嚴(yán)智超，華海清，李元喜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系，南京 210095)

赤眼蜂Trichogrammaspp.隸屬膜翅目Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea，赤眼蜂科Trichogrammatidae，是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛、最成功的一類卵寄生蜂，已被廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、棉花、果蔬、林木等多種農(nóng)林害蟲的防控，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益(Smith, 1996; 何曉芳等, 2005; 張俊杰等, 2015)。赤眼蜂屬種類繁多，已報道有200余種，其寄主范圍廣泛，可寄生鱗翅目、半翅目等7個目500多種昆蟲的卵，其中特別對鱗翅目農(nóng)林害蟲的防控作用尤為顯著(Pinto, 1999; 胡紅英, 2003)。不同赤眼蜂對不同寄主和生境具有偏好性，其種類和品系的選擇是影響其田間防效的重要因素。此外，對于監(jiān)測、避免赤眼蜂人工繁育中的蜂種混雜以及追蹤、評估其田間釋放后的防控效果，赤眼蜂的鑒定無疑都是至關(guān)重要的(胡紅英, 2003; Stouthamer, 2006)。

然而，由于赤眼蜂體型微小(僅0.5 mm左右)，又缺乏明顯的種間形態(tài)差異，其分類鑒定一直是研究的難題(Nagarkatti & Nagaraja, 1977; 胡紅英, 2003; 何曉芳等, 2005)。早期研究曾以赤眼蜂體色、觸角、翅毛等特征進(jìn)行分類鑒定，造成了許多混亂。其中一個原因是，赤眼蜂的這些性狀具有發(fā)育可塑性(Pintoetal., 1989)。如，松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi在25℃以上培養(yǎng)出來的雌蜂呈通體黃色，而在接近發(fā)育起點溫度培養(yǎng)的則呈通體黑褐色。Flanders和Quednau(1960)提出了應(yīng)在相同溫度、濕度和寄主條件下進(jìn)行赤眼蜂培養(yǎng)用以準(zhǔn)確鑒定，但由于操作繁瑣未能推廣開來。一些學(xué)者先后逐漸認(rèn)識到赤眼蜂雄外生殖器在其分類鑒定中的重要性。Nagarkatti和Nagaraja(1968，1971)率先系統(tǒng)性地對雄外生殖器特征進(jìn)行了描述，并以此為主要分類鑒定依據(jù)，開啟了赤眼蜂的現(xiàn)代分類學(xué)研究。此后，雄外生殖器快速成為本屬分類鑒定所用的普遍特征，赤眼蜂屬的分類研究也從1971年僅知的十余種(Nagarkatti & Nagaraja, 1971; 何曉芳等, 2005)發(fā)展至今報道有200余種(Pinto, 1999; Stouthamer, 2006)。

但基于赤眼蜂形態(tài)的傳統(tǒng)分類鑒定仍存在以下明顯缺陷：(1)對專業(yè)技術(shù)要求高，且耗時費力；(2)難以區(qū)分一些近緣種，也無法鑒定隱存分類單元；(3)無法鑒定殘缺標(biāo)本，及雄蜂之外的其他發(fā)育階段；(4)難以鑒定孤雌產(chǎn)雌的赤眼蜂品系(Stouthameretal., 1999; Stouthamer, 2006)。因而，赤眼蜂的分類研究亟需更準(zhǔn)確、便捷、高效的鑒定方法。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分子鑒定技術(shù)被應(yīng)用于赤眼蜂的分類鑒定，對基于形態(tài)特征的傳統(tǒng)分類鑒定予以了豐富與補充。本文就赤眼蜂屬分子鑒定中常用的方法進(jìn)行簡短的綜述。

1 分子標(biāo)記的選擇

大量的研究表明，選擇合適的分子標(biāo)記是成功分子鑒定的關(guān)鍵(Behura, 2006; Stouthamer, 2006; 黃帥和胡紅英, 2006; Gariepyetal., 2007)。在赤眼蜂分子鑒定的研究中，常用的分子標(biāo)記有同工酶，如酯酶等，以及DNA片段，如微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)、核糖體DNA、線粒體DNA等。

同工酶具有多態(tài)性，可用于赤眼蜂種間的區(qū)分鑒定。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后對同工酶的酶譜進(jìn)行分析，根據(jù)同工酶譜帶的不同，對物種、群體進(jìn)行鑒定，即同工酶電泳法(Isoenzyme Electrophoresis)(Murthyetal., 2013)。Voegele和Berge(1976)首次將該方法引入赤眼蜂分子鑒定的研究。之后，同工酶電泳法在赤眼蜂分子鑒定研究中主要流行于20世紀(jì)80至90年代(何曉芳等, 2005)，主要采用的同工酶標(biāo)記有酯酶、蘋果酸脫氫酶、過氧化物歧化酶等，其中最常用的標(biāo)記為酯酶(Kazmer, 1991; 黃壽山等, 1991; Pintureau, 1993; 霍紹棠等, 1994)。然而，同工酶等蛋白質(zhì)與DNA分子標(biāo)記不同，容易降解、失活，需要大量的新鮮或凍存的樣品，且同工酶的豐度、活性也可能受到發(fā)育階段、性別、環(huán)境等影響(何曉芳等, 2005; Murthyetal., 2013; Yazlovetskyetal., 2015)。因此，同工酶電泳法也逐漸在赤眼蜂分類鑒定研究中被舍棄。

隨著PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)的發(fā)明與普及，DNA分子標(biāo)記越來越多地應(yīng)用于赤眼蜂分子鑒定的研究(Stouthamer, 2006; 黃帥和胡紅英, 2006)。相較于蛋白質(zhì)，DNA分子可通過PCR進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從而大大減少對初始樣本量的需求，十分適合赤眼蜂等微小昆蟲的分子鑒定。另，DNA不具有發(fā)育可塑性，對不同的發(fā)育階段均可以鑒定。其中，在赤眼蜂分子鑒定中，采用的DNA分子標(biāo)記有微衛(wèi)星DNA、核糖體DNA和線粒體DNA。

微衛(wèi)星DNA也被稱作簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats，SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeats，STR)，由1～6個堿基的重復(fù)單元組成(Richardetal., 2008; Gulcher, 2012)。SSR廣泛分布于真核生物的整個基因組，較基因組其他區(qū)域具有更高的突變速率，也更為豐富的多態(tài)性，因而常被用于群體結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜繪制、個體雜合度檢測等多個領(lǐng)域(Gulcher, 2012)。然而，SSR分析的方法開發(fā)常需要文庫構(gòu)建和篩選，以獲得微衛(wèi)星兩側(cè)的序列用于引物設(shè)計，成本較高且耗時費力，一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用(Zaneetal., 2002)?；赟SR分析的基礎(chǔ)，Zietkiewicz等(1994)進(jìn)一步提出簡單重復(fù)序列間區(qū)(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR分析的引物即為在SSR序列的3′端或5′端加上2～4個隨機(jī)堿基，用于擴(kuò)增引物錨定的重復(fù)序列間的間隔DNA片段。ISSR分析無需靶序列的背景信息，較SSR更便捷高效，但由于是隨機(jī)引物錨定，其重復(fù)性不及SSR(Zietkiewiczetal., 1994)。在赤眼蜂分子鑒定研究中，SSR和ISSR分析的應(yīng)用都較少，主要應(yīng)用于赤眼蜂雜合度的檢測和種內(nèi)不同種群間的區(qū)分(Landaisetal., 2000; Vavreetal., 2004; Borbaetal., 2005; Pizzoletal., 2005; 付海濱, 2006; 付海濱等, 2006; 裴毅夫等, 2009; Lu & Han, 2016)。

核糖體DNA是分子鑒定中常用的分子標(biāo)記。核糖體DNA在基因組中具有大量的拷貝數(shù)，即使DNA部分降解，也可以成功擴(kuò)增。一個核糖體DNA轉(zhuǎn)錄單位由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)兩個部分組成，包括3個基因18S、5.8S、28S及兩個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)，即ITS1和ITS2(Wellauer & Dawid, 1977; Srivastava & Schlessinger, 1991)。其中，ITS不直接編碼核糖體RNA，其進(jìn)化速率相對較快，即使在近緣物種中也會出現(xiàn)長度及序列的差異，因此可以用于物種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的解析。其中，ITS2被廣泛用于赤眼蜂的分子鑒定中，對美國、葡萄牙、澳大利亞、中國、南非、印度等多個國家地區(qū)的赤眼蜂展開了分子鑒定的研究(Silvaetal., 1999; Stouthameretal., 1999; Querinoetal., 2001; Pintoetal., 2002; Li, 2007; Kumaretal., 2009; Sumeretal., 2009; Karimietal., 2012; Poorjavadetal., 2012; Nasiretal., 2013; Zoubaetal., 2013; Almeida & Stouthamer, 2015)。然而，核糖體DNA無法區(qū)別一些近緣的赤眼蜂種。如，ITS2無法區(qū)分微小赤眼蜂T.minutum及其近緣種T.platneri(Stouthameretal., 2000)，而線粒體分子標(biāo)記COII則可將其區(qū)分(Borghuisetal., 2004)。此外，核糖體DNA在同一個體的多個拷貝間存在序列多態(tài)性，如ITS2的不同拷貝在同一個個體中可達(dá)到4%的序列差異(Richetal., 1997)，這給后續(xù)的限制性內(nèi)切酶鑒定、測序分析等帶來了一定的不便和不確定性。

另一類常用的分子標(biāo)記是線粒體DNA。與核糖體DNA不同，線粒體DNA經(jīng)母系遺傳，同一個體內(nèi)不具有異質(zhì)性(Cameron, 2014; Hill, 2015)。另，昆蟲線粒體基因的進(jìn)化速率遠(yuǎn)高于核基因，這種現(xiàn)象在赤眼蜂等膜翅目昆蟲中尤為明顯(Yanetal., 2019)。同樣的，線粒體基因也存在大量的拷貝數(shù)，容易擴(kuò)增(Cameron, 2014)。由于種種優(yōu)點，線粒體DNA被廣泛應(yīng)用于物種的分子鑒定，線粒體基因COI更是被選為通用的物種條形碼(Cameron, 2014)。在赤眼蜂分子鑒定研究中，曾采用的線粒體分子標(biāo)記有COI、COII、Cytb等，其中COI應(yīng)用最為廣泛(Borghuisetal., 2004; 付海濱, 2006; Huaetal., 2018)。但相較于ITS2，COI在赤眼蜂分子鑒定研究中起步較晚，研究也相對更少。然而，通過對19種赤眼蜂ITS2和COI兩個基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，Thiruvengadam等(2016)(Venkatesanetal., 2016)發(fā)現(xiàn)COI比ITS2具有更高的變異率，也更適合赤眼蜂屬不同種的區(qū)分與鑒定。

2 常用分子鑒定方法

1985年，Kary Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)(Saikietal., 1985; Mullis, 1990)。目前常用的赤眼蜂分子鑒定技術(shù)大多都是基于PCR技術(shù)發(fā)展而來，如對全基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、針對特定DNA片段的物種特異性PCR(Species-specific PCR，SS-PCR)，以及對DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的鑒定，如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率熔解曲線分析(High Resolution Melting Analysis, HRM)、測序比對等。

2.1 RAPD

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(以下簡稱RAPD)是由John Williams和John Welsh分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個小組幾乎同時發(fā)明于1990年，是一種建立在PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行DNA多態(tài)性分析的分子技術(shù)(Jainetal., 2010)。其原理是設(shè)計一系列隨機(jī)引物，對研究對象的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映基因組DNA的多態(tài)性，從而用于物種鑒定、系譜分析等(Jainetal., 2010)。RAPD不需要基因組的前期信息，操作也相對簡單。Landry等(1993)用隨機(jī)引物對短管赤眼蜂T.pretiosum等3種赤眼蜂進(jìn)行了總基因組的RAPD分析。Vanlerberghe-Masutti(1994)對廣赤眼蜂T.evanescens等7種赤眼蜂所提取的線粒體DNA進(jìn)行了RAPD分析。此后，Chang等(2001)、Li(2007)、Singh等(2008)、Ercan等(2012)等研究者也嘗試?yán)肦ADP用于赤眼蜂的分子鑒定。但是，RAPD對模板要求高，重復(fù)性差，且易受外來污染DNA(如寄主、共生菌等)的影響(Stouthamer, 2006; Li, 2007)。因此，RADP在赤眼蜂分子鑒定中也未能推廣開來。

2.2 PCR-RFLP

限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析(以下簡稱RFLP)是根據(jù)不同生物體內(nèi)某一區(qū)段的DNA序列存在多態(tài)性及限制性內(nèi)切酶識別具有專一性的特征，用一種或多種限制性內(nèi)切酶將不同生物體的同一基因片段分割成大小不同的片段，根據(jù)酶切后片段大小達(dá)到區(qū)分物種的目的(何曉芳等, 2005; Stouthamer, 2006)。早期，研究者曾直接對提取的赤眼蜂線粒體DNA進(jìn)行RFLP分析。Vanlerberghe-Masutti(1994)選用了11種限制性內(nèi)切酶對7種赤眼蜂的線粒體DNA進(jìn)行RFLP分析，并基于酶切片段長度的多態(tài)性嘗試對7種赤眼蜂的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行解析。然而，直接提取線粒體DNA對樣本量的需求較大。后來，人們主要采用先PCR對特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行RFLP分析，并逐漸成為了赤眼蜂分子鑒定的重要方法(Stouthamer, 2006)。

其中，基于ITS2分子標(biāo)記的PCR-RFLP研究最多，迄今已對來自美國、葡萄牙、中國、澳大利亞、印度、南非等多個國家地區(qū)的至少40余種赤眼蜂建立了基于ITS2的PCR-RFLP圖譜(Silvaetal., 1999; Stouthameretal., 1999; Querinoetal., 2001; Pintoetal., 2002; Li, 2007; Kumaretal., 2009; Sumeretal., 2009; Karimietal., 2012; Poorjavadetal., 2012; Nasiretal., 2013; Zoubaetal., 2013; Almeida & Stouthamer, 2015)。如，Stouthamer等(1999)采用MseI、EcoRI和MaeII三種限制性內(nèi)切酶，對北美地區(qū)的短管赤眼蜂T.pretiosum等7種赤眼蜂建立了基于ITS2序列的PCR-RFLP分子檢索表。Silva等(1999)選用ITS2為標(biāo)記基因，采用限制性內(nèi)切酶MnlI區(qū)分了葡萄牙常見的6種赤眼蜂。類似地，Li等(2007)采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對ITS2序列進(jìn)行PCR-RFLP分析，進(jìn)而區(qū)分鑒定中國4種常見的赤眼蜂，即松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T.ostriniae、擬澳洲赤眼蜂T.confusum和廣赤眼蜂T.evanescens。另，COI、COII、Cytb和ITS1等多種分子標(biāo)記也曾被用于赤眼蜂的PCR-RFLP分析(Sappaletal., 1995; Borghuisetal., 2004; 付海濱, 2006; Huaetal., 2018)。如，Hua等(2018)基于COI序列，采用了EcoNI、SspI和VspI三種限制性內(nèi)切酶，建立了稻螟赤眼蜂T.japonicum等8種赤眼蜂的PCR-RFLP分子檢索表。

PCR-RFLP不受赤眼蜂的發(fā)育階段、性別等限制，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定、操作也相對簡單，為傳統(tǒng)形態(tài)鑒定提供了有效的補充，已被廣泛地應(yīng)用于赤眼蜂的鑒定(Stouthamer, 2006; Gariepyetal., 2007)。但其缺點是只能鑒定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的變異，并且這些酶切位點在種內(nèi)也可能因突變存在異質(zhì)性，從而對鑒定結(jié)果造成一定影響。

2.3 物種特異性PCR

物種特異性PCR就是基于物種的DNA保守序列，設(shè)計物種特異性引物，再通過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳技術(shù)，直接通過目標(biāo)片段的有無或長短來進(jìn)行鑒定(Gariepyetal., 2007)。相對于PCR-RFLP，該方法省去了限制性內(nèi)切酶酶切的步驟，是赤眼蜂分子鑒定中一種較為快捷、高效的方法。而其最重要和最困難的部分是物種特異性引物的設(shè)計(黨向利，2003)。理論上，設(shè)計物種特異性引物需要測定該赤眼蜂種間與種內(nèi)的變異，進(jìn)而確定種間特異、種內(nèi)保守區(qū)域的序列。因此，研究者往往采用盡可能多的樣本來進(jìn)行分析檢測，并已建立了多種赤眼蜂的物種特異性PCR鑒定方法。

如，李正西和沈佐銳(2001)通過對多種赤眼蜂ITS2序列的比對，設(shè)計了松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T.ostriniae兩種赤眼蜂的物種特異性引物。黨向利(2003)進(jìn)一步通過ITS2序列的分析比較，設(shè)計了松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi等4種赤眼蜂的物種特異性引物。耿金虎等(2004)也基于螟黃赤眼蜂T.chilonis的ITS2序列設(shè)計了該赤眼蜂的物種特異性引物。類似地，付海濱(2006)基于線粒體Cytb基因設(shè)計了甘藍(lán)夜蛾赤眼蜂T.brassicae等4種赤眼蜂的物種特異性引物，實現(xiàn)了基于Cytb對4赤眼蜂的物種特異性PCR分子鑒定。

此外，還可以將多個分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物混合在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)，即多重PCR(Multiplex-PCR)(Gariepyetal., 2007)。多重PCR可高效地同時進(jìn)行多個分子標(biāo)記的擴(kuò)增，節(jié)省成本，經(jīng)濟(jì)便捷。多重PCR還可以確保至少一條條帶的成功擴(kuò)增，從而避免在常規(guī)PCR中常見的假陰性對結(jié)果判斷的干擾(Dangetal., 2005)。然而，多重PCR無疑對引物設(shè)計、PCR條件優(yōu)化等要求更高，如需要考慮到多對引物的退火溫度、不同引物間的競爭性結(jié)合等。Dang等(2005)根據(jù)37種赤眼蜂的序列比對，設(shè)計了擬澳洲赤眼蜂T.confusum和松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi的ITS2物種特異性引物，并加入ITS1的通用引物作為PCR成功與否的指標(biāo)，從而避免假陰性對結(jié)果判斷的干擾。Davies等(2006)也設(shè)計了多對澳洲赤眼蜂T.australicum和短管赤眼蜂T.pretiosum的物種特異性引物，并采用多重PCR方法加以鑒定區(qū)分。

2.4 HRM

高分辨率熔解曲線分析(以下簡稱HRM)是基于實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，以下簡稱qPCR)技術(shù)發(fā)展的一項低成本、高通量、高靈敏度、操作簡單的分子檢測技術(shù)，已被成功應(yīng)用于物種鑒定、基因分型和甲基化分析等諸多領(lǐng)域(Guttmannetal., 1977; Vossenetal., 2009)。該方法將熒光染料結(jié)合到雙鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，染料只有在與PCR產(chǎn)物結(jié)合時才會發(fā)出明亮的熒光。因此，在PCR之后，測量反應(yīng)熒光的同時升高擴(kuò)增子的溫度導(dǎo)致產(chǎn)生序列特異性熔解曲線，通過熔解曲線形狀的差異來區(qū)分?jǐn)U增片段間微小的序列差異(Vossenetal., 2009)。利用HMR對赤眼蜂的分子鑒定尚處于起步階段，相關(guān)報道較少。于超(2017)采用HRM分析技術(shù)獲得3種赤眼蜂COI基因的標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線，成功將松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi等3種赤眼蜂鑒定區(qū)分開來。進(jìn)一步，Rugman-Jones等(2017)采用羅氏的Rotor-Gene RG-3000 qPCR儀器，建立了無需DNA提取的HRM鑒定方法，并成功將T.platneri與田間存有的其他4種赤眼蜂區(qū)分開來。

相較RAPD、PCR-RFLP、物種特異性PCR等方法，HRM無需PCR后的凝膠電泳，更加快捷(Vossenetal., 2009; 李瀟和盧瑤, 2010)。且一次性可同時完成96或384個樣本的檢測分析，具有較高通量。成本上，HRM只需在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上增加飽和熒光染料，不需要設(shè)計特異性探針，成本也相對低廉。另，檢測完的樣品還可以用于其他的檢測，如后續(xù)的電泳、測序等一系列操作。然而，HRM對溫控的一致性有非常高的要求，需要特殊的儀器支持，而常規(guī)qPCR儀往往難以勝任(李瀟和盧瑤, 2010)。

2.5 測序比對

雖然，上述的方法均可以區(qū)別鑒定部分赤眼蜂物種，但都缺乏系統(tǒng)性，僅局限在部分地區(qū)展開研究，難以建立一個全面的檢索體系。如，PCR-RFLP所采用的限制性內(nèi)切酶各不相同，各研究間缺乏一定的比較性。而測序比對是指對特定的DNA序列進(jìn)行測序，再與已知的序列進(jìn)行比對，從而鑒定所測序的物種(Gariepyetal., 2007)。該方法可以直接提供分子標(biāo)記的序列信息，所積累的數(shù)據(jù)可以在種間、種內(nèi)等多各個層次展開研究，應(yīng)用于物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建、群體多樣性分析等多諸多方面(Stoeckle & Hebert, 2008; Cameron, 2014)。

Orrego等(1993)利用PCR擴(kuò)增并測序了短管赤眼蜂T.pretiosum和松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi的ITS1序列，之后赤眼蜂的相關(guān)分子標(biāo)記的序列信息不斷積累完善。截至2019年11月，生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)(Barcode of Life Data Systems, BOLD，www.boldsystems.org)已有來自37個國家2 700多條COI序列，覆蓋30個赤眼蜂的命名種；在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中，已積累有72個赤眼蜂命名種的ITS2序列。隨著測序成本的不斷下降，測序比對的方法無疑在赤眼蜂的分子鑒定中起到越來越重要的作用。Triapitsyn(2015)甚至提出，赤眼蜂新種的發(fā)表需上傳其多個分子標(biāo)記的序列。

然而，相較于PCR-RFLP、HRM等方法，測序的成本仍相對較高，周期相對較長。此外，值得注意的是，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中已上傳序列可能存在赤眼蜂物種的錯誤鑒定。如，在生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中，BOLD ∶AAD6262由一條標(biāo)記為食胚赤眼蜂T.embryophagum的COI序列與其他44條甘藍(lán)夜蛾赤眼蜂T.brassicae序列聚類在一起，提示潛在的物種鑒定錯誤。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，ITS2序列AF453568和AF453569所標(biāo)記物種為T.maidis，但后來發(fā)現(xiàn)其正確物種應(yīng)為廣赤眼蜂T.evanescens(Murthyetal., 2013)。另，Hua等(2018)通過對8種赤眼蜂、16個地理種群的COI序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析，也提示螟黃赤眼蜂T.chilonis來自印度種群的COI序列(KU575095)可能存在物種的錯誤鑒定。

3 總結(jié)與展望

赤眼蜂的分子鑒定相較于傳統(tǒng)鑒定具有十分突出的優(yōu)點，解決了之前赤眼蜂形態(tài)學(xué)鑒定中的一些難點，如雄蜂以外的發(fā)育階段、近緣種、孤雌品系的鑒定等(Stouthamer, 2006)。然而，赤眼蜂的鑒定還遠(yuǎn)無法做到完全依賴于分子鑒定，以后也不可能完全拋棄經(jīng)典的形態(tài)學(xué)鑒定。另外，所有可靠的分子鑒定方法的研究和開發(fā)，都必須建立在正確形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上(黨向利, 2003; Stouthamer, 2006; Huaetal., 2018)。

隨著組學(xué)技術(shù)的普及，赤眼蜂越來越多的組學(xué)信息得到了解析。目前已經(jīng)有赤眼蜂屬的1個基因組(Lindseyetal., 2018)、3個線粒體基因組(陳龍, 2016; Chenetal., 2018; Shenetal., 2019)及多個轉(zhuǎn)錄組發(fā)表(Zhangetal., 2016; Wuetal., 2017; Kerimaetal., 2018)。大規(guī)模的比較組學(xué)分析使得全面、系統(tǒng)地篩選、評估新型分子標(biāo)記成為可能。隨著高通量測序成本的不斷下降，全基因組測序可能成為未來常用的DNA多態(tài)性檢測手段。理論上，基于廣泛深入的表型-基因型關(guān)系的研究，全基因組測序不僅可以準(zhǔn)確地鑒定蜂種，還可以預(yù)測赤眼蜂的重要農(nóng)業(yè)性狀，如寄生力、抗藥性等。

此外，新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，如等溫擴(kuò)增技術(shù)(Isothermal Amplification)、基于CRISPR/Cas的分子檢測技術(shù)、單分子測序技術(shù)、微流控芯片等技術(shù)的發(fā)展，也為今后赤眼蜂分子鑒定提供了新的思路。以重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等為代表的等溫擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，可以擺脫分子鑒定對PCR儀器的依賴(Piepenburgetal., 2006)。而基于CRISPR/Cas的分子檢測技術(shù)使低成本、便捷、靈敏、特異的分子檢測技術(shù)成為可能(Chertow, 2018; Lietal., 2019)。其中，以代表性的SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking)技術(shù)所生產(chǎn)的試紙，其靈敏度可達(dá)單分子水平，可以區(qū)分不同的病毒亞型(Myhrvoldetal., 2018)，而將CRISPR/dCas9耦合在石墨烯膜上，可把特定DNA分子的檢測轉(zhuǎn)化為電信號，從而達(dá)到準(zhǔn)確、快速的鑒定(Hajianetal., 2019)。這些技術(shù)都有可能應(yīng)用于赤眼蜂的鑒定。

也許不遠(yuǎn)的將來，隨著新分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)、新技術(shù)的發(fā)展，更便捷、高效的赤眼蜂分子鑒定方法會不斷涌現(xiàn)。而檢測準(zhǔn)確、操作便捷、成本低廉一直是赤眼蜂鑒定在規(guī)?；狈洹⑨尫胖械钠惹行枨?，也是赤眼蜂分子鑒定研究的不懈追求。不論現(xiàn)在還是將來，赤眼蜂分子鑒定無疑都是赤眼蜂研究和應(yīng)用的重要工具，為挖掘赤眼蜂資源提供技術(shù)支撐。

致謝：感謝新疆大學(xué)胡紅英教授為本文初稿提出寶貴意見；感謝審稿專家在投稿過程中提出的建設(shè)性意見。