楊林瑞，張風河

（山東大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院 口腔頜面外科/山東省口腔組織再生重點實驗室/山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室，山東 濟南 250012）

作為溴域及超末端結構（bromodomain and extraterminal domain，BET）家族中的一員[1]，溴結構域蛋白4（bromodomain 4，BRD4）通過調節(jié)細胞基因轉錄從而調節(jié)細胞周期，因此在正常細胞以及腫瘤細胞的生理活動中扮演著重要角色[2]。BRD4由以下幾個結構域組成：2個BD結構域（bromodomains，BDs），分別命名為BD1和BD2，BD結構域由4個被可變環(huán)區(qū)分開的α螺旋共同形成1個識別乙?；嚢彼岬氖杷涨唬?個ET（extraterminal）結構域，1個富含絲氨酸的SEED結構域，1個富含脯氨酸的C末端結構域（C-terminal district，CTD）以及最末尾的由83個氨基酸組成，結合正性轉錄因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）的區(qū)域（P-TEFb binding region）。其功能的實現(xiàn)也依賴于上述結構[3-5]。

BET家族蛋白（尤其是BRD4）基因的過度表達以及基因重排和基因突變常與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生有關[6-7]。BET家族蛋白在促進多種血液學惡性腫瘤如混合譜系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）、急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中c-myc等癌基因的異常表達、促進細胞異常增殖方面發(fā)揮重要作用[4,8-10]。BRD4作為一種遺傳易感性基因，它能預測乳腺癌的進展、轉移和預后，并通過調節(jié)細胞外基質基因的表達控制乳腺癌轉移[11-12]。在非小細胞肺癌細胞系中，BRD4表達明顯上調，并且高水平的BRD4往往與不良預后密切相關。而抑制非小細胞肺癌細胞系BRD4表達可降低腫瘤侵襲性，抑制腫瘤細胞增殖，加速細胞凋亡。2018年，Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)BRD4抑制劑可抑制eIF4E及下游基因表達，進而延緩非小細胞型肺癌細胞的生長。BRD4在原發(fā)和轉移性黑素瘤組織中均高度過表達，而BRD4抑制劑可迅速下調關鍵的細胞周期基因（如SKP2、ERK1和c-myc等）的表達，抑制黑色素瘤細胞增殖、腫瘤體積增長和在動物模型中的轉移。并且BRD4抑制劑對于BRAF或NRAS基因突變型黑素瘤細胞依然有效[14]。此外，BRD4蛋白在前列腺癌中也有顯著表達。在去勢性前列腺癌中，BRD4基因的下調導致細胞增殖能力和侵襲性的顯著降低，在小鼠模型中，BRD4抑制劑比直接應用雄激素拮抗劑表現(xiàn)出更強大的抗癌活性[15]。值得注意的是，BRD4可以作用于多種基因，且對于絕大多數(shù)原癌基因來說，它們幾乎均受BRD4的調控[16]，這一發(fā)現(xiàn)也為治療惡性腫瘤指明了新方向，目前BRD4抑制劑被認為是治療惡性血液病和惡性實體腫瘤的新希望。

本文分析BRD4及其抑制劑在轉錄調節(jié)中的功能及其與腫瘤細胞的相互作用，綜述BRD4抑制劑治療腫瘤的優(yōu)越性及局限性，進而為相應的臨床療法提供可行性分析及新的思路。

1 BRD4對于真核細胞轉錄的調節(jié)功能

作為一種轉錄和表觀遺傳調控因子，BRD4在胚胎發(fā)育和腫瘤形成過程中起著關鍵作用，由于BRD4對乙酰化程度高的蛋白親和力更高，因此它們與染色質內高度乙酰化的組蛋白區(qū)緊密結合，并作用于轉錄活性調控元件（如啟動子、增強子等），在轉錄的起始和延伸階段促進基因轉錄[17]。

BRD4最初被發(fā)現(xiàn)時被認為是一種控制細胞周期的蛋白。在有絲分裂過程中，它能與染色體結合并標記在G1期準備轉錄的基因，保證正常的細胞周期[18]。它還在胚胎的發(fā)育期通過直接或與轉錄因子協(xié)同的方式調控胚胎干細胞的轉錄過程以及實現(xiàn)多能干細胞的自我更新[19]。BRD4同時還在脂肪細胞和肌肉細胞的形成中起重要作用[20]。使用BRD4抑制劑干擾BRD4的活性，還會影響成骨細胞礦化成骨[21]。總而言之，BRD4能識別組蛋白密碼（histone code），并通過與具有譜系特異性的轉錄因子結合，在高度乙?；途哂袕娹D錄傾向的染色質區(qū)域（主要是啟動子和增強子）中大量累積，進而促進RNA聚合酶II（RNA-Pol II）的活化[22-23]。這些功能的實現(xiàn)，主要但并不完全依賴于BRD4的BD識別乙?；鞍椎哪芰21]。

1.1 BRD4在真核細胞轉錄起始階段的作用

RNA Pol II在轉錄前復合體（preinitiation complex，PIC）上與啟動子結合，并通過C末端結構域第5位絲氨酸（Ser5）磷酸化保持其結構的穩(wěn)定并加強與啟動子的結合[24]。PIC的形成，既受增強子的影響又由轉錄因子和其他轉錄調控蛋白控制[25]。其中，中介因子復合體（Mediator）發(fā)揮著中心作用。在轉錄起始階段，中介因子復合體與通用轉錄因子（general transcription factors，GTFs）相互作用，促進PIC的形成和CTD的磷酸化，還可促進增強子與轉錄因子結合并與啟動子區(qū)域相互作用[26]。同時，中介因子復合體還可與聚合酶II多肽M（polymerase II polypeptide M，POLR2M）和超級延伸復合物相互作用，調控RNA Pol II引導的轉錄起始、暫停和延伸過程。BRD4作為中介因子復合體的輔助因子，與中介因子復合體在增強子，尤其是在超級增強子中共定位。

增強子由成簇的轉錄因子結合位點構成。這些結合位點構成可供轉錄調節(jié)復合體結合的平臺[27]。一方面，轉錄因子主要與增強子結合，另一方面轉錄因子以及染色質修飾蛋白還可與BRD4互相作用，因此BRD4和轉錄因子之間的化學反應既影響B(tài)RD4與增強子的結合，又決定了靶基因對于BRD4的敏感性[23]。而轉錄因子通過乙?；D移酶，促進核小體和/或其他的非組蛋白甚至轉錄因子自身的乙?；珺RD4與這些乙?；慕M蛋白和轉錄因子的結合還將穩(wěn)定轉錄因子與增強子的結合，從而維持高轉錄活性。在某些情況下，BRD4通過乙?；D移酶的介導，在組蛋白乙?；膯幼雍驮鰪娮又芯奂?。而在另一些情況下，BRD4也可以直接作用于轉錄因子以及染色質修飾蛋白，這種直接作用既可以通過BDs[28]（這種方式依賴于轉錄因子的乙?；癄顟B(tài)），也可以通過其他的BRD4結構域，這種方式既不需要乙?；D移酶的活性，也不受BRD4抑制劑的影響，并具有獨特的選擇特異性[29]。

通過這些相互作用，BRD4松解（decompacting）染色質和加速mRNA的合成以促進轉錄起始。而BRD4與轉錄因子結合的特異性及其激活的下游信號通路對于研究BRD4靶基因的選擇特異性有重要意義。

1.2 BRD4在真核細胞轉錄延長階段的作用

啟動子清除后，RNA延伸到23 nt時，即進入轉錄過程中的主要限速步驟。Pol II C末端結構域第五位絲氨酸被轉錄因子TFIIH的CDK7亞基磷酸化，磷酸化后的Pol II CTD能結合加帽酶并增強其活性，為新生的RNA鏈5'端加帽（capping）[30]，此時轉錄暫時停滯[31]，轉錄延伸抑制子（negative transcription elongation factor,NTEF） 在其中起重要作用。NTEF由兩部分組成，分別是DRB敏感性誘導因子（DRB-sensitivity inducing factor，DSIF）和負性延伸因子（negative elongation factor,NELF）[32]。加帽結束后，正向轉錄延長因子b（positive transcription elongation factor-b，P-TEFb）將DSIF的Spt5亞基[33]和NELF的RD亞基[34]分別磷酸化，磷酸化的NELF從RNA Pol II上解離，并解除抑制作用。磷酸化的DSIF仍留在RNA Pol II上，并發(fā)生功能逆轉起促進轉錄延伸的作用[32]。P-TEFb由細胞周期蛋白依賴性激酶CDK9與調節(jié)亞基周期蛋白Cyclin T1/T2a/T2b組成，并具有激酶活性[35]。它能進一步磷酸化Pol II CTD上的Ser2[36]，使得Pol II的轉錄延伸活性恢復，使轉錄繼續(xù)進行。BRD4作為BET家族中唯一與P-TEFb反應者[22]，BRD4的CTD與P-TEFb的結合將減少P-TEFb與抑制型核糖核酸蛋白復合物7sk/HEXIM的結合（HEXIM通過將P-TEFb以非活性形式隔離以實現(xiàn)轉錄抑制）[37]，BRD4在高度乙?；途哂修D錄活性的轉錄起始位點上的積累可作為P-TEFb的對接位點，從而促進RNA Pol II的激活及轉錄延長。其中最具有代表性的例子是精氨酸去甲基酶JMJD6[38]，JMJD6與BRD4選擇性地共定位于一組特定的遠程活性增強子，這些增強子的特征是高水平的組蛋白3第4號賴氨酸的甲基化（H3K4Me1）和組蛋白3第27位賴氨酸乙?；℉3K27Ac），并被命名為抗暫停增強子。BRD4和JMJD6與抗暫停增強子結合后，一方面對與轉錄抑制相關的組蛋白4第3號精氨酸的甲基（H4R3Me1和H4R3Me2）去甲基化以解除轉錄抑制，另一方面對7SK RNA的5'-甲基-磷酸帽去甲基化，導致其降解及P-TEFb的局部活化，使轉錄延長繼續(xù)進行。

BRD4除了在活性啟動子和增強子上富集外，還與具有高度轉錄活性的基因主體（gene body）結合，基因表達活性的改變，都與BRD4在基因主體上的位置改變密切相關。核小體也可以阻止RNA-Pol II與基因主體結合，從而抑制轉錄延長和基因表達[38]。此外，放線菌素b對轉錄進行的干擾也顯著減少了與靶基因結合的BRD4的量?；谶@一現(xiàn)象，Kanno等[39]認為BRD4作為分子伴侶，利用其與乙?；M蛋白相互作用的能力，促進RNA-Pol II快速通過高度乙?；暮诵◇w，完成轉錄延長。

1.3 BRD4如何作用于增強子/超級增強子

為了深入了解BRD4的致病功能，Zhang等[40]通過結合位點分析法（ChIP-seq）對BRD4在染色質中的位置進行全基因組分析，結果表明：無論是正常還是轉化細胞，其基因組中幾乎所有的有活性啟動子以及數(shù)量眾多的活性增強子均與BRD4有聯(lián)系，這一發(fā)現(xiàn)符合其作為基本調節(jié)因子的假設。此外，BRD4在染色質中的位置還與幾種不同的組蛋白乙酰化標記（如H4K5、H4K8、H3K9和H3K27）有關，這也符合它通過溴域介導的富集機制[16]。

此外，Delmore等[41]通過對多發(fā)性骨髓瘤細胞系MM1.S 的myc位點的進行觀察發(fā)現(xiàn)，在該細胞系中，myc基因異常高表達。而BRD4抑制劑可以極大程度地抑制myc轉錄，且鄰近的增強子區(qū)域常表現(xiàn)出高水平的BRD4占有率。值得注意的是，此區(qū)域中發(fā)生IgH增強子區(qū)域的易位（此易位常常與不良預后相關），并且IgH增強子區(qū)域的BRD4占用率比起啟動子區(qū)域高10倍以上，這表明該細胞系主要是通過增強子以實現(xiàn)依賴BRD4的轉錄激活[8]。在白血病細胞中，雖然沒有發(fā)生myc位點的基因重組，BRD4抑制劑同樣能抑制myc基因轉錄。白血病細胞擁有一組可與BRD4特異性結合的增強子，這些增強子位于myc啟動子下游1.7 MB（megabase），可與多種造血相關的轉錄因子結合，并與myc啟動子發(fā)生長程環(huán)狀相互作用[42]?；蚪M范圍的研究表明，BRD4在基因組中廣泛分布。然而，癌癥相關基因的表達似乎均依賴于BRD4的c-myc模式[16]。雖然myc在大多數(shù)增殖的細胞中普遍表達，但調節(jié)該基因的增強子卻具有高度細胞特異性，這也解釋了為何不同細胞以及同種細胞myc位點上不同構型的增強子對BET抑制劑敏感性各異。

上文已經(jīng)提到，BRD4可以作用于各種細胞基因組中的眾多增強子，但在多發(fā)性骨髓瘤MM1.S細胞系中，只在IgH區(qū)域有不到300個增強子表現(xiàn)出了高親和性，這些增強子因其對BRD4高親和性以及橫貫數(shù)十kb（kilobase）的大小而被命名為超級增強子。超級增強子是基因組中緊密相鄰的大量增強子簇，具有與常規(guī)增強子不同的功能特性[43]。

Lovén等[16]提出一種假說，由超級增強子調控的基因對BET抑制劑更為敏感。這一假設基于在MM1.S細胞[16]和Ly1淋巴瘤細胞[44]中進行的全基因組分析發(fā)現(xiàn)與位于典型增強子附近的基因相比，位于超級增強子附近的基因的mRNA水平更容易被JQ1下調。然而這種差異的幅度相當小，但Lovén等[16]認為是因為缺乏對于不同mRNA半衰期差異的考慮，以及假設增強子只調節(jié)離它最近的基因的表達導致了這種差異性的減少。此外，最近Sengupta等[43]發(fā)現(xiàn)BET抑制劑的癌基因特異性可能是一個定量的結果：超級增強子區(qū)域中轉錄因子和調節(jié)因子結合的濃度，以及H3K27Ac和H3K3Me1的數(shù)量，均超過了常規(guī)增強子至少一個數(shù)量級。由此可見，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，超級增強子在維持細胞特性，驅動特定癌細胞高度依賴的致癌基因的表達方面起核心作用。全基因組研究表明，超級增強子可標記多種惡性腫瘤中的特異性轉錄因子及原癌基因，說明超級增強子在腫瘤發(fā)生過程必不可少，而且為癌細胞特有，其在未發(fā)生轉化的細胞中幾乎不存在[45]。

2 BRD4抑制劑治療的優(yōu)點及局限性

目前的BRD4抑制劑可分為單價型和二價型。單價BRD4抑制劑分別與BRD4蛋白的兩個溴域結合。而二價BRD4抑制劑能夠同時結合BRD4的 2個溴域。單價BRD4抑制劑根據(jù)其化學結構，可分為三氮唑類衍生物、異惡唑類衍生物、吡啶類衍生物、四氫喹啉類衍生物等[46]。JQ1是發(fā)現(xiàn)最早、研究最透徹的小分子BRD4抑制劑，它通過與BRD4的Asn140、Tyr97殘基形成氫鍵，從而與BRD4形成穩(wěn)定的結合[17]，以它為代表的這些與乙?；鶊F成分類似的分子，通過與染色質的乙?；鶊F競爭結合位于BD上的乙酰賴氨酸結合口袋（acetyl-lysine binding pocket），將BRD4從染色質中分離出來，進而阻止原癌基因的轉錄[8]。

JQ1的療效最早中線癌（midline carcinoma，NMC）中得到驗證，它是一種以t（15；19）（q13，p13.1）易位為特征的低分化高致命性的鱗癌，其t19處的斷點是BRD4的作用位點，BRD4可以通過染色體易位發(fā)生突變，并與NUT基因框內融合形成BRD4-NUT融合基因，該基因具有強致癌性[47]。由此產(chǎn)生的BRD4-NUT蛋白是一種異常的轉錄調節(jié)因子，其致癌功能依賴于BRD4的溴域。因此，這種惡性腫瘤為BET抑制劑的初步治療評價提供了明確的理論基礎[48]。在中線癌細胞系中，JQ1處理導致染色質釋放BRD4-NUT，并引起鱗狀細胞的終末分化和凋亡。此外，在患者來源的中線癌異種移植模型中，每日使用對正常組織毒性最小劑量的JQ1可延長荷瘤小鼠的存活時間[49]。而在預后較差的三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中[50]，2016年，Shu等[51]發(fā)現(xiàn)BRD4抑制劑對三陰性乳腺癌具有顯著療效。除此之外，在口腔上皮鱗癌和唾液腺腺樣囊性癌的體外實驗中也證明，JQ1能夠在不傷及正?？谇簧掀ぜ毎那闆r下抑制腫瘤細胞生長、轉移及侵襲[52-54]。

之前已經(jīng)提到，BRD4作為通用調控因子，通過P-TEFb相互作用影響Pol II的活性進而調節(jié)轉錄。JQ1作用于靶細胞導致mRNA水平和總Pol II ser2磷酸化水平的降低[16]。然而，并非所有基因都等同地受到JQ1的影響，在不同的位點上，轉錄受到不成比例的抑制。需要強調的是，BET抑制劑通常具有高度的選擇特異性。例如，用JQ1治療白血病細胞會導致顯著的myc基因表達抑制，而用JQ1處理成纖維細胞則對myc水平的影響很小[10,55]。那么BET抑制劑在腫瘤治療中的分子機制究竟是怎樣的呢？

在轉錄的起始階段，BET抑制劑干擾BRD4與中介因子復合體的共定位。BET抑制劑處理后，中介因子復合體在早期即解體成組成該復合體的各種調控蛋白。并且對于BET抑制劑敏感度越高的成分越早解體[56]。這表明了BET抑制劑細胞毒性的核心機制之一即為抑制中介因子復合體。BET抑制劑還能持續(xù)抑制BRD4富集的增強子中增強子相關RNA（enhancer-associated RNA，eRNA）的轉錄，使BRD4與目標增強子分離，阻止BRD4-RNA Pol II復合體與這些增強子的相互作用，導致RNA Pol II募集減少，進而eRNA合成減少[39]。那么這種選擇性是如何產(chǎn)生的呢？Donato等[57]提出了一種可能影響B(tài)ET抑制劑基因靶向選擇性的代償機制：對于BET抑制劑不敏感的基因可以通過增加轉錄起始位點上的RNA-Pol II募集和轉錄起始來彌補BRD4抑制引起的轉錄延長的損傷。然而這對BRD4高度依賴的基因卻難以實現(xiàn)，因為這些基因為了維持高的轉錄率早已最大限度地在轉錄起始位點上裝載RNA-Pol II。BRD4抑制引起的轉錄延長阻滯阻礙了啟動子的清除和RNA-Pol II的進一步補充，從而使BET抑制劑對高表達基因具有選擇易感性[57]。

對于超級增強子的抑制會導致原癌基因表達的急劇下降，從而導致癌細胞生長抑制甚至死亡。Lovén等[16]發(fā)現(xiàn)BRD4與中介因子復合體以及P-TEFb在超級增強子上大量積累。超級增強子中，BRD4與中介因子復合體共同作為高密度轉錄復合體組裝的催化劑，改變了染色質的結構及功能。BET抑制劑會優(yōu)先抑制與這些轉錄元件（包括c-myc或其他與超級增強子相關的MM相關基因如IGLL5、IRF4和XBP1）結合的BRD4進而導致超級增強子功能的喪失，從而導致轉錄延長缺陷和癌基因表達的阻滯[16]。

然而俗話說得好，“道高一尺魔高一丈”，對于腫瘤來說，單一療法往往會因耐藥突變體的產(chǎn)生而變得療效不佳，BRD4抑制劑也是如此。許多腫瘤均以不同的方式表現(xiàn)出對BRD4抑制劑的耐受性[58-59]。研究表明，對BRD4抑制劑的獲得性耐藥也可能與突變無關。在AML中，當BRD4受抑制時，c-myc的表達可通過激活Wnt信號通路進行代償，這一代償?shù)氖峭ㄟ^局部轉錄環(huán)境的變化實現(xiàn)的。這一現(xiàn)象表明腫瘤細胞可通過局部激活myc增強子等其他方式進行轉錄調節(jié)以拮抗BET抑制劑。

除此之外，絕大多數(shù)的BRD4抑制劑只能同時抑制BD1和BD2，因此不能作為選擇性化學探針來分別研究各個溴域的功能。并且由于BET家族蛋白在結構上具有高度同源性，但其下游基因調控卻各不相同，上述藥物對于BET家族成員的選擇性較低，往往會影響其他基因表達，導致一系列副作用[60]。因此，盡管BET抑制劑的體外和體內研究都證實了靶向抑制并顯示出潛在的治療效果；然而，在使用BET抑制劑的癌癥患者中進行的I期臨床試驗卻未能顯示出顯著的療效，這表明BET抑制作為單一藥物治療的療效可能有限[61-62]。

3 總結與展望

綜上所述，BRD4是基因組功能和穩(wěn)定性的重要組成部分。通過閱讀組蛋白密碼，BRD4可以檢測到高度乙?；娜旧|位點（如增強子、端粒等），并在這些位點上積累，從而促進功能相關的多蛋白復合物的聚集和穩(wěn)定[23]。BRD4在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起到的中心作用為BET抑制劑的細胞毒性原理提供了新的解釋，特別是為這些藥物的臨床應用提供了更加廣泛的可能性。值得注意的是，即便是BRD4這樣作用于眾多基因的基礎轉錄調控因子也可以在靶向藥物的作用下誘發(fā)特定的生物學效應，這也為我們尋找其他染色質調控藥物作用靶點提供新的思路。

越來越多的臨床試驗表明，BET抑制劑聯(lián)合免疫治療和其他藥物療效更佳。研究證明BRD4抑制劑能有效抑制他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞的生長，并且在他莫昔芬耐藥的乳腺癌異種移植小鼠模型中，BRD4抑制劑和雌激素拮抗劑氟維司瓊聯(lián)合療法具有強效而持久的抗癌作用[63]。在myc基因導致的淋巴瘤中，與單獨使用任何一種治療藥物相比，聯(lián)合使用JQ1和PD-1單克隆抗體顯著降低了腫瘤大小并延長了總生存期[64]。鑒于許多激酶抑制劑的理化性質和藥物動力學均已經(jīng)研究的較為透徹，開發(fā)“激酶加BRD4抑制劑”的聯(lián)合療法不失為一個有效策略。

盡管這些藥物的成功應用已經(jīng)從一開始的myc依賴性的血液惡性腫瘤擴展到實體腫瘤，但仍未完全明確這些藥物對癌癥特異性易感性是如何造成的。鑒于BRD4在各種體細胞中廣泛表達。并在非癌細胞中也與許多啟動子和增強子結合[23]，抑制BRD4這樣的基礎染色質調控因子是如何導致原癌基因的選擇性抑制的，其機制尚未完全明確，加上BRD4對于BET家族較低的特異性，我們不妨將目光放在不同疾病中BRD4上游（如乙酰轉移酶和轉錄因子）或下游（如內皮素相關因子或BCL2相關因子）效應因子。例如JMJD6因其能調控雌激素受體依賴的增強子和促進轉錄起始，現(xiàn)已成為潛在的藥物治療靶點[38]。因此，針對與BRD4相互作用的小分子蛋白可能是另一種新的藥物研發(fā)策略。