吳敬智，繆著，馬波，劉馨

作者單位：650500 昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室（吳敬智、繆著、馬波、劉馨）；650106 昆明時光肌生物技術有限公司（馬波、劉馨）

近年來，隨著再生醫(yī)學的發(fā)展，細胞治療得到越來越多關注，冷凍保存方案在再生醫(yī)學和細胞治療方面有巨大潛力。冷凍保存是利用低溫保存結構完整的活細胞來實現(xiàn)后續(xù)細胞治療的迫切需要。目前冷凍保存技術的使用和生物庫行業(yè)的需求在不斷增加，迫切需要現(xiàn)代化和成熟的凍存手段來改善細胞凍存質量，為細胞治療提供保障。早期研究發(fā)現(xiàn)了解細胞凍存損壞機制和凍存條件對凍存效果至關重要。本文對懸浮細胞凍存機制、凍存過程中細胞骨架的受力和細胞器的損傷變化；影響懸浮細胞活性的凍存因素；以及造血干細胞、外周血單個核細胞和自然殺傷細胞的深低溫保存研究進展，細胞凍存后的生理生化特點進行綜述。

1 細胞凍存和復蘇基本原理

1.1 細胞凍存

低溫下，活細胞中的生物和化學反應都會大大降低，為細胞長期凍存提供了可能。冷凍對大多數(shù)活生物體都是致命的，細胞凍存是利用冷凍保護劑來降低冰點，緩慢凍結細胞的過程中，細胞內(nèi)水分透出細胞，使細胞凍結中冰晶形成減少，從而避免了由于冰晶形成對細胞中生命活性物質的一系列損傷。此外，細胞凍存的理論認為，細胞在低溫環(huán)境可以抑制細胞的呼吸和體內(nèi)相關酶的活性，降低細胞代謝，保持細胞遺傳特性[1]。

1.2 細胞復蘇

解凍程序會顯著影響凍存后細胞生存能力和細胞恢復，評估活性和活細胞回收率是評價方法性能的必要條件。解凍時間、洗滌介質、溫度、離心時間和離心力等都會影響凍存后細胞的復蘇[2]。①復蘇溫度：通常細胞的冷凍復蘇是放在 37 ℃ 水浴中快速化凍，融化到能看見少量冰存在時取出或者直接等冰全部融化。②洗滌液的溫度：Ramachandran 等[3]研究將冰冷的洗滌介質直接添加到融化的細胞中與將洗滌介質加熱到 37 ℃ 再添加相比，回收的外周血單核細胞（PBMC）的活力和功能明顯降低。Disis 等[4]在 PBMC 冷凍保存淋巴細胞保持其功能影響的研究中，洗滌液冷卻至 4 ℃ 時，平均生存力僅為（69.7 ± 12.5）%，在 25 ℃ 下為（92.55 ± 3.1）%，在 37 ℃ 下為（95.11 ± 2.5）%，因此，洗滌液預熱至 37 ℃ 能更好地保持細胞的活率。③洗滌介質的選擇：在洗滌介質中使用胎牛血清時，要考慮批次間生物學差異以及動物來源材料存在的風險。④離心力和離心時間：降低離心力和時間會產(chǎn)生更高的生存力和更低的活細胞回收率。

2 細胞凍存的損傷機制

2.1 細胞冷凍受力作用

細胞凍存損傷機制主要有細胞內(nèi)冰的形成（IIF）（即快速冷凍過程中細胞內(nèi)水的冰結晶）、細胞外冰的形成（EIF）和溶液效應（滲透壓梯度驅動的細胞緩慢冷凍時脫水）[5]，這些機制使細胞生理結構發(fā)生變化，從而導致細胞機械約束和損傷。細胞在凍存時面臨各種機械力作用，其中細胞膜和細胞骨架以及它們之間的相互作用是細胞自身調節(jié)和適應細胞不受破壞的關鍵因素。細胞膜上的蛋白復合體可以直接感應細胞內(nèi)滲透壓的變化，從而改變膜上蛋白和脂質體的相互作用，影響通道蛋白的開放和關閉，維持平衡[6]。膜骨架有抵抗機械力和保護細胞膜的作用，它為細胞膜提供結構支撐，能保持細胞反復變形中的完整性[7]，細胞應對外力的早期保護性反應中，細胞膜、膜骨架和整個細胞骨架通過相互作用交聯(lián)形成三級聚合體結構[8-9]，力作用于細胞時就會分布在各種細胞結構和位置上，通過多種方式來感知力并生成信號控制重塑過程，同時細胞內(nèi)也存在著具備感應機械力信號的細胞器[10]，如整合膜受體將機械刺激傳導入細胞，提高細胞保護性骨架蛋白的表達量[11]。其次，膜骨架在蛋白組成和結構上與多種跨膜蛋白鑲嵌在細胞膜上，具有限制膜蛋白和脂質活動的相互作用包括水/冰的相變而引起的 ECM 的體積膨脹與相鄰未冷凍 ECM 的壓縮，從冷凍界面到未冷凍 ECM 的組織液運輸以及細胞與 ECM 之間的機械應力/應變相互作用[12-13]。

2.2 細胞骨架的破壞

細胞骨架是一種超微網(wǎng)絡結構，由蛋白質纖維組成，它貫穿細胞，用于支持、運輸和運動。細胞骨架是低溫保存過程中損傷的靶點，懸浮細胞的低溫保存通常采用緩慢冷卻和快速升溫的方法。復雜細胞系統(tǒng)和簡單細胞懸浮液在對冷卻、升溫和脫水的反應方面的差異會影響保存質量。低溫保存過程中滲透應力和相變引起的潛在損傷是細胞間的緊密相互作用導致的[14]。如肌動蛋白作為動物細胞中三種細胞骨架之一，它為細胞質的許多力學性質提供了分子基礎，細胞質是一種復雜的粘彈性材料，肌動蛋白高度集中質膜下，富含肌動蛋白的層面控制著大多數(shù)動物細胞的形狀和表面 運動，對質膜的任何機械損傷可能破壞肌動蛋白[15]。所以了解細胞對冷凍過程的超微結構反應對于設計細胞的冷凍保存策略具有重要意義。Malpique 等[16]采用超高黏度海藻酸鈉凝膠包埋的低溫保存方法保存 Caco-2 和 N2a 細胞系，結果表明在海藻酸鈉層下的包埋可減少細胞解凍后膜的損傷和細胞的脫落，避免了從表面分離和細胞-細胞相互作用的破壞，提高了代謝活性和功能的恢復。

2.3 細胞器的損傷

在冷卻條件下，質膜可能是冷凍損傷的主要部位[17]，質膜提供了細胞內(nèi)外環(huán)境之間的物理分離，對質膜的損傷將導致質膜功能固有的屏障、門控和信號傳遞過程的中斷。受損的質膜和隨后的半滲透性喪失是細胞致命損傷的指標。兩種最常被考慮的低溫損傷類型是冰晶對細胞膜的直接或間接損傷和冰晶周圍未凍結部分的高溶質濃度影響，這可能導致細胞蛋白變性或脂質雙層膜損傷[18]，此外，脂質雙分子層膜本身在冷卻時會發(fā)生相變和結構變化[19-20]。其次，細胞間質內(nèi)含水分較多，組織疏松，密度較低，冰晶極易在細胞間質中形成冰晶，在疏松的細胞間質中滯留后，對細胞間質造成損傷。繼細胞間質受損后，線粒體開始受損，首先是 線粒體嵴被破壞，嵴消溶，而線粒體質膜卻保持完好，這 可能與線粒體內(nèi)的糖、脂肪和蛋白質的分解代謝有關。糖、脂肪和蛋白質在各自的分解代謝過程中，最終都有水形成，使線粒體內(nèi)含有較多的水分，因而當冷凍速率下降后，冰 晶極易在線粒體內(nèi)形成，對嵴產(chǎn)生擠壓損傷[21]。凍融引起的線粒體損傷，可能導致線粒體功能衰竭，可通過形態(tài)學改變、細胞外基質均勻性和密度降低、外膜破裂和顆粒消失來觀察[22-23]。溶酶體在冷凍后也會破裂，Huebinger[24]通過熒光顯微鏡對冷凍前后吖啶橙標記的 HeLa 細胞的溶酶體完整性進行檢測，這些細胞中有 90% 顯示了兩個或更少的溶酶體，其余 10% 的溶酶體數(shù)量也異常少，這表明在快速冷凍保存后溶酶體在細胞內(nèi)也會破裂。

3 懸浮細胞的凍存及其影響因素

3.1 懸浮細胞的凍存

細胞的懸浮凍存可以從外部冷凍介質的結冰和細胞對環(huán)境變化的反應來理解。首先，凍結水溶液時，水溶液中冰的形成導致溶質在殘余液體中的再分布；其次，懸浮細胞與固-液界面的相互作用可能會導致細胞立即被冰凍封裝，單個細胞在冷凍過程中有對不斷變化的環(huán)境的反應，如滲透性引起的失水可能導致細胞顯著收縮，若細胞內(nèi)有足夠的水，則可能發(fā)生細胞內(nèi)結冰，導致嚴重的細胞損傷。此外，通過測定受損細胞的百分比可以初步評價細胞的凍存效果[25]。文獻[26-27]所述，可以使用熒光分析檢測細胞的生存力，但熒光分析基本上只決定膜的完整性，并不表明功能特性和長期生存能力。凍存可能會影響細胞的功能和表型，但也存在以下優(yōu)勢：冷凍保存細胞的使用可以根據(jù)患者的臨床情況提供更多的計劃靈活性；產(chǎn)品質量可以在輸注前進行質量控 制測試來提高治療安全性；細胞的大規(guī)模商業(yè)應用目前還需要使用來自大型冷凍設施的冷凍保存[28]。

3.2 細胞凍存影響因素

細胞凍存受很多因素的影響，比如冷凍保護劑、冷凍溫度、凍存密度、凍存方式等。①冷凍保護劑（cryoprotective agent，CPA）：是一種加入凍存培養(yǎng)基中以避免凍存?zhèn)毎幕衔铮菐缀跛屑毎麅龃娌僮饕?guī)范中的必備試劑。對細胞凍存的研究也大多集中在凍存液。目前，冷凍保護劑主要有滲透型和非滲透型兩種，滲透型冷凍劑包括二甲基亞砜、甘油、甲醇、乙二醇等，它們通過溶劑效應降低細胞內(nèi)電解質的濃度，降低冰晶；非滲透型冷凍劑包括聚乙烯吡咯酮、羥乙基淀粉、聚乙二醇、蔗糖、葡聚糖和白蛋白等，它們通過增加細胞外滲透壓，減少細胞內(nèi)水分含量，降低了冰晶[29]。二甲基亞砜（DMSO）是最常用的凍存劑，但高濃度的 DMSO 對細胞具有毒害作用，故后來采用其他凍存劑或減少 DMSO 的方式，降低溶液中 DMSO 的濃度，從而減少對細胞的傷害。②冷凍溫度：目前用于凍存細胞的溫度由 -80 ℃ 到 -196 ℃ 不等，經(jīng)典的細胞凍存方法用10% 二甲基亞砜、-196 ℃ 液氮程序保存。近年來 -80 ℃ 的冰箱深低溫凍存應用越來越多，該方式所需設備簡單，冷凍費用低，容易掌握[30]。Han 等[31]研究了兩個關鍵的冷凍保存參數(shù)的影響：冷凍溫度和相應的冷卻速率；冷凍保護劑（CPA）在 ECM 微觀結構上的濃度以及細胞活力結果表明，隨著冷凍溫度的降低（即快速冷凍），細胞擴張明顯增加，隨著 DMSO 的使用，膨脹減小，并且觀察到 DMSO 有冷凍溫度依賴性閾值濃度，DMSO 的閾值濃度隨著冷凍溫度的降低而增加。此外，對嵌入細胞外基質（ECM）中的細胞骨架結構進行調節(jié)可以減輕冷凍誘導的功能變化，減少在冷凍保存過程中保留工程組織（ETs）功能所需的 CPA 量[32]。③凍存密度：不同的細胞凍存密度有所不同，過高的凍存密度會影響其凍存效果而間接影響細胞的復蘇應用，而過低的凍存密度因為增加凍存體積而大大提高凍存成本。④凍存方式：緩慢冷凍和玻璃化是細胞凍存的常用方式。緩慢冷凍首先用冷凍保護劑（CPA）代替細胞質內(nèi)的水，從而減少細胞損傷并根據(jù)細胞膜的通透性調節(jié)冷卻速率。玻璃化過程需要將細胞或組織暴露于高濃度的 CPA（比例為 40% ～ 60%）后冷卻至深低溫（即液氮），并隨后進行快速冷卻以避免冰成核[33]。相較于緩慢冷凍，玻璃化冷凍損傷的風險低。

4 外周血單個核細胞、造血干細胞和自然殺傷細胞的凍存

4.1 外周血單個核細胞的凍存

外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）作為人體免疫系統(tǒng)功能的重要組成部分，其相關單體細胞在人體內(nèi)含量很少，需要對其進行體外培養(yǎng)擴增才能得到臨床所需數(shù)量和質量的細胞，儲存問題也是影響臨床發(fā)展的重要因素。PBMC 的凍存方法對其活性的影響已有較 多研究。首先，冷凍劑的必要性，Sultani 等[34]研究加入了滲透性和非滲透冷凍保護劑[二甲基亞砜（DMSO）和羥乙基淀粉（HES）]，兩種 CPA 聯(lián)合使用取得了更好的效果。在凍存劑添加一定量的血清，可能會中和 DMSO 的毒性。黃馨萍等[35]利用含兩種不同血漿濃度（40% 和 90%）的凍存液對單個核細胞凍存后進行細胞計數(shù)、臺盼藍拒染實驗和集落形成能力檢測分析，得出凍存液中血清含量越高，凍存效果越好。同時得出，無論血漿濃度是 40% 還是 90%，兩類凍存劑的細胞活率均超過 90%，還提示含 10% DMSO 的凍存劑是凍存液的關鍵因素。聯(lián)合保護劑作為 PBMC 新的凍存手段，能減少單一成分的副作用，如低分子右旋糖酐輸注在臨床上原本被用于擴充血容量，與 DMSO 的聯(lián)合使用能發(fā)揮疊加或協(xié)同低溫保護作用[36]。有研究還對比不同濃度的甘油和 DMSO 的凍存效果，發(fā)現(xiàn) DMSO 濃度在 10% ～ 15% 范圍內(nèi)，凍存效果均能使細胞活率達到 86% ～ 95%，甘油濃度在 61% ～ 65% 范圍，凍存效果更優(yōu)良[37]。其次，凍存方式的應用。有研究比較程控降溫和非程控降 溫的運用，采用程控降溫法逐級降溫對細胞的凍存比較有 益[38]。也有將 PBMC 細胞加入凍存液充分混勻后轉移到凍存管中，先將凍存管放入 -80 ℃ 冰箱，24 h 后轉入液氮中保存[39]。朱彤等[40]在 -150 ℃ 液氮中保存外周淋巴細胞兩年，細胞仍能夠保持 95% 以上的活力。凍存細胞的密度也會影響凍存效果，林科佳等[41]通過比較 PBMC 三種凍存密度，即 2.0 × 107/ml，4.0 × 107/ml 和 6.0 × 107/ml，得出采用 2.0 × 107/ml 密度凍存的細胞凍存后培養(yǎng)效果較好，采用 4.0 × 107/ml 和 6.0 × 107/ml 密度凍存后細胞擴增倍數(shù)均與未凍存細胞有一定差異。

4.2 造血干細胞的凍存

造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）來源于骨髓、外周血和臍帶血[42]。自第一次骨移植以來[43]，造血干細胞移植已應用于各種造血系統(tǒng)先天性或后天性疾病的治療。造血干細胞在臨床使用之前，必須按照精確、有效的程序將其冷凍并保存在適當?shù)臈l件下。影響 HSC 冷凍保存成功的因素包括冷凍速率、預冷凍保存條件、冷凍保護劑、凍存前放置時間等[44]。在接受細胞療法的患者中，HSC 冷凍保存的大部分研究都集中在減少或去除 DMSO 毒性問題上，有相關臨床前研究和臨床研究表明 DMSO 濃度（10%、7.5% 和 5%）用于超低溫保存 HSC，濃度低于 10% 時，有核細胞回收率降低；7.5% 和 10% 濃度時，不良事件的發(fā)生率沒有變化，5% DMSO 冷凍細胞的患者中，諸如惡心、發(fā)燒和心動過速等不良反應最低[45-47]。用羥乙基淀粉（HES）和葡聚糖與 DMSO 混合能顯著改變 HSCs 的冷凍保存效果[48-49]。還有研究表明添加無血清的無外源培養(yǎng)物可以大大提高這些細胞的冷凍保存效率，提高冷凍保存液的抗氧化和生化性能[50]。宋騰飛[51]研究發(fā)現(xiàn)凍存前放置時間對造血干細胞中 CD34+百分率也有影響，對單采后血細胞分別進行采集后 0、24、48、72 h、＞ 72 h 的臺盼藍拒染率及 CD34+百分率進行檢測分析。結果顯示，臺盼藍拒染率隨著時間的 推移呈上升趨勢，在 72 h 內(nèi)較穩(wěn)定，＞ 72 h 后下降明顯，建議采集的細胞盡量在 24 h 內(nèi)凍存處理，最長不要超過 72 h。凍存溫度的影響：在 -80 ℃ 機械冰箱中冷凍造血干細胞會導致一些基因的上調[52]，細胞膜完整性和克隆形成潛能顯著喪失[53]，對造血干細胞和患者的臨床結果產(chǎn)生不利影響，在 -196 ℃ 的液氮中保存比在 -80 ℃ 的機械冰箱中存活率更高[54]。在凍存方式上，Antoniewicz-Papis 等[55]比較兩步法和可控冷凍法凍存臍帶（CB）來源的造血干細胞，重點對 MNC 計數(shù)、CD34+細胞計數(shù)和生存力作為 CB 移植材料常規(guī)質量控制的解凍后變量進行了評估。此外，細胞濃度也會影響冷凍效果，細胞濃度過高可能導致解凍后 細胞丟失和細胞聚集，或在細胞輸注過程中引起癲癇發(fā) 作[56-57]。

4.3 自然殺傷細胞的凍存

自然殺傷細胞是機體重要的免疫細胞，作用機制基于免疫調節(jié)細胞因子的釋放，如干擾素 γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），或死亡受體配體結合誘導依賴 caspase 的細胞凋亡，或分泌細胞毒性顆粒。對于臨床使用的 NK 細胞，大規(guī)模生產(chǎn)高度純化的 NK 細胞和具有相當?shù)募毎拘曰钚灾陵P重要，冷凍保存為臨床需求的大量 NK 細胞治療提供了基礎。冷凍保存擴增的 NK 細胞已顯示可減少 NKG2D 和 TRAIL 的表達和細胞毒性[58]。Min 等[59]通過對有或沒有冷凍保存的離體擴增的 NK 細胞的功能活性、細胞表型、體內(nèi)抗腫瘤活性及其 ADCC 活性比較，研究發(fā)現(xiàn)：①冷凍保存 NK 細胞降低了細胞活力，但沒有降低細胞毒性活性和細胞因子分泌活性；②趨化因子受體的表達沒有改變；③降低了 NK 細胞的抗腫瘤活性，但通過劑量控制可以克服；④添加利妥昔單抗可增加冷凍保存的 NK 細胞在擴增后的細胞毒活性。Lapteva 等[60]冷凍保存 NK 細胞 12 個月后，擴增和冷凍的 NK 細胞也能發(fā)揮功能，但融化 NK 細胞后，需靜置過夜，否則它們不會立即裂解 K562 細胞。Pross 和 Maroun[61]把冷凍融化的淋巴細胞在培養(yǎng)基中靜置 5 h，恢復了細胞毒性功能，所以細胞活性和功能可能需要一定的恢復期。目前已經(jīng)開發(fā)了糖、氨基酸、多元醇和兩性電解質作為低溫保護劑，如 El Assal 等[62]開發(fā)了根據(jù)生物相容性原理開發(fā)的冷凍保護劑，如葡聚糖和羧化 ε-聚-L-賴氨酸（CPLL）混合物結合慢速冷凍方法，凍存后與基于二甲基亞砜的冷凍保存的質量相當，且具有更低的細胞毒性。最新研究發(fā)現(xiàn)，一種基于生物相容性殼聚糖納米顆粒被設計用來介導無 DMSO 的高效低溫保存 NK 細胞，以這種方式低溫保存 NK 細胞保留了針對腫瘤目標的強細胞毒性、脫顆粒和細胞因子生成功能[63]。

4.4 細胞凍存生理生化特點

細胞低溫保存為保持細胞株遺傳的穩(wěn)定性以及非連續(xù)性使用細胞提供了可能，同時細胞凍存后在生理生化方面 也有一些變化。Keane 等[64]研究低溫保存對細胞生物能量學的影響發(fā)現(xiàn)，在冷凍保存和復蘇后，低溫貯藏使細胞活力降低了 20%，線粒體功能受損，表現(xiàn)為基礎呼吸、ATP 產(chǎn) 生、最大呼吸、儲備能力和耦合效率下降。而細胞似乎更 依賴于糖酵解，糖酵解效率較低，但能迅速生成 ATP。但線粒體產(chǎn)生 ATP 較少，發(fā)生的機制可能包括 ATP 需求量 低、底物利用率有限，或者更有可能損害氧化磷酸化（OxPhos）機制[65]。此外，細胞復蘇后，從氧磷到糖酵解似乎發(fā)生了代謝轉換。這可能是一種適應機制，以補償線粒體活性下降，導致一種能力以應付細胞的 ATP 需求。然而，還必須注意的是，低溫儲存還可以改變離子轉運蛋白的活性，如調節(jié)細胞內(nèi) pH 的 Na+/H+反轉運蛋白和 HCO3-/Cl-交換器[66]。

綜上所述，懸浮細胞最佳冷凍保存需要考慮多種因素，包括冷凍保護劑溶液的組成、細胞濃度、冷凍速度和保存溫度，尤其對細胞冷凍和復蘇的原理及其相關影響因素進行充分考慮，這些都會最終影響細胞凍存的效果，隨著近年來細胞治療的流行，需要對細胞深低溫保存的方法進行優(yōu)化改進。此外，還需要對凍存后復蘇細胞的存活率、功能性以及安全性進行相關質量評價。