劉士博 劉顯

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔頜面外科，成都 610041

腫瘤、創(chuàng)傷導(dǎo)致的骨生成不足及骨愈合不良，常造成患者生活質(zhì)量降低，治療時(shí)間延長(zhǎng)，給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)[1-2]。目前臨床修復(fù)骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)是自體骨移植，自體骨具有良好的生物相容性和臨床安全性，但同時(shí)面臨移植骨量有限、增加手術(shù)創(chuàng)傷等問題[3]。如何有效修復(fù)骨缺損，避免上述并發(fā)癥成為臨床亟待解決的問題。

骨損傷最初階段為炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞及炎性因子促進(jìn)干細(xì)胞募集、增殖并進(jìn)一步分化為終末細(xì)胞（骨細(xì)胞等）及非骨形成細(xì)胞（纖維細(xì)胞等），進(jìn)而促進(jìn)骨組織形成[4-5]。上述成骨過程涉及骨微環(huán)境中的多種細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、干細(xì)胞、成骨細(xì)胞（osteocblast，OB）、內(nèi)皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞相互影響、相互調(diào)節(jié)，進(jìn)而促使骨修復(fù)重建，然而細(xì)胞間信息如何相互交流的具體機(jī)制仍未得到明確解釋[6]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子，通過旁分泌途徑進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)交流，而多數(shù)細(xì)胞因子體內(nèi)半衰期較短（如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1激活后體內(nèi)半衰期僅2 min），作用半徑很小，無法有效進(jìn)行遠(yuǎn)端傳遞，而遠(yuǎn)端骨損傷時(shí)存在干細(xì)胞募集趨化行為[7]，推測(cè)骨缺損修復(fù)過可能存在某種細(xì)胞間通訊方式，促進(jìn)骨微環(huán)境中的細(xì)胞信號(hào)傳遞從而促進(jìn)骨組織形成。外泌體（exosome）作為旁分泌途徑的重要媒介，是細(xì)胞間交流和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要介質(zhì)，在骨損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，在組織工程中受到越來越多的關(guān)注。本文綜述了不同細(xì)胞來源外泌體在骨缺損修復(fù)中的重要作用，以期為外泌體應(yīng)用于骨組織工程促進(jìn)骨修復(fù)提供幫助。

1 外泌體生物學(xué)特征

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種亞型，可由多種細(xì)胞分泌，如DC、干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，廣泛分布于血清、尿液、唾液及其他體液中。分離提取外泌體主要有超速離心法、超濾法、試劑盒提取等方法[8]。

外泌體起初被認(rèn)為是細(xì)胞代謝排泄的廢棄物，隨著研究[9]發(fā)現(xiàn)，其對(duì)細(xì)胞間信號(hào)傳遞也有著至關(guān)重要的作用。外泌體內(nèi)容物多種多樣，并根據(jù)其源細(xì)胞不同而存在差異。外泌體可在細(xì)胞之間傳遞抗原呈遞分子、RNA、蛋白質(zhì)完成細(xì)胞間通訊，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的功能及活性[10]。研究[11]表明，受體-配體的相互作用在這一過程中起到了重要作用，外泌體可以通過跨膜蛋白直接與靶細(xì)胞信號(hào)受體相互作用，或與受體質(zhì)膜融合將內(nèi)容物遞送到胞質(zhì)中，也可內(nèi)化至受體細(xì)胞中從而發(fā)揮相應(yīng)生理作用。

2 不同細(xì)胞源性外泌體與骨修復(fù)

2.1 DC源性外泌體與骨修復(fù)

大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究[12]揭示了炎癥反應(yīng)與骨缺損修復(fù)的緊密聯(lián)系：骨缺損修復(fù)需要炎癥反應(yīng)的有效控制，過度的炎癥反應(yīng)可加速骨組織的破壞與吸收。免疫細(xì)胞參與抗原識(shí)別、特異性免疫應(yīng)答，對(duì)炎癥調(diào)節(jié)有重要作用，而DC作為免疫細(xì)胞的重要組成，其如何參與炎癥調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨缺損修復(fù)也逐漸受到關(guān)注。研究[13]表明，DC源性外泌體可抑制T細(xì)胞增殖從而延遲膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)作。DC可通過分泌外泌體攜載抑炎因子miR-155及抗炎因子miR-146a作用于T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[14]。DC源性外泌體除參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)外，還可作用于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），促進(jìn)骨修復(fù)再生所需活性因子的分泌，從而使骨向分化順利進(jìn)行。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示DC源性外泌體可促進(jìn)骨髓MSCs的遷移和募集，內(nèi)容物檢測(cè)其含有骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metal loproteinase-9，MMP-9）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-5等多種募集因子[15]。DC源性外泌體與MSCs共培養(yǎng)后，堿性磷酸酶（alka line phosphatase，ALP）及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加，MSCs表現(xiàn)出成骨向分化[16]。

2.2 干細(xì)胞源性外泌體與骨修復(fù)

干細(xì)胞除自身定向成骨分化，還可通過旁分泌途徑促進(jìn)骨再生，而外泌體作為重要的旁分泌介質(zhì)，對(duì)骨缺損修復(fù)有著至關(guān)重要的作用。

Liu等[17]發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中，移植的MSCs源性外泌體可傳遞Las至受損骨髓MSCs而提升其功能，從而改善骨質(zhì)疏松表型。研究[18]表明，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的骨髓MSCs分泌的外泌體與未經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓MSCs共培養(yǎng)后，后者骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix）、OPN等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表現(xiàn)出骨向分化。骨髓MSCs源性外泌體可減少骨髓MSCs凋亡及DNA損傷，促進(jìn)骨髓MSCs增殖，降低骨髓MSCs的放射性損傷[19]。另外，CD9-/-小鼠產(chǎn)生的外泌體數(shù)量較野生型小鼠少，骨折愈合速度顯著降低，而注射MSCs源性外泌體后，骨折愈合能力得到顯著提升[20]。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的MSCs源性外泌體可以促進(jìn)血管及新骨形成從而修復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠顱骨缺損[21]。

骨髓MSCs源性外泌體對(duì)OB的成骨分化同樣發(fā)揮重要作用。PKH67標(biāo)記的骨髓MSCs源性外泌體與OB共培養(yǎng)后，細(xì)胞中高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體等細(xì)胞器內(nèi)廣泛檢測(cè)到已標(biāo)記的外泌體，并且ALP、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、OPN及Runx2等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表明骨髓MSCs分泌的外泌體可以通過內(nèi)化方式被OB內(nèi)吞并促進(jìn)其成骨分化[22]。炎癥狀態(tài)下，脂肪干細(xì)胞源性外泌體可促進(jìn)OB的增殖和骨向分化[23]。

干細(xì)胞源性外泌體很大程度上是通過其攜帶的mi-RNA發(fā)揮成骨作用。Qin等[22]發(fā)現(xiàn)，miRNA抑制劑可顯著減弱骨髓MSCs源性外泌體介導(dǎo)的OB向分化，表明miRNA對(duì)外泌體促進(jìn)骨形成有重要作用，研究還發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs源性外泌體攜載的miR-196a、miR-27a及miR-206三種miRNA在誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮主要作用。另外，MSCs源性外泌體攜載的miR-191、miR-222、miR-21可促進(jìn)細(xì)胞增殖，miR-10b可促進(jìn)細(xì)胞遷移，miR-129、miR-136可調(diào)節(jié)血管形成[24-26]。

干細(xì)胞源性外泌體在促進(jìn)成骨作用的同時(shí)，還可以協(xié)助調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。MSCs可通過外泌體傳遞microRNAs以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)線粒體的循環(huán)利用而加強(qiáng)其抗炎活性[27]。骨髓MSCs源性外泌體可作為免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的成熟、凋亡與增殖[28]。

2.3 OB源性外泌體與骨修復(fù)

OB作為骨微環(huán)境的重要組成，可通過分泌外泌體參與調(diào)節(jié)成骨-破骨平衡。礦化的OB源性外泌體可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)miRNA的分泌，如miR-1192、miR-680及miR-302a，下調(diào)其軸抑制因子（axis inhibition，Axin）1的表達(dá)并促進(jìn)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)，促進(jìn)其成骨向分化，進(jìn)而促進(jìn)骨組織再生[29]。另外，OB前體細(xì)胞可分泌含礦化調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ相互作用蛋白1（transforming growth factor beta receptor Ⅱ interacting protein 1，TRIP-1）的外泌體，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化及骨組織形成[30]。

另有研究表明，OB可以通過分泌含核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF κB ligand，RANKL）的外泌體作為媒介促進(jìn)破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）形成。甲狀旁腺激素可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌大量攜載RANKL的外泌體，此外泌體與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)后可促進(jìn)OC形成，另外，NFATc1可通過去磷酸化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核從而促進(jìn)OC的形成和活化，是RANKL誘導(dǎo)OC形成的主要調(diào)節(jié)因子，而上述OC形成過程中檢測(cè)到NFATc1發(fā)生核易位；熒光標(biāo)記顯示外泌體與RAW264.7細(xì)胞表面結(jié)合，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)上述過程[7]。

2.4 OC源性外泌體與骨修復(fù)

骨代謝主要依靠OB的成骨分化與OC的破骨功能相互作用，達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的，因此，在加強(qiáng)成骨作用的同時(shí)，如何調(diào)節(jié)OC功能也十分重要。研究表明，OC源性外泌體表面核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）被消耗后，其對(duì)OC分化的抑制作用得到明顯緩解，表明OC源性外泌體可通過RANK-RANKL信號(hào)途徑調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化[31]。另外，研究[32]發(fā)現(xiàn)，OC源性外泌體表面蛋白ephrinA2可以靶向結(jié)合OB表面受體EphA2而抑制OB活性。miRNA-214與骨改建密不可分，在骨折的老年女性以及骨質(zhì)疏松大鼠血清中，miRNA-214含量較正常情況下顯著增高。Li等[33]研究表明，OC可分泌外泌體攜帶miRNA-214作用于OB，抑制其成骨及礦化活性，miRNA-214活性抑制后，其抑制成骨的作用隨之緩解。

2.5 內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體與骨修復(fù)

骨組織再生與血管形成同樣有著密不可分的聯(lián)系。內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)血管再生，對(duì)血管完整性的建立和維持至關(guān)重要。內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體含有miRNA-214，一種調(diào)控血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞功能的活性因子，在作用于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞后，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其遷移，最終促進(jìn)血管形成[34]。研究[35]表明，老年或骨質(zhì)疏松患者內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體包含有miRNA-31，骨髓MSCs經(jīng)miRNA-31作用后成骨分化被抑制。上述研究提示，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成血管與成骨作用呈相反的生理效應(yīng)，該兩種生理功能是否相互制約或如何達(dá)到平衡狀態(tài)從而使骨缺損得到有效修復(fù)仍有待研究。

綜上所述，骨缺損修復(fù)包括炎性調(diào)節(jié)、血管形成及骨組織再生改建等生理過程，骨環(huán)境中的DC、干細(xì)胞、OB、OC與內(nèi)皮細(xì)胞可通過分泌外泌體從上述不同過程參與調(diào)節(jié)骨修復(fù)，外泌體因?yàn)槠洫?dú)特的生物學(xué)性質(zhì)，可能成為骨缺損疾病治療的有效途徑[36-37]。應(yīng)用外泌體修復(fù)骨缺損的方法相對(duì)于傳統(tǒng)骨移植有諸多優(yōu)勢(shì)，如可通過膜融合的方式被受體細(xì)胞內(nèi)化并利用；含有多種具有成骨作用的活性因子；可近程或遠(yuǎn)程傳遞并作用于靶細(xì)胞，其囊泡結(jié)構(gòu)可以避免其包含的小分子物質(zhì)在傳遞過程中被降解；可避免免疫排斥；可與多種生物材料聯(lián)合用于修復(fù)骨缺損[38]。

然而，外泌體的應(yīng)用仍具有一定的局限性。目前，外泌體對(duì)骨缺損修復(fù)的體內(nèi)體外研究大多只針對(duì)局部因素或某單一類型細(xì)胞對(duì)骨再生的作用，而其系統(tǒng)性的解釋和機(jī)制并未得到有效證明；不同細(xì)胞源性外泌體對(duì)骨缺損修復(fù)可表現(xiàn)出相同或相反的效應(yīng)，而這些外泌體如何相互促進(jìn)或相互抑制目前并沒有得到明確解釋；外泌體攜載成分及其如何作用靶細(xì)胞的具體機(jī)制也尚未得到確切闡明。

不同細(xì)胞源性外泌體可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)成骨分化、抑制破骨功能、促進(jìn)血管再生從而促進(jìn)骨組織形成，為骨缺損的治療提供新思路和新方法。外泌體包含多種生物活性因子，對(duì)其進(jìn)一步的性質(zhì)與功能分析可為開發(fā)骨缺損修復(fù)的治療性外泌體提供可能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。