羅丹，張力，秦曉慧，張春霞

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 創(chuàng)面修復(fù)、周圍血管科，廣西 南寧 530023）

靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)引起的靜脈回流障礙性疾病,常發(fā)生于下肢，具有高病發(fā)率、高致殘率和易反復(fù)發(fā)作的特點，臨床表現(xiàn)較隱匿。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示國外DVT的年發(fā)病率約為0.1%～0.2%，而外科術(shù)后DVT的發(fā)病率高達(dá)約26%[1-2]。DVT與血栓脫落引起的栓塞（pulmonary embolism，PE）統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE），是同種疾病在不同階段的表現(xiàn)形式，VTE出現(xiàn)后2年內(nèi)再次發(fā)生DVT或PE的概率為16%[3]。血栓形成后綜合征（postthrombotic syndrome，PTS）是DVT最常見的慢性并發(fā)癥，DVT后3～6個月內(nèi)，有25%～50%的患者發(fā)生PTS，其疾病本身及并發(fā)癥都顯著影響了患者的生活質(zhì)量、加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時增加了社會醫(yī)療風(fēng)險及消耗[4-5]。

DVT發(fā)病有三大因素，即靜脈血流滯緩、靜脈壁受損和血液高凝形態(tài)[6]。近年來，高齡、肥胖、靜脈曲張、吸煙等高危因素不斷出現(xiàn)及相互影響作用，以致在受到大手術(shù)、嚴(yán)重創(chuàng)傷、長期臥床、肢體制動等可能情況下促使DVT的發(fā)生[7]，因此如何有效預(yù)防及治療DVT，防止早期并發(fā)癥的風(fēng)險，減少后期并發(fā)癥的發(fā)生及降低其嚴(yán)重程度顯得尤為重要。隨著對DVT研究的不斷深入，取得了許多成果，其治療方式也由最早單純的抗凝治療、系統(tǒng)溶栓治療發(fā)展到局部溶栓治療、機(jī)械取栓治療等多種形式[8-9]，但D V T 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病理機(jī)制及治療機(jī)制尚有許多不解之謎，同時DVT的三大發(fā)病因素并不獨(dú)立存在，通常有著連鎖效應(yīng)，故需通過建立具有針對性的DVT動物模型來找出答案，以便研究時進(jìn)行合理的選擇。用于DVT研究的動物選擇和方法豐富多樣，各有優(yōu)缺點，現(xiàn)將其研究進(jìn)展綜述如下。

1 動物的選擇

實驗動物的選擇與實驗結(jié)果息息相關(guān)，一般主要選擇與人類基因較為密切的活體動物，但隨著對DVT研究的目的、條件不同，對動物的選擇也有差異，這些差異還包括人與動物體型大小、壽命、血管大小和規(guī)格等差異[10-11]。DVT研究對模型動物的要求主要體現(xiàn)在四方面：一要考慮DVT發(fā)展過程（急性、慢性、亞急性）的不同在動物身上的體現(xiàn)；二要確保動物模型形成的血栓穩(wěn)定可靠，且與人體靜脈血栓形成的病理過程一致；三要保證造模動物成活率高，存活時間長[12]；四要考慮實驗動物是否易管理、易飼養(yǎng)、費(fèi)用高低等問題。選擇時應(yīng)綜合評判，目前常用于DVT造模的動物如下。

1.1 小鼠

小鼠繁殖能力強(qiáng)且周期快，是生命科學(xué)研究中最常用來造模的動物。小鼠常用于DVT的研究，其優(yōu)勢在于易獲取、價格低、飼養(yǎng)方便、適應(yīng)能力強(qiáng)、造模時間短，代謝率高[13]。Grover等[14]認(rèn)為鼠模型，尤其是涉及腎靜脈平面以下的下腔靜脈模型，技術(shù)操作簡單，實驗成功率也高，且廣泛應(yīng)用于急性和慢性DVT的研究[15]。但小鼠模型也有其局限性：小鼠體積小，下腔靜脈較細(xì)，且沒有瓣膜，多用血管結(jié)扎手法造模，形成的血栓采集困難，且血流動力學(xué)、血管大小、凝血及演變過程與人類DVT形成及演變必然存在一定的差異[16-17]。

1.2 其他鼠類

包括大鼠和裸鼠等。大鼠也常用于D V T 模型的研究，其較小鼠的適應(yīng)能力、生存能力及抗感染能力更強(qiáng)，相比于其它中大型動物而言價格低，血栓完全形成的時間快[18-19]，但大鼠與小鼠存在同樣的局限性。裸鼠也可用于DVT造模，裸鼠先天缺乏T細(xì)胞免疫，不干預(yù)異體組織和細(xì)胞，可以使用人類自身的細(xì)胞觀察血栓溶解、機(jī)化的過程，這是其他動物模型所不具備的[20]，但裸鼠生存對環(huán)境要求嚴(yán)格，故臨床DVT造模時較少選用。

1.3 兔

兔子性格溫順，與大鼠對比，兔下腔靜脈較粗大，造模操作更容易，且血栓長度長，易于采集，血量更豐富[21]，兩者都可形成穩(wěn)定的血栓，成功率高，也符合人體DVT急性期病理演變的特點，除價格較鼠類貴外無明顯差異[12,22]；相比犬、豬等大型動物，購買成本及飼養(yǎng)成本低，給藥方便，利于實驗觀察[23-24]。但兔子對感染的耐受力差，且由于生存周期長，老齡兔搜集困難。

1.4 其他動物

豬、犬和狒狒這類非人類的靈長類動物也可用于DVT造模，這類大型動物有與人類相似的靜脈解剖結(jié)構(gòu)，在血流動力學(xué)和血液學(xué)參數(shù)上具有其他動物不可比擬的優(yōu)勢，且靜脈粗、條件好、便于觀察，從而補(bǔ)充其他動物模型相關(guān)的不足[25-26]，缺點則在于靜脈壁較薄、對操作者技術(shù)要求高、管理困難，死亡率高[27]，且飼養(yǎng)條件和經(jīng)濟(jì)成本等也較其他動物高，此外，并不是所有的大型實驗動物模型都具有與人類的相似性和關(guān)聯(lián)性[28]。

2 造模方法

2.1 下腔靜脈結(jié)扎法/縮窄法

下腔靜脈結(jié)扎法的原理是通過靜脈結(jié)扎阻斷下腔靜脈，使局部血流淤滯、缺氧和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，瀑布式凝血形成，致血栓的形成[12]。但發(fā)現(xiàn)此法在研究溶栓和觀察血栓的動態(tài)過程中并不適用，且與人體DVT疾病的形成和演變不相符。眾多學(xué)者在此基礎(chǔ)上不斷進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新，Diaz等[29-30]通過實驗發(fā)現(xiàn)改變下腔靜脈分支的結(jié)扎模式會引起血栓大小的變化，且后分支對血栓大小的影響最大，靜脈側(cè)支同樣會影響實驗性DVT中的血栓大小。在DVT模型中通過干擾部分下腔靜脈致血管的扭曲和狹窄，并致血液滯流，即造模時關(guān)閉90%的下腔靜脈48 h，血栓形成的過程及其結(jié)構(gòu)與人DVT血栓相似[16,31]。覃鋒等[12]采用改良下腔靜脈結(jié)扎法（簡稱：簡易懸吊術(shù)）制備DVT模型，以體外懸吊的方法將下腔靜脈實驗段血管上、下阻斷并放置6 h，使所形成的血栓停滯在原懸吊線之間。此時，原懸吊處下腔靜脈各屬支血流緩慢,局部血管扭曲，血流淤滯、缺氧，內(nèi)皮細(xì)胞變性。此造模方法下動物存活率高，不管是家兔還是大鼠動物模型血栓形成率均可達(dá)100%[12,32]，血栓形成量大且穩(wěn)定，還節(jié)省了造模時間，在血栓形成后撤掉原懸吊線，血管可恢復(fù)常態(tài)、不再扭曲，避免了滲出液及炎癥粘連懸吊線而難以抽出的情況，是一種新的適合于動態(tài)研究抗凝、溶栓藥物機(jī)制的模型，與人體靜脈疾病的重度狹窄、血流緩慢的DVT病理生理學(xué)特點一致，也與人體DVT的血栓演變過程更相符。與不可能溶栓（或再通）的完全結(jié)扎不同，部分結(jié)扎模型可以在不可逆轉(zhuǎn)的閉塞改變之前提供評估溶栓效果的可能[17]。

2.2 電解下腔靜脈模型（electrolysis inferior vena cava model，EIM）

EIM是利用電流激活內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)血栓，血栓部分阻塞血管腔。Diaz等[33-34]把針頭與一根鍍銀銅線相連，針頭插入小鼠下腔靜脈內(nèi)，施加直流電誘導(dǎo)自由基的形成，從而激活內(nèi)皮細(xì)胞，在血流恒定的狀態(tài)下促進(jìn)血栓的形成。Palmer等[35]同樣對此法進(jìn)行了實驗，結(jié)果表明此法技術(shù)簡單，可重復(fù)性高，且最高安全電流為250 μA。EIM是目前唯一一種既能提供大小一致的血栓，又能維持持續(xù)血流的模型，這有利于系統(tǒng)和動態(tài)的觀察血栓的產(chǎn)生和溶解以及藥物對血栓發(fā)揮的作用，且實驗結(jié)果表明所有接受EIM的小鼠存活率及血栓形成率均達(dá)100%，若需要進(jìn)一步驗證造模是否成功則可以選擇超聲或者靜脈造影術(shù)，同時數(shù)據(jù)支撐顯示EIM模型不僅能夠研究急性和慢性DVT的時間點，而且對于研究伴隨這種疾病并導(dǎo)致長期并發(fā)癥的炎癥也是一個有價值的工具模型[33-36]。但該模型的主要缺點是手術(shù)時間較長，且與人體DVT形成過程存在差異，僅僅使靜脈壁完整性受損，而缺乏高凝和血流滯緩的狀態(tài)。

2.3 機(jī)械損傷法

機(jī)械損傷法是指由于各種致傷物通過機(jī)械作用使機(jī)體組織結(jié)構(gòu)破壞或生理機(jī)能發(fā)生障礙。研究者對動物模型進(jìn)行創(chuàng)傷骨折造模，選定動物后先進(jìn)行固定，使用擊打裝置在固定部位進(jìn)行能量擊打，確定擊打?qū)е鹿钦酆笫褂檬喙潭ǎ欢螘r間后使用超聲觀察造模的血栓情況，如有血栓形成則造模成功，以此判定模型的有效性[37]。擊打創(chuàng)傷適用于骨科創(chuàng)傷或急性失血造成的DVT模型，選用的動物多為大型動物。范春芝等[38]建立犬下肢DVT模型，在超聲引導(dǎo)下刺穿股靜脈，經(jīng)動脈鞘送相應(yīng)粗細(xì)的毛刷進(jìn)入股靜脈，損傷靜脈內(nèi)膜從而構(gòu)建DVT模型，操作簡便，術(shù)后12 h彩色多普勒超聲觀察股靜脈，以靜脈管腔是否被壓癟、管腔內(nèi)有無回心血流信號判斷血栓是否形成，實驗結(jié)果顯示血栓性形成率91.7%，過程中未使用凝血類藥物，但此法下由于每個動物股靜脈內(nèi)徑有差異，故毛刷選擇也會不同，前期制備工作繁雜。Campos等[39]指出合適的DVT模型應(yīng)避免機(jī)械或化學(xué)或者任何其他刺激引起的內(nèi)皮剝脫和血管壁完整性的破裂，因為這與人類DVT發(fā)病過程的相似度是有限的，但此模型在研究血管內(nèi)膜保護(hù)及作用靶點上有獨(dú)特優(yōu)勢。

2.4 聯(lián)合注入凝血酶法

李林鵬等[26-27]選定成年犬并游離其股靜脈，近心端使用可吸收羊腸線對靜脈進(jìn)行捆綁使其狹窄，遠(yuǎn)心端分支靜脈處植入導(dǎo)管注入300 U凝血酶，分離1 h后見血栓形成及拔出針管，于實驗側(cè)通過留置的靜脈導(dǎo)管行造影劑觀察急性期血栓形成過程以及慢性期的機(jī)化過程。Minko等[40-41]通過阻塞氣球?qū)Ч芎湍缸⑸湓谪i體內(nèi)誘發(fā)髂靜脈血栓形成，借助彩色多普勒超聲等現(xiàn)代工具驗證血栓的形成。在介入工具的協(xié)助下建立模型，具有操作簡單、創(chuàng)傷小、動物死亡率低、血栓形成速度快等優(yōu)點[42]，且血栓持續(xù)形成的同時還有血液流通，符合血栓成因和特性，便于觀察血栓的演變過程，但缺點在于應(yīng)用不同的機(jī)械取栓導(dǎo)管進(jìn)行機(jī)械血栓切除術(shù)，雖血栓模型形成，但在后續(xù)操作中可引起明顯的血管穿孔等問題，設(shè)備價格貴，成本高。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，近5年來，深靜脈血栓形成的動物造模方式及其研究有較大發(fā)展，主要體現(xiàn)在以下幾點：⑴動物的選擇從注重成本、飼養(yǎng)、成功率等因素，到現(xiàn)在更注重動物模型與人體靜脈血栓形成的病理相一致；⑵動物造模從單純重視體現(xiàn)血栓形成的病因，逐步發(fā)展為現(xiàn)在既重視體現(xiàn)病因又重視體觀血栓形成后的病理演變。兩者的結(jié)合更符合人體靜脈血栓形成的病理特點；⑶過去造模的設(shè)計原理較單一，多針對血栓的形成進(jìn)行造模?，F(xiàn)在的造模方式既能設(shè)計復(fù)雜的病因機(jī)制，也能就某一病理過程或特定病因進(jìn)行針對性造模；⑷過去多通過開放性手術(shù)造模，隨著現(xiàn)代醫(yī)療設(shè)備和技術(shù)的發(fā)展，在影像技術(shù)的支持下，運(yùn)用現(xiàn)代微創(chuàng)技術(shù)進(jìn)行造模。這種造模方式對動物的損傷小，對動物的內(nèi)環(huán)境影響也小，這有可能會成為一種造模趨勢。但迄今為止，建模方式中大多數(shù)模型僅能體現(xiàn)血栓形成三大因素中的靜脈壁受損、靜脈血流滯緩兩因素，多無法體觀血液高凝狀態(tài)這一因素，這也是將來深靜脈血栓形成動物模型研究中需解決的問題，此外，大部分的造模方法都適宜于研究急性和慢性DVT，而對亞急性的模型研究較少。

現(xiàn)今的造模方法多種多樣，使得動物實驗研究能夠從宏觀到微觀、從病因到病程、從治療到診斷到預(yù)防，都充分體現(xiàn)著制備動物模型的重要性，但其實每種方法均存在其局限性，因此，深入了解每一種動物模型的優(yōu)勢和缺陷，包括詳細(xì)的特征描述，對于特定的研究問題選擇合適的模型是十分必要的。直到目前為止大多數(shù)造模方法還未建立統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)，相信隨著醫(yī)療科學(xué)技術(shù)的發(fā)展會讓造模更加的簡單和科學(xué)，對造模過程細(xì)節(jié)的把握也將更好，我們需要根據(jù)不同的研究目的以及不同的發(fā)病機(jī)制，選用不同的造模方法。終極的理想動物血栓模型是不存在的，我們還需進(jìn)行不斷的努力改進(jìn)現(xiàn)有的模型，開發(fā)出能更好地再現(xiàn)人類DVT的新模型，為臨床進(jìn)行早期干預(yù)治療提供最佳的治療時間和方式、減少并發(fā)癥的發(fā)生及改善預(yù)后提供重要的臨床參考價值。