(fā)病機(jī)制的研究概況

膽結(jié)石的形成是一個復(fù)雜的遺傳和環(huán)境因素相互作用的過程。一項(xiàng)對雙胞胎的大型研究[18]表明，在有癥狀的膽結(jié)石患者中，基因?qū)Ρ硇偷呢暙I(xiàn)為25%，共有的環(huán)境因素占13%，獨(dú)特的環(huán)境因素占62%。近年來的研究[19-20]發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石的危險(xiǎn)因素包括：性別（女性）、年齡、懷孕、早產(chǎn)、缺乏運(yùn)動、肥胖和營養(yǎng)過剩，同時代謝綜合征（如糖尿病、甲亢等）的相關(guān)因素也增加了患膽結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)。

膽結(jié)石發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且不同成分類型的結(jié)石其形成機(jī)制不同。膽固醇結(jié)石的形成機(jī)制包括 5個方面，它們共同促進(jìn)膽固醇結(jié)晶和膽石形成：(1) 遺傳因素和造石基因；(2) 肝膽固醇分泌過多；(3)膽汁過飽和及快速相變；(4) 膽囊運(yùn)動減弱； (5) 腸道因素，包括腸道菌群因素。棕色素結(jié)石的形成機(jī)制包括：(1) 遺傳因素；(2) 肝臟膽紅素分泌過多；(3)膽汁淤積；(4) 細(xì)菌感染[21]。其中，細(xì)菌可能通過改變膽汁成分或減弱膽囊運(yùn)動功能參與結(jié)石形成[17]。

綜上所述，膽結(jié)石疾病為多因素作用的結(jié)果，膽固醇結(jié)石及膽色素結(jié)石的形成過程中均有微生物及其代謝產(chǎn)物參與，在此基礎(chǔ)上我們對消化道微生態(tài)與不同類型膽結(jié)石的形成關(guān)系的研究進(jìn)行整理歸納，以梳理其內(nèi)容并為未來的研究明確方向。

3 膽道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系

3.1 膽道微生物群參與膽結(jié)石形成的機(jī)制

早在一個世紀(jì)前就有學(xué)者[22]在膽結(jié)石患者的膽汁中培養(yǎng)出了多種細(xì)菌，推測膽道細(xì)菌感染可能參與結(jié)石的形成。50年后，Maki就細(xì)菌參與結(jié)石形成的機(jī)制提出了假說，即細(xì)菌產(chǎn)生的外源性β-葡萄糖苷酶（β-G）可將結(jié)合膽紅素水解為游離膽紅素和葡萄糖醛酸，游離膽紅素可與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成膽紅素鈣，為膽色素結(jié)石的主要成分[23]。該結(jié)論在以犬為模型的動物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)[24]。其后，有學(xué)者[25-27]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌黏液中的黏蛋白可通過相互凝集構(gòu)成的網(wǎng)狀支架將膽汁中的膽紅素鈣、棕櫚酸鈣沉淀，甚至將細(xì)菌微菌落聚集在一起而形成結(jié)石。Stewart等[26]通過檢測棕色色素結(jié)石患者膽道內(nèi)的細(xì)菌源性β-G和細(xì)菌黏液（檢測率分別為62%和100%），提出在結(jié)石形成過程中，細(xì)菌產(chǎn)生的黏液可能比β-G具有更重要的作用。Robins等[27]研究報(bào)道，膽道感染細(xì)菌所產(chǎn)生的磷脂酶，可以通過水解磷脂生成的棕櫚酸與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成不溶于水的棕櫚酸鈣沉淀，參與棕色素結(jié)石的形成。Shen等[28]采用WMS測序技術(shù)在膽總管結(jié)石患者感染的多種細(xì)菌中鑒定出了pldA基因，從基因水平證明細(xì)菌源性磷脂酶參與棕色色素結(jié)石的形成。以上眾多研究表明，膽道微生態(tài)在膽結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著重要作用，主要通過細(xì)菌代謝產(chǎn)生的β-G、黏蛋白及磷脂酶參與膽結(jié)石的發(fā)病，當(dāng)然仍有其他未知機(jī)制需要我們繼續(xù)探索。

3.2 膽道內(nèi)的微生物存在自我保護(hù)機(jī)制

多年來的傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，因膽汁的特殊理化性質(zhì)，如膽汁酸、營養(yǎng)限制、pH及滲透壓的變化均不利于細(xì)菌在膽道生長繁殖，導(dǎo)致正常膽道是無菌環(huán)境[29]。在發(fā)生膽道感染時，在膽道中定植的細(xì)菌存在著自我保護(hù)機(jī)制：(1) 細(xì)菌可通過形成抗原性弱的L型細(xì)菌（即細(xì)胞壁缺陷型變體）逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，使其可在膽道中長期生存，使膽道持續(xù)處于慢性炎癥狀態(tài)中[30]；(2) 細(xì)菌生物膜為黏附于細(xì)菌表面的組成復(fù)雜的聚集體，其組成包括：黏液、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及核酸等；細(xì)菌可通過形成生物膜保護(hù)包裹于其中的微生物，嵌入生物膜內(nèi)的細(xì)菌對宿主的免疫清除、抗生素以及機(jī)械應(yīng)力都具有高度抗性[31]。定植在膽道的細(xì)菌通過炎癥或改變膽道的運(yùn)動功能引起一系列膽道疾病。

3.3 膽道微生物的來源

膽道感染的細(xì)菌從何而來？眾多研究者進(jìn)行了探討。研究[10]采用16S rRNA擴(kuò)增子測序技術(shù)，對6例膽結(jié)石患者的膽道、十二指腸、胃和口腔的細(xì)菌群落進(jìn)行了研究。該研究首次在同一個體中進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有膽道細(xì)菌均可在上消化道檢出，膽道微生物群與十二指腸液樣本的相似度高于胃液或唾液樣本，支持了膽道細(xì)菌起源于腸道細(xì)菌逆行感染的假設(shè)。腸道細(xì)菌逆行感染到膽道（即腸膽反流）主要與Oddi括約肌的功能有關(guān)，Oddi括約肌的主要功能是控制膽汁排放、防止腸內(nèi)容物反流，當(dāng)其功能異常時，腸內(nèi)容物反流至膽道，從而導(dǎo)致膽道細(xì)菌感染[32]。除此之外還有血源性、易位性多種學(xué)說, 各有其證據(jù),也可能同時并存[17]。

近年來，隨著對膽道微生態(tài)研究的深入及焦磷酸測序的應(yīng)用，健康膽道無菌的觀點(diǎn)遭受了挑戰(zhàn)。Jiménez等[33]在健康豬的膽道發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌存在。隨后Molinero等[34]針對從無肝膽疾病的肝移植供體的膽汁進(jìn)行了分析，首次在沒有任何肝膽疾病的個體的膽汁中檢測到細(xì)菌群落。因此，我們可以認(rèn)為，膽道本身存在一個微生態(tài)系統(tǒng)，在膽道疾病致病因素的作用下，這個微生態(tài)系統(tǒng)的平衡受到干擾而失衡，如優(yōu)勢菌群變化、菌群多樣性降低、微生物代謝改變等，通過具體的致病機(jī)制引發(fā)疾病。

4 腸道微生態(tài)與膽結(jié)石疾病的關(guān)系

4.1 腸道微生物與膽結(jié)石的形成有關(guān)

Wu等[17]首次采用16S rRNA擴(kuò)增子測序（簡稱16S測序）技術(shù)對膽囊結(jié)石患者及健康者的膽汁及糞便進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)。Wang等[35]通過構(gòu)建小鼠膽固醇結(jié)石模型，得出數(shù)據(jù)顯示致石飲食（LD）喂食的小鼠腸道微生物的豐富度和多樣性降低。厚壁菌門以及厚壁菌門與擬桿菌門之比顯著降低。兩組間腸道菌群組成在門、科、屬水平上也存在差異。因此認(rèn)為腸道菌群失調(diào)可能與小鼠膽固醇結(jié)石的形成密切相關(guān)。有學(xué)者[36]發(fā)現(xiàn)，膽囊切除改變流向腸道的膽汁，從而改變膽汁酸與腸道微生物之間的作用關(guān)系，即膽囊切除術(shù)后患者結(jié)石復(fù)發(fā)率高可能與腸道菌群的改變有關(guān)。從人類樣本和小鼠模型樣本均得出腸道微生物群與膽結(jié)石的形成相關(guān)的結(jié)論，但仍需更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭游飳?shí)驗(yàn)來證明其正確性。

Maurer等[37]通過小鼠膽固醇結(jié)石模型探究T細(xì)胞功能在結(jié)石形成過程中的作用時，發(fā)現(xiàn)來自不同飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)的BALB/c小鼠，膽固醇結(jié)石患病率不同。Fremont-Rahl等[38]就該現(xiàn)象提出假設(shè)：這些差異可能是因?yàn)檫@兩個機(jī)構(gòu)之間的飼養(yǎng)條件明顯不同導(dǎo)致的。Fremont-Rahl等[38]為探究在這些密切相關(guān)的小鼠亞系之間觀察到的膽固醇結(jié)石患病率的顯著差異是否與胃腸道常駐微生物群有關(guān)，進(jìn)行了菌群移植實(shí)驗(yàn)，其數(shù)據(jù)表明宿主微生物群的差異改變了膽固醇膽結(jié)石表型的成分，并且主要通過炎癥和改變膽囊運(yùn)動功能來實(shí)現(xiàn)[38]。Fremont-Rahl等[38]通過更嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法再次證明腸道微生態(tài)參與膽結(jié)石的發(fā)病，并初步探討了其可能的發(fā)病機(jī)制。

4.2 腸道微生物參與膽結(jié)石形成的機(jī)制

針對腸道微生物通過何種途徑參與膽結(jié)石的形成，許多研究者為此進(jìn)行了探索。一項(xiàng)關(guān)于腸道菌群失調(diào)與膽固醇膽結(jié)石相關(guān)的細(xì)菌群落組成的大規(guī)模研究中發(fā)現(xiàn)，膽結(jié)石患者的大約70%腸道細(xì)菌在膽道中被檢測到。因此他們認(rèn)為腸道微生物可能通過逆行進(jìn)入膽道引起膽道感染誘發(fā)結(jié)石發(fā)生[17]。

吳碩東團(tuán)隊(duì)[39]發(fā)現(xiàn)在飲食誘導(dǎo)的金黃地鼠膽固醇結(jié)石模型中，出現(xiàn)了腸道運(yùn)輸（IT）功能下降，表明腸道功能在膽固醇結(jié)石形成過程中可能起著重要的作用。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步就豚鼠膽固醇結(jié)石形成過程中腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降的細(xì)胞和分子機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果提示高膽固醇飲食通過抑制c-kit/scf信號通路，導(dǎo)致豚鼠小腸卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞（ICC）數(shù)量減少和功能障礙，導(dǎo)致小腸自發(fā)性節(jié)律性收縮功能障礙及IT功能下降，這參與了膽固醇結(jié)石的形成[40]。

正常情況下，大多數(shù)腸道細(xì)菌位于腸腔和外黏液層。在某些病理情況下，腸道細(xì)菌可能會破壞腸道上皮，通過門靜脈到達(dá)肝臟，即腸道細(xì)菌向肝臟易位[41]。Ma等[42]在一項(xiàng)研究腸道微生物群促進(jìn)自身免疫性膽管炎的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群驅(qū)動肝臟細(xì)菌易位，通過Toll樣受體2（TLR2）參與自身免疫性膽管炎的發(fā)病。

Liu等[43]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在接觸有機(jī)氯農(nóng)藥的小鼠中，腸道微生物群豐度和組成發(fā)生了異常，說明腸道微生物群會受到食物中毒素的影響，可能與膽結(jié)石的發(fā)病有關(guān)。最近的研究[44]表明，經(jīng)腸道微生物代謝食物中的膽堿等產(chǎn)生的三甲胺-N-氧化物（TMAO）可作用于肝臟引起膽汁膽固醇高分泌參與膽結(jié)石形成，證明了微生物可以通過影響代謝來參與疾病的發(fā)生。

綜上所述，腸道微生物可能存在多種通路參與膽結(jié)石的形成：(1) 腸道細(xì)菌逆行至膽道引起膽道慢性炎癥；(2) 在膽結(jié)石致病因素的作用下，腸道屏障受損，腸黏膜通透性增加，腸道微生物通過門靜脈到達(dá)肝臟，發(fā)生細(xì)菌肝臟易位；(3)微生物隨肝臟分泌膽汁進(jìn)入膽道系統(tǒng)，破壞了膽道微生態(tài)的平衡，引起膽道感染從而誘發(fā)結(jié)石形成；(4) 易位到肝臟的微生物造成肝臟分泌膽汁的異常，膽汁代謝發(fā)生變化，如形成致石膽汁，從而引起膽結(jié)石形成；當(dāng)然，還需要進(jìn)一步更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭游锬Ｐ蛯?shí)驗(yàn)來驗(yàn)證以上假設(shè)。

5 小 結(jié)

越來越多的疾病的發(fā)生被認(rèn)為與消化道微生態(tài)有關(guān)，而消化道微生態(tài)參與膽結(jié)石的形成也逐漸被眾多研究者認(rèn)可。膽道中的微生物群存在自我保護(hù)機(jī)制，從而可以在膽道中長期生存，通過引起膽道慢性炎癥及微生物代謝產(chǎn)生的β-G、黏蛋白、磷脂酶等物質(zhì)誘導(dǎo)膽結(jié)石的產(chǎn)生。此外腸道微生物群通過逆行至膽道引起膽道感染、細(xì)菌易位、內(nèi)毒素血癥影響膽汁代謝等途徑參與膽結(jié)石形成。

消化道微生態(tài)參與膽結(jié)石形成的機(jī)制存在很大爭議，部分學(xué)者[45]認(rèn)為腸道微生物群可以影響宿主免疫系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)，但不會導(dǎo)致細(xì)菌移位或傳播，一定程度上否定了細(xì)菌易位學(xué)說。消化道微生物群落及其代謝產(chǎn)物容易受多種內(nèi)在及外界環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，因此，通過對糞便或膽汁中的菌群進(jìn)行16SrRNA擴(kuò)增子測序或代謝組學(xué)研究來表示腸道微生物群的多樣性，不一定與膽結(jié)石疾病表型相關(guān)，即這些實(shí)驗(yàn)并不能說明消化道微生態(tài)與膽結(jié)石發(fā)生的因果關(guān)系，這需要更多更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募S便移植實(shí)驗(yàn)來更好的說明。另外一個較大的挑戰(zhàn)是識別整個消化道微生態(tài)系統(tǒng)中某個微生物或微生物代謝物起到關(guān)鍵作用是很困難的。到目前為止，很多實(shí)驗(yàn)的結(jié)果仍然是描述性的，其背后的機(jī)制還需要進(jìn)一步了解。