劉延峰，周景文，劉龍，陳堅

（1 江南大學未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122； 2 江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122； 3 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122）

健康、安全、可持續(xù)的食品制造是人類健康和社會可持續(xù)發(fā)展的關鍵要素。由于環(huán)境污染、氣候變化、人口增長和資源面臨枯竭，如何保障安全、營養(yǎng)和健康的食品供給面臨巨大挑戰(zhàn)。利用細胞工廠制造替代傳統(tǒng)食品獲取方式，建立可持續(xù)的食品制造新模式，將大幅降低食品生產對資源和能源的需求，減少溫室氣體的排放，并且提升食品生產與制造的可控性，有效避免潛在的食品安全風險和健康風險。

利用合成生物學技術創(chuàng)建細胞工廠，并且提升重要食品組分、功能性食品添加劑和營養(yǎng)化學品的合成效率，是解決目前食品制造面臨的問題和主動應對未來挑戰(zhàn)的重要研究方向。本文首先對食品合成生物學的重要意義與主要內涵進行了討論。其次，本文針對基于合成生物學技術的重要食品組分、功能性食品添加劑和營養(yǎng)化學品的典型代表性產品的生物制造進展進行了介紹。最后，對合成生物學與食品制造領域的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 中國食品科技與合成生物學

我國食品工業(yè)與食品科技在全球占據重要地位。食品工業(yè)方面，我國食品產業(yè)產值和食品進出口量均居世界第一，為我國融合全球供應鏈和提升我國國際競爭力提供重要支撐［1］。食品領域科研方面，我國食品領域專利申請數、授權數、論文發(fā)表量和引用數均位居全球第一，并且我國大學在“軟科”發(fā)布的2019 年全球食品學科排名前十的榜單中占據了5席［1］。

傳統(tǒng)食品獲取方式和供給模式由于環(huán)境污染、氣候變化和人口增長日益面臨巨大挑戰(zhàn)，相關挑戰(zhàn)對未來食品供給方式和功能提出了新的要求。食品獲取方式和功能的改變將成為人類未來生產方法和生活方式改變的代表性問題，未來食品應該具備“更安全、更營養(yǎng)、更方便、更美味、更持續(xù)”的特征［1］。其中，合成生物學為食品重要組分、功能性食品配料和重要功能營養(yǎng)因子的生物制造提供了關鍵技術和方法支撐。食品合成生物學是在傳統(tǒng)食品制造技術基礎上，采用合成生物學技術，特別是食品微生物基因組設計與組裝、食品組分合成途徑設計與構建等，創(chuàng)建具有食品工業(yè)應用能力的人工細胞、多細胞人工合成系統(tǒng)以及無細胞人工合成系統(tǒng)，將可再生原料轉化為重要食品組分、功能性食品添加劑和營養(yǎng)化學品，實現更安全、更營養(yǎng)、更健康和可持續(xù)的食品獲取方式［1］。

2 食品合成生物學：任務與挑戰(zhàn)

食品合成生物學的發(fā)展可以劃分為三個階段：①通過最優(yōu)合成途徑構建及食品分子修飾，實現重要食品功能組分的有效、定向合成和修飾，為“人造功能產品”細胞的合成做準備；②建立高通量高靈敏篩選方法，篩選高效的底盤細胞工廠，實現重要食品功能組分的高效生物制造，初步合成具有特殊功能的“人造功能產品”細胞；③實現人工智能輔助的全自動生物合成過程的設計及實施，通過精確靶向調控，大幅度提高重要食品功能產品在異源底盤和原底盤細胞中的合成效率，最終實現“人造功能產品”細胞的全細胞利用［1］。食品細胞工廠的設計與精準調控是各類食品、食品配料或者添加劑的生物制造過程中所面臨的共性任務和挑戰(zhàn)。本文針對基于合成生物學技術合成植物蛋白肉所需關鍵組分、黃酮類植物天然產物和母乳寡糖三類典型代表性產品，介紹相關的生物制造研究進展，并且討論目前食品合成生物學任務與挑戰(zhàn)。

2.1 植物蛋白肉所需關鍵組分的生物制造

人造食品的總體技術路線是構建細胞工廠種子，以車間生產方式合成奶、肉、糖、油、蛋等，緩解農業(yè)壓力，滿足日益增長的食品需求。人造食品主要包括人造蛋、人造肉和人造奶等，其中人造肉是食品領域新興和突破技術，人造肉規(guī)?；圃旒夹g的突破將有望降低傳統(tǒng)農業(yè)中資源與能源的消耗［2-6］。近年來，人造肉因其來源可追溯、食品安全性高、綠色可持續(xù)等優(yōu)勢引起了廣泛的關注，并且被MIT Technology Review評為2018 年全球十大突破技術之一。人造肉可分為植物蛋白肉和細胞培養(yǎng)肉兩大類。其中，植物蛋白肉成本相對較低、技術要求低、市場接受度高，因此植物蛋白肉現階段具有技術成熟的優(yōu)勢和優(yōu)先發(fā)展的潛力。 近年來， Impossible Foods、Beyond Meat 等多家公司已開發(fā)出以植物蛋白為原料的植物蛋白肉制品并且已經實現商業(yè)化生產。細胞培養(yǎng)肉與天然肉相似，不過目前成本較高，市場潛力大但仍需開發(fā)。目前細胞培養(yǎng)肉相關產品仍主要處于實驗室研究階段，商業(yè)化細胞培養(yǎng)肉大規(guī)模上市并且得到市場廣泛認可還需要更加全面的研究和應用推廣［7-8］。植物蛋白肉和細胞培養(yǎng)肉均需要在制備過程中利用由微生物細胞工廠酶制劑、血紅素、維生素和脂類等關鍵成分，將所獲得的食品原料和功能成分進行有機整合，最終獲取風味協(xié)調、質構穩(wěn)定和擬真度高的重組食品，實現色、香、味、形的食品化整合。

然而，目前植物蛋白肉與禽肉的品質還存在較大差距，急需在質構仿真、營養(yǎng)優(yōu)化、風味調節(jié)及成品定制等方面取得突破。利用特定功能的酶對植物蛋白肉進行質構仿真、營養(yǎng)優(yōu)化和風味調節(jié)，能夠實現植物蛋白肉結構強度改造、結構親疏水性改造、過敏原等成分降解、蛋白質利用率提升、糖脂蛋白的整合、異味成分的降解和風味物質提升。血紅素和高核酸酵母提取物的添加對于風味品質提升同樣具有重要作用。協(xié)同利用特定功能的酶和風味物質將有助于植物蛋白肉品質提升，并且為基于3D 打印食品化的成品定制過程奠定基礎。

植物蛋白肉質結構仿真方面，由于植物蛋白缺乏肌肉蛋白特有的纖維結構，因此感官品質較差。交聯(lián)酶、脫酰胺酶和具有結構功能的動物蛋白的制備和綜合利用是解決該問題的關鍵。谷氨酰胺轉氨酶和漆酶是目前在食品加工中應用最多的交聯(lián)酶［9-12］。谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶分別催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺和天冬酰胺脫酰胺［13-15］。交聯(lián)酶、脫酰胺酶的應用有望促進植物蛋白質類纖維結構的形成。在植物蛋白肉營養(yǎng)優(yōu)化方面，如何高效特異性降解植物蛋白致敏源是需要解決的關鍵問題。作為植物蛋白肉主要基材的大豆蛋白等含有多種致敏原，因此篩選特異性蛋白酶降解致敏原蛋白有望解決植物蛋白肉脫敏的問題。在植物蛋白肉風味調節(jié)方面，目前主要針對如何消除引起豆腥味的醇、醛等揮發(fā)性化合物以及導致苦味的苦味肽開展研究。植物蛋白中的亞油酸或亞麻酸可轉化為小分子醇、醛等揮發(fā)性化合物，導致豆腥味產生。同時，蛋白質在降解過程中形成的苦味肽會導致苦味的產生，嚴重影響植物蛋白肉的風味。應用醇、醛脫氫酶破壞醇、醛分子，補充復合蛋白酶將促進氨基酸生成（美拉德反應的前體），可以顯著改善植物蛋白肉的風味。

植物蛋白肉生產關鍵酶制備路線主要包括4個步驟：①獲得應用性能理想的酶，從自然界或基因數據庫中篩選目標酶，并且基于應用需求進行分子改造，獲得理想的目標酶；②構建安全易用的生產宿主，以食品安全級生產菌株為基礎，開發(fā)高效轉化方法，優(yōu)化轉錄、翻譯與蛋白質轉運系統(tǒng)，構建安全易用的宿主；③設計普適性強的表達策略，對酶編碼基因序列進行深度優(yōu)化，提高目標酶基因與宿主的適配性，構建表達元件庫，提高目標酶表達水平；④開發(fā)高效的過程控制技術，在系統(tǒng)分析酶分子合成與分泌的基礎上，結合誘導條件和流加策略，實現菌體生產與目標酶合成的平衡。

細胞培養(yǎng)組織、植物拉絲蛋白均缺乏真實的肉色，添加血紅蛋白能夠賦予植物蛋白肉和細胞培養(yǎng)肉真實的色香味感受。合成生物學技術是實現微生物發(fā)酵法制備血紅蛋白的關鍵技術［16-19］。血紅蛋白生物合成需要利用成熟的微生物底盤細胞（釀酒酵母、畢赤酵母等）來表達植物根瘤組織來源或動物血紅細胞來源的血紅蛋白。血紅蛋白合成代謝途徑主要包含珠蛋白合成和血紅素合成兩個模塊［20-23］。在底盤細胞中優(yōu)化與適配高效珠蛋白合成模塊和高效血紅素合成模塊，有望提升血紅蛋白合成效率。最后，在獲得高效血紅蛋白合成菌株的基礎上開展發(fā)酵過程優(yōu)化，為菌株生長和血紅蛋白合成過程提供適宜的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，助力細胞工廠發(fā)酵法高效合成血紅蛋白。

2.2 黃酮類化合物的生物制造

植物天然提取物具有生物活性和藥理活性，這使得其在營養(yǎng)保健和醫(yī)藥健康領域具有廣泛應用［24］。然而，植物生長周期一般較長，而且植物中生物活性物質的含量一般非常低，每千克植物僅含有若干微克或若干毫克目標化合物［25］。大規(guī)模植物天然提取物的生產和應用可能會導致植物群落破壞，甚至導致植物的滅絕。另外，植物中存在的活性物質類似物會增加提取工藝的復雜程度，并且增加產品純化的成本［26］。因此，以植物為單一來源獲取植物天然提取物往往存在生產周期長、提取費用昂貴和對自然資源破壞嚴重的問題。利用合成生物學技術改造微生物、開發(fā)植物天然提取物的生物制造工藝引起了廣泛關注。相比于傳統(tǒng)提取工藝，生物制造工藝以可再生生物質為原料，生產過程能耗低，并且污染物排放少［27］。目前，典型植物天然提取物的生物制造取得了顯著進展，包括萜類化合物、苯丙素類化合物以及生物堿類化合物［28-38］。

植物天然提取物的生物制造包括基因挖掘、細胞改造和發(fā)酵提取三個主要方面。具體步驟包括：①通過基因組學、轉錄組學和代謝組學等組學技術分析原生植物，挖掘植物天然提取物關鍵基因和代謝途徑；②通過關鍵基因異源表達、前體供給強化和輔因子再生強化等細胞改造技術，建立目標產物合成途徑并且實現目標產物高效合成；③通過發(fā)酵過程優(yōu)化為植物天然提取物生產菌株提供合適的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，提升目標產物合成效率，并且進一步對產物進行分離提取，獲得大量目標產物。

黃酮類化合物是苯丙素類植物天然提取物中一類重要的化合物，基于合成生物學的黃酮類化合物生物制造是目前的研究熱點之一［39-44］。黃酮類化合物廣泛分布于植物界中，已報道超過8000 余種。黃酮類天然產物具有類似的合成途徑，其中柚皮素、生松素是關鍵平臺化合物。以柚皮素、生松素平臺化合物為前體，可以合成結構和功能多樣的黃酮類化合物。因此，設計與構建柚皮素和生松素的底盤細胞是實現黃酮類化合物高效生物制造的基礎。生產黃酮類化合物的釀酒酵母底盤細胞的構建主要以下6個策略：①強化芳香族氨基酸和香豆酸/肉桂酸合成途徑；②減少黃酮代謝副產物積累；③去除不必要的糖苷水解酶；④擴張細胞內質網；⑤強化糖基供體；⑥降低過氧化物酶活性。在生產黃酮類化合物釀酒酵母底盤細胞的基礎上，通過組裝與優(yōu)化來源于深紅酵母、香芹、矮牽牛、紫花苜蓿、擬南芥、甘草和淫羊藿的基因，已實現了最復雜黃酮類化合物之一的淫羊藿苷的生物合成。相關研究為以淫羊藿苷為主要成分的數百種藥物和保健品的原料供給提供了新的途徑［39］。因此，利用合成生物學技術構建以廉價碳源、無機鹽為底物合成高附加值黃酮類化合物的微生物細胞工廠，有望實現定制化生產數以千計的黃酮類化合物，為黃酮類化合物高效獲取提供重要途徑。

2.3 母乳寡糖的生物合成

母乳寡糖是母乳與牛乳含量差別最大的物質，牛乳中寡糖含量大約僅有0.05%，而母乳中這一比例達到5%～15%。母乳寡糖主要以半乳糖和N-乙酰氨基糖交替組成的碳骨架并且與乳糖相連，進一步經過巖藻糖基化或唾液酸基化修飾而成。母乳寡糖中有大約80%是巖藻糖基化的寡糖，而牛乳中不含巖藻糖基化的寡糖。母乳寡糖中巖藻糖基化的寡糖對嬰兒早期減少感染和腸道菌群的建立等諸多方面起著重要作用。另外，母乳寡糖中約20%為唾液酸基母乳寡糖，主要包括3'-唾液酸基乳糖和6'-唾液酸基乳糖等。唾液酸基母乳寡糖能夠促進嬰兒腸道益生菌增殖、神經系統(tǒng)代謝、肝臟和肌肉組織發(fā)育［45］。因此，母乳寡糖是嬰兒配方奶粉的關鍵功能營養(yǎng)因子。母乳寡糖高效制備為實現嬰兒配方奶粉對母乳的“深度模擬”提供重要技術支撐［46-50］。

2'-巖藻糖基乳糖（2'-FL）和乳酰-N-新四糖（LNnT）是典型母乳寡糖。2'-FL 被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準為嬰幼兒奶粉的添加劑（2015 年9 月），在歐盟被批準為新型食品添加劑。LNnT 分別于2016 年3 月和2016 年8 月被美國和歐盟批準為食品添加劑。2'-FL 在嬰幼兒配方奶粉中的建議添加量為2g/kg，按全球嬰幼兒奶粉年產量270 萬噸計算，預計需求量為32 400 噸/年。目前荷蘭、德國公司投入巨資對母乳寡糖，包括2'-巖藻糖基乳糖、3'-巖藻糖基乳糖、乳酰-N-四糖、6'-唾液酸基乳糖和3'-唾液酸基乳糖進行研發(fā)，預計3～5年內實現規(guī)?；a。

目前母乳寡糖生物制造主要以大腸桿菌作為底盤細胞［49，51-55］。然而，由于大腸桿菌生產的產品存在內毒素污染的風險，影響了母乳寡糖的安全性。相比于大腸桿菌，作為典型工業(yè)微生物的枯草芽孢桿菌是食品安全菌株，并且無內毒素產生，更適合于母乳寡糖的合成［56-60］。另外，枯草芽孢桿菌遺傳背景清晰并且基因編輯技術成熟，為基于合成生物學技術構建高效合成母乳寡糖工程菌提供了有利條件。

以枯草芽孢桿菌為宿主合成2'-FL 已取得了顯著研究進展。首先，利用與凝血酶結合的DNA適配體的調節(jié)元件，進行2'-FL 合成途徑基因表達水平的上調和內源乳糖運輸抑制基因的表達水平的下調，2'-FL 的產量提高了27.3 倍，達到674mg/L［61］。進一步在底物轉運通道、途徑酶表達和輔因子GTP的再生效率等方面進行系統(tǒng)調控，2'-FL 的合成效率顯著提高，搖瓶發(fā)酵2'-FL的產量達1035mg/L。最后，將2'-FL 合成菌株在3L 發(fā)酵罐中進行補料分批培養(yǎng)，2'-FL的最高產量達到5.01g/L，底物得率達到0.85mol/mol 巖藻糖。相關研究為未來進一步提高2'-FL的合成效率奠定了良好基礎［62］。

利用細胞工廠合成LNnT 是實現規(guī)?；苽銵NnT 的一種重要方法。研究人員利用枯草芽孢桿菌CRISPRi 系統(tǒng)針對LNnT 生物合成途徑中的3 條競爭途徑的4個基因設計了一系列sgRNA，對糖酵解途徑中的pfkA和pyk基因、戊糖磷酸途徑中的zwf基因和磷壁酸合成途徑中的mnaA基因表達進行下調。通過單獨抑制每條通路，篩選獲得提高LNnT/葡萄糖轉化率的最佳靶向sgRNA。隨后，對糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和磷壁酸合成途徑進行組合下調，LNnT產量由1.32g/L提高到1.55g/L。在此基礎上，為了提高中間代謝物乳酰-N-三糖Ⅱ向LNnT 的轉化效率，研究人員敲除了分支途徑中tuaD基因，并且過表達lgtB基因，使得LNnT 產量進一步提高到2.01g/L。最后，通過優(yōu)化誘導劑木糖的添加時間和用量，LNnT在搖瓶中產量達到2.30g/L，在3L生物反應器中產量達到5.41g/L，為生物法規(guī)模化制備LNnT奠定了基礎［63］。

3 結 論

合成生物學技術為解決食品制造面臨的挑戰(zhàn)提供了重要技術支撐，是食品領域研究的重要方向。以植物蛋白肉關鍵組分、黃酮類植物天然產物和母乳寡糖為代表的典型食品組分、功能性食品添加劑和營養(yǎng)化學品的生物制造目前已取得顯著進展。在食品合成生物學理論研究、技術方法建立和典型產物合成路徑打通的基礎上，進一步擴展合成的目標產物的范圍、創(chuàng)建智能化細胞工廠和大幅度提升食品組分、食品配料和功能營養(yǎng)品的合成效率，實現全細胞利用和工業(yè)規(guī)模制備是未來研究的重要方向。

綜上所述，食品合成生物學是解決未來食品面臨的重大挑戰(zhàn)的主要方法之一，包括新食品資源開發(fā)和高值利用、多樣化食品生產方式變革、功能性食品添加劑和營養(yǎng)化學品制造等。我國必須加強食品合成生物學等具有重大意義的食品生物技術的開發(fā)和應用，并率先實現產業(yè)化，搶占世界的科技前沿和產業(yè)高地，造福人類。