關(guān)丹丹，赫衛(wèi)清

作者單位：100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實驗室

抗生素是臨床上應(yīng)用非常廣泛的一類藥物，許多感染性疾病因此得到有效控制。但是致病菌的耐藥性也越來越普遍，已經(jīng)給人類健康帶來極大挑戰(zhàn)，所以研發(fā)出新的抗感染藥物刻不容緩?，F(xiàn)在已知的抗生素大部分來源于放線菌，這類菌可以產(chǎn)生大量具有抗感染、抗腫瘤和抗氧化等生物活性的次級代謝產(chǎn)物，約 40% 的臨床藥物都是來源于這些次級代謝產(chǎn)物或其衍生物。然而，在放線菌中大多數(shù)生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）在正常的實驗室培養(yǎng)條件下無法表達(dá)，這就需要新的技術(shù)來開發(fā)這些沉默 BGCs 的生物合成潛力。

微生物在實驗室中的純培養(yǎng)是研究微生物的基礎(chǔ)，微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化是發(fā)掘微生物次級代謝產(chǎn)物最基本的方法[1]。隨著生物信息學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)多 種激活沉默 BGCs 的方法，包括在培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘導(dǎo)物[2]、共培養(yǎng)[3]、核糖體工程和轉(zhuǎn)錄因子激活[4-5]，還有正調(diào)控基因或者途徑特異性激活基因的過表達(dá)法[6-8]。對于難以利用生物信息學(xué)預(yù)測的 BGCs 可以通過隨機(jī)構(gòu)建基因文庫的方法發(fā)掘次級代謝產(chǎn)物[9]。除此之外，天然產(chǎn)物生物合成途徑的異源表達(dá)在藥物發(fā)現(xiàn)中受到越來越多的關(guān)注[10-11]。雖然異源表達(dá)能繞過原有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來激活沉默基因簇，但是由于多種原因，在異源宿主中的表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量通常較低。本文總結(jié)了利用重構(gòu)生物合成基因簇來激活沉默基因簇及提高其表達(dá)水平的方法，包括 DNA 組裝、啟動子工程等方法。

1 DNA 組裝

DNA 組裝技術(shù)是完成人工組合生物元件和模塊化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括基于限制酶的組裝技術(shù)、體內(nèi)外同源重組和重疊延伸 PCR 等。在酵母和芽孢桿菌體內(nèi)的重組可以用于更復(fù)雜的 BGCs 組裝[12]。自 DNA 組裝技術(shù)發(fā)明以來，可以進(jìn)行 BGCs 中多個基因的突變、插入和缺失，從而提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和獲得新的衍生物等[13]。下面從生物合成途徑的重構(gòu)和修飾兩個方面介紹在放線菌中激活沉默基因簇的最新進(jìn)展。

1.1 途徑重構(gòu)

1.1.1 “自上而下”的途徑重構(gòu) 許多微生物的次級代謝產(chǎn)物都是非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）/聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）類型的化合物，其 BGCs 的大小可達(dá) 100 kb 以上。利用酶切連接方法往往無法直接對完整的 BGCs 進(jìn)行有效克隆，于是人們開發(fā)了一種由 DNA 小片段組裝成大片段的重構(gòu)方法，并且稱之為“自上而下”的途徑重構(gòu)方法。埃博霉素（epothilone）是一種由 6 個基因構(gòu)成的 NRPS/PKS 類型化合物。2006年，Mutka 等[14]將前 5 個基因進(jìn)行途徑重構(gòu)，并且在大腸桿菌中產(chǎn)生了埃博霉素 C 和 D。2012年，通過 DNA 組裝技術(shù)重構(gòu)了來自 Sorangium cellulosum 的全長為 56 kb 的埃博霉素的 BGCs，重構(gòu)過程包括將第六個基因 epoF，引入獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)、從序列中消除其他限制性酶切位點(diǎn)、進(jìn)行路徑組裝和模塊交換，最終通過異源表達(dá)產(chǎn)生埃博霉素 A 和 B[15]。Schimming 等[16]通過“重疊延伸PCR-酵母同源重組（ExRec）”方法重構(gòu)了 NRPS/PKS 類型化合物的 BGCs，在異源宿主中成功表達(dá)出兩種新型肽 ambactin 和 xenolindicin。這種由較小的 DNA 片段組裝成 BGCs 的技術(shù)已經(jīng)廣泛使用，但是對于復(fù)雜 BGCs 的組裝仍然存在很大限制。因此又開發(fā)出一種基于 IIS 內(nèi)切核酸酶的新的 DNA 組裝策略，該策略可用于復(fù)雜的 BGCs 的組裝[17]。通過該策略，將 5 種天然的 myxochromide（A、B、C、D 和 S）的 BGCs 經(jīng)過設(shè)計后組裝成 30 多種不同 myxochromide 的人工 BGCs；并且通過交換來自不同 myxochromide BGC 的 NRPS 編碼基因產(chǎn)生了新的脂肽結(jié)構(gòu)。

1.1.2 其他途徑的重構(gòu)方法 克隆 BGCs 的首選方法是構(gòu)建插入大片段的基因文庫。在構(gòu)建基因文庫時，人工染色體（BAC）很難直接捕獲次級代謝產(chǎn)物完整的 BGCs，需要重組技術(shù)進(jìn)行無縫拼接和組裝才能獲得完整的 BGCs 進(jìn)行異源表達(dá)。Kallifidas 和 Brady[18]將基因文庫中較小的重疊片段進(jìn)行重組，進(jìn)而組裝成新的大型基因簇，產(chǎn)生了 3 種新的 fluostatins 類似物。為了直接克隆 BGCs，Jiang 和 Zhu[19]提出用 CRISPR/Cas9 技術(shù)精確地切割基因組 DNA，然后利用 Gibson 組裝技術(shù)將目的基因組插入載體中?；蚓庉嫾夹g(shù)雖然可以精確地切割 BGCs，但是步驟 繁瑣。為了進(jìn)一步簡化 BGCs 的捕獲，Greunke 等[20]開發(fā)了一種新的 BGCs 捕獲方法——直接克隆生物合成途徑（DiPaC），該方法主要包括長片段 PCR 和 HiFi 組裝技 術(shù)。通過對其目的 BGCs 進(jìn)行設(shè)計，用最先進(jìn)的高保真 DNA 聚合酶進(jìn)行 BGCs 的長片段擴(kuò)增；然后將擴(kuò)增后的DNA 長片段進(jìn)行體外組裝來進(jìn)行 BGCs 的途徑重構(gòu)，進(jìn)而在異源宿主中成功激活了吩嗪類小分子化合物的生物合成。

1.2 途徑修飾

對于沉默的 BGCs 的重構(gòu)設(shè)計，需要在組裝的同時還要進(jìn)行途徑修飾，這樣才能使 BGCs 的重構(gòu)設(shè)計更加完善有效，因此在多數(shù)情況下途徑修飾也是激活沉默基因簇的重要策略。Ongley 等[21]把一種非核糖體肽的 BGC 通過同源重組技術(shù)，將誘導(dǎo)型啟動子和新的核糖體結(jié)合位點(diǎn)替代原生物合成途徑中的天然啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)，從而在新宿主大腸桿菌中成功異源表達(dá)出 lyngbyatoxin。Coates 等[22]對不同吩嗪的 BGCs 進(jìn)行途徑重構(gòu)、組裝、合成以及路徑修飾，不僅在大腸桿菌中激活了吩嗪的 BGCs，而且產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的吩嗪化合物。

2 啟動子工程

隨著啟動子分析方法的日益成熟以及利用基因工程優(yōu)化啟動子的研究進(jìn)展，可以利用人工合成的啟動子代替基因簇中天然啟動子從而激活沉默的 BGCs。目前可用的合成啟動子包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子，這些啟動子可將轉(zhuǎn)錄活性提高 1000 倍，從而可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平[23]。另外，雙向啟動子也應(yīng)用到啟動子工程中，它可以克服單向啟動子在多基因共表達(dá)方面的限制，在 BGCs 中可以進(jìn)行有效基因共表達(dá)，更高效地激活沉默基因簇[24]。

2.1 利用同源重組技術(shù)替換天然啟動子

2.1.1 Red/ET 重組 Red/ET 重組是在大腸桿菌中的一種基于 λ 噬菌體 Red 操縱子（Redα/Red-β/Redγ）和 Rac 噬菌體 RecE/RecT 系統(tǒng)介導(dǎo)的 DNA 同源重組技術(shù)。該重組技術(shù)可以進(jìn)行 DNA 大片段重組、突變以及異源表達(dá)[25]。同樣，通過替換天然啟動子也可以激活沉默的 BGCs。Dangel 等[26]通過 Red/ET 重組將四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子 tcp830 替換新霉素生物合成中的天然啟動子，同時刪除新霉素的兩個特異性正調(diào)控基因，重構(gòu)了新霉素的 BGC，為 BGC 提供了一個穩(wěn)定且易于轉(zhuǎn)錄的表達(dá)系統(tǒng)，使之在異源宿主中激活。Horbal 等[27]首先通過構(gòu)建基因文庫來克隆目標(biāo)基因簇，然后通過 Red/ET 重組用組成型啟動子代替基因簇中的天然啟動子，最后將重構(gòu)后的基因簇進(jìn)行異源表達(dá)。該方法明顯提高了大環(huán)肉毒霉素的產(chǎn)量。

2.1.2 轉(zhuǎn)化相關(guān)重組 轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)是一種基于釀酒酵母內(nèi)的重組系統(tǒng)。Shao 等[28]利用轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)開發(fā)了一種重構(gòu)沉默基因簇的方法。利用轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)將人工合成的啟動子與生物合成途徑中的基因模塊以及輔助模塊進(jìn)行重組，然后將重構(gòu)的 BGCs 進(jìn)行異源表達(dá)，成功激活了來自 Streptomyces orinoci 的 pectinabilin 生物合成。Montiel 等[29]將合成啟動子和 TAR 技術(shù)結(jié)合，進(jìn)行多個天然啟動子的替換得到重構(gòu)基因簇，并且異源表達(dá)得到 lazarimides A 和 B。Luo 等[30]利用“即插即用”的合成生 物學(xué)策略激活來自 Streptomyces griseus 的沉默 BGCs。該策略通過轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)將 6 個組成型啟動子插入到 BGCs 的上游，同時進(jìn)行途徑重構(gòu)組裝，最終在異源宿主中產(chǎn)生 3 個新的多環(huán)四甲酸酯大環(huán)內(nèi)酰胺（PTM）。2017年，Saha 等[31]也通過啟動子工程和異源表達(dá)相結(jié)合激活了海洋來源鏈霉菌中的 PTM 的 BGCs，從而發(fā)現(xiàn)了 6 種新的 PTMs。

2.2 利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)插入合成型啟動子

近期開發(fā)出一種新的啟動子工程策略，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)在天然宿主中插入人工合成的啟動子以達(dá)到重構(gòu)基因簇的目的。在鏈霉菌的不同 BGCs 中成功利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)插入了組成型啟動子，完成天然啟動子的替換，從而激活鏈霉菌中沉默的基因簇，并產(chǎn)生了一種五角型 II 型聚酮化合物[32]。糖多孢菌產(chǎn)生的紅霉素臨床應(yīng)用廣泛，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)在紅霉素的 BGC 中插入雙向啟動子來代替天然啟動子，雙向啟動子允許基因共表達(dá)，并且結(jié)合 CRISPRi 技術(shù)對基因簇進(jìn)行調(diào)控，提高了糖多孢菌中紅霉素的產(chǎn)量[33]。這種利用 CRISPR/Cas9 插入啟動子的方法可以完成天然啟動子高效準(zhǔn)確的替換，對現(xiàn)有的沉默基因簇激活方法進(jìn)行了升級，也是對同源重組法替換天然啟動子策略的優(yōu)化，可以更好地發(fā)掘鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物生物合成的潛力。

2.3 mCRISTAR 和 miCRISTAR

2.3.1 mCRISTAR 目前，利用啟動子工程重構(gòu) BGCs 最新的方法是 mCRISTAR（multiplexed-CRISPR-TAR），該技術(shù)分為兩步：首先，利用 CRISPR-Cas9 在酵母細(xì)胞中將 BGC 各啟動子位點(diǎn)雙鏈斷裂形成線狀 DNA 片段；然后，含有 BGC 特異性同源臂的組成型啟動子在酵母細(xì)胞中利用 TAR 與這些線性 DNA 片段進(jìn)行同源重組。這套多啟動子插入體系為避免啟動子間的同源重組需對啟動子進(jìn)行正交設(shè)計。Kang 等[34]首次成功利用 mCRISTAR 技術(shù)替換了 Tam 基因簇中所預(yù)測的 8 個天然啟動子，從而完成 BGCs 的重構(gòu)，激活了來自土壤宏基因組中的沉默的 Tam 基因簇。mCRISTAR 是一種簡單通用的方法，可實現(xiàn) BGCs 中每個操縱子上游啟動子的多重替換，不僅繞過操縱子天然的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并且可以保持 BGCs 的完整轉(zhuǎn)錄，極大加快了微生物天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。盡管如此，同時構(gòu)建具有多個 sgRNA 的 CRISPR 質(zhì)粒是 mCRISTAR 過程中的主要瓶頸。Kim 等[35]采用多重質(zhì)粒的方法克服了這個障礙，命名為 mpCRISTAR（multiple plasmids-based CRISPR/Cas9 and TAR）。

2.3.2 miCRISTAR miCRISTAR（multiplex in vitro Cas9-TAR）是 Sean F. Brady 團(tuán)隊在 mCRISTAR 基礎(chǔ)上進(jìn)行的優(yōu)化新策略，與 mCRISTAR 不同的是第一步在體外進(jìn)行天然啟動子位點(diǎn)的切割，省去了 CRISPR-Cas9 質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，從而簡化了 BGCs 重構(gòu)步驟。他們使用 miCRISTAR 同樣也激活了 Tam 基因簇。另外在放線菌的 ato 基因簇中含有 4 個預(yù)測的天然啟動子，他們利用 miCRISTAR 在體外對 4 個天然啟動子依次進(jìn)行切割，并且將不同組合的啟動子位點(diǎn)同時進(jìn)行切割，再重構(gòu)，經(jīng)過 15 種重構(gòu)嘗試后，其中 8 種重構(gòu)基因簇產(chǎn)生了 atolypenes A 和 B[36]。從而證實了 miCRISTAR 是一種比 mCRISTAR 更簡單靈活的基因簇重構(gòu)方法，也是啟動子工程和 DNA 小片段組裝的完美結(jié)合。

3 其他重構(gòu)方法

3.1 刪除抑制子

BGCs 的沉默通常與負(fù)調(diào)控基因或者阻遏基因的表達(dá)有關(guān)，利用重組技術(shù)刪除 BGCs 中的抑制子可以將沉默基因簇激活。Yamanaka 等[37]利用轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)將人工構(gòu)建的 URA3 營養(yǎng)缺陷型基因替換 taromycin A 基因簇的負(fù)調(diào)控基因 tar20，然后成功實現(xiàn)異源表達(dá)。Adpressa 等[38]通過突變 H3K27 甲基轉(zhuǎn)移酶基因 Kmt6，然后在突變菌株中分離出 fusaristatin A、gibepyrone A、fusarpyrones A 和 B。

3.2 轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)

轉(zhuǎn)座子能產(chǎn)生單一位點(diǎn)的突變，且突變效率高。Mao 等[39]通過轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)激活了來自 Burkholderia thailandensis 的沉默基因簇。

3.2 定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變

Li 等[40]將來自 Streptomyces chatta noogensis L10 中沉默基因簇的 rpoB 基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，產(chǎn)生了一種類似古霉素的新抗生素——炭疽霉素。Guo 等[41]通過隨機(jī)突變來產(chǎn)生基因組的遺傳多樣性，激活了賈德霉素基因簇和至今無法激活的 pga 基因簇。

3.4 密碼子優(yōu)化

密碼子偏愛性的不匹配是外源基因在宿主系統(tǒng)中表達(dá)量低的主要原因之一。Chai 等[42]將微管霉素的 BGCs 進(jìn)行了重構(gòu)組裝，但是其 BGCs 中的 tubC 的起始密碼子是稀有的 TTG，為了避免重構(gòu) BGCs 在異源宿主中低效率表達(dá)，利用 Red/ET 重組技術(shù)將密碼子改為 ATG，從而在異源宿主中產(chǎn)生了微管霉素。

4 小結(jié)

通過各種合成生物學(xué)方法的不同組合對生物合成基因簇進(jìn)行重構(gòu)，從而激活沉默基因簇，這區(qū)別于其他沉默基因簇的激活方法。每一種 BGCs 的重構(gòu)方法往往不可獨(dú)立完成沉默基因簇的激活，例如途徑組裝會結(jié)合啟動子工程，途徑重構(gòu)會伴隨著途徑修飾，需要相互配合才能更有效地激活沉 默 基 因 簇， 采 用 CRISPR/Cas9 、 mCRISTAR 和 miCRISTAR 等新技術(shù)可以極大提高 BGCs 的重構(gòu)工程的效率，可以更高效地激活沉默基因簇，獲得大量的具有活性的新次級代謝產(chǎn)物用于新抗生素的篩選，加速抗生素等新藥的研發(fā)速度。