甯 媛，段 琛，常瓊瓊，侯曉暉

(遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000)

吸血蠓(Blood-sucking midges)是一類可刺吸動(dòng)物血液的蠓科昆蟲，其中部分種類還可傳播蟲媒病原體帶來極大的危害。全世界蠓科昆蟲中僅有4屬蠓類屬吸血蠓，即庫蠓屬Culicoides、蠛蠓屬Lasiohelea、細(xì)蠓屬Leptoconops和澳蠓屬Austroconops，共1 671種(Borkent，2016)，中國(guó)僅分布3屬(澳蠓屬除外)共443種(常瓊瓊等，2017)。庫蠓屬Culicoides是蠓科Ceratopogonidae中最大的一個(gè)屬，其中很多種類可吸食人畜血液并傳播人畜疾病，是一類重要的媒介昆蟲(Kaliontzopoulouetal., 2007; Hoffmannetal., 2009; 王飛鵬等，2010；張海林等，2012；Carpenteretal., 2013)。迄今為止，由媒介蠓蟲傳播的藍(lán)舌病多次在歐洲等地爆發(fā)流行，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，媒介蠓蟲也因此成為近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。由于庫蠓體型微小、種類繁多，傳統(tǒng)分類方法在實(shí)際工作中存在諸多困難，故需要開發(fā)更多的新技術(shù)、新方法實(shí)現(xiàn)蠓蟲快速、準(zhǔn)確的分類鑒定。

幾何形態(tài)學(xué)是基于笛卡爾坐標(biāo)對(duì)形狀特征進(jìn)行定量描述和分析的統(tǒng)計(jì)分析方法，能準(zhǔn)確直觀地解釋不同生物體種內(nèi)與種間微小的形狀差異(Kaliontzopoulouetal., 2007)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)昆蟲的翅不僅容易測(cè)量，而且不易發(fā)生形變，認(rèn)為其特別適合進(jìn)行生物測(cè)量學(xué)研究(Dujardinetal., 2003)。因此，幾何形態(tài)學(xué)已被應(yīng)用于包括蠓科昆蟲在內(nèi)的諸多昆蟲類群的分類研究(Gurgel-Gon?alvesetal., 2011; Muoz-Muozetal., 2011, 2014, 2016; Deblauweetal., 2012; Fernández-Montravetaetal., 2017)。本研究以庫蠓亞屬中 6個(gè)近似種(漸灰?guī)祗稢ulicoidesgrisescens、光胸庫蠓Culicoidesimpunctatus、日本庫蠓Culicoidesnipponensis、灰黑庫蠓Culicoidespulicaris、刺螫庫蠓Culicoidespunctatus、天祥庫蠓Culicoidestienhsiangensis)為研究對(duì)象，運(yùn)用地標(biāo)點(diǎn)法定量對(duì)庫蠓翅的形態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行分析，以期對(duì)庫蠓近似種進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定和親緣關(guān)系分析。

1 材料與方法

1.1 材料

研究選取翅面完整無褶皺的6種庫蠓標(biāo)本共24張，將所有樣本進(jìn)行編號(hào)，相關(guān)信息見表1。

表1 本研究所用標(biāo)本信息

1.2 圖片采集及標(biāo)準(zhǔn)化處理

首先，將玻片置于裝有Canon DS 126371照相機(jī)的Leica DM2500顯微鏡上，采集翅圖像，并保存圖片為JPG格式。然后，使用TPSdig 2軟件對(duì)每種庫蠓的翅選擇翅脈穩(wěn)定的交叉點(diǎn)或轉(zhuǎn)折點(diǎn)進(jìn)行數(shù)字化標(biāo)點(diǎn)(Landmark)，共標(biāo)記12個(gè)點(diǎn)(圖1)，所得數(shù)據(jù)輸出為TPS文件。再使用tpsSmall軟件對(duì)形態(tài)原始數(shù)據(jù)集內(nèi)部相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)，并使用廣義普氏分析法(Generalized procrustes analysis, GPA)將地標(biāo)點(diǎn)輪廓疊加，并使地標(biāo)點(diǎn)離差最小化，在同一坐標(biāo)體系中剔除形態(tài)信息分析中非形態(tài)因素的影響。

圖1 翅的12個(gè)地標(biāo)點(diǎn)及翅脈(以漸灰?guī)祗稢ulicoides grisescens為例)Fig.1 Distribution of twelve landmarks and veins on wing of Culicoides grisescens注：Arc, 弓脈; M, 中脈; R, 徑脈; R-M, 徑中橫脈; Cu, 肘脈; r1,徑1室; r2,徑2室。Note: Arc, Arculus; M, Medial; R, Radial; R-M, Radial-median crossvein; Cu, Cubital; r1, First radia; r2, Second radia.

1.3 翅形變化分析

使用Morpho J軟件，利用主成分分析(Principal component analysis, PCA)和典型變量分析(Canonical variate analysis, CVA)方法，對(duì)蠓蟲翅的幾何形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在PCA的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了CVA，相關(guān)結(jié)果以馬氏距離(Mahalanobis distance)來展現(xiàn)，并運(yùn)用tps-Super 32軟件計(jì)算種內(nèi)平均形態(tài)，tps-Small 1.20軟件計(jì)算樣本間普氏距離，通過NTsys 2.10e軟件運(yùn)用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)分析普氏距離矩陣，創(chuàng)建表型樹對(duì)庫蠓亞屬6種庫蠓的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而探討種間親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 翅的形態(tài)變異

使用Morpho J對(duì)6種庫蠓進(jìn)行CVA分析，獲得種間翅形變化情況。由CVA散點(diǎn)圖(圖2)可知，同一種庫蠓很好的聚在一起，不同庫蠓之間距離相隔甚遠(yuǎn)并無交叉。同時(shí)，通過種間馬氏距離及其P值比較表(表2)可知，6種庫蠓的翅有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，其中天祥庫蠓和日本庫蠓的馬氏距離最大(49.7521)，表明6種庫蠓中兩者的翅形變化最大，而光胸庫蠓和漸灰?guī)祗返鸟R氏距離最小(8.7819)，表明6種庫蠓中兩者的翅形變化最小。

圖2 6種庫蠓翅形狀典型變量分析散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots of Canonical variate analysis of six Culicoides

2.2 聚類分析

利用獲得的6種庫蠓翅形態(tài)變化平均數(shù)據(jù)計(jì)算種間翅形的普氏距離，然后根據(jù)普氏距離矩陣進(jìn)行聚類分析建立近似種間表型樹，比較6種庫蠓間的親緣關(guān)系。由圖3可知，該表型樹中日本庫蠓首先與其余5種庫蠓分開，之后刺螫庫蠓、天祥庫蠓以及灰黑庫蠓先后從5種庫蠓的大支中分出，而光胸庫蠓和漸灰?guī)祗穭t聚為1支。因此，在上述6種間日本庫蠓與其余5種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而光胸庫蠓和漸灰?guī)祗返挠H緣關(guān)系最近。

表2 6種庫蠓翅間馬氏距離及其顯著性比較表(基于10 000次重復(fù))

圖3 基于普氏距離對(duì)6種庫蠓的聚類分析Fig.3 Phenetic tree of the studied populations of six Culicoides wing based on the Procrustes distance

3 討論與結(jié)論

吸血蠓作為一類具有重要經(jīng)濟(jì)意義的媒介昆蟲，由于其體型微小、形態(tài)相似，較難區(qū)分，并且實(shí)際工作中尚存在標(biāo)本殘缺或者數(shù)量不足的情況，甚至還可能受鑒定者的經(jīng)驗(yàn)、主觀因素等影響，導(dǎo)致應(yīng)用傳統(tǒng)分類方法在實(shí)際鑒定過程中有一定難度，這些都給疾病防控和檢驗(yàn)檢疫工作帶來了極大的困難。幾何形態(tài)學(xué)克服了傳統(tǒng)形態(tài)差異描述中的單一變量比較的缺陷，通過計(jì)算不同標(biāo)點(diǎn)間的距離，借助一系列統(tǒng)計(jì)方法將形態(tài)上的變異客觀、準(zhǔn)確地呈現(xiàn)出來，而且還可以通過比較樣本間的普氏距離展示出種間親緣關(guān)系，在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類鑒定的不足。

由于翅的大小并不能作為種屬區(qū)分的依據(jù)(Birdsalletal., 2010; 段琛等，2018)，故本研究利用幾何形學(xué)方法對(duì)庫蠓亞屬6種庫蠓進(jìn)行了翅的形態(tài)比較及聚類分析，發(fā)現(xiàn)上述種類在翅形和翅脈上的微小變化，進(jìn)一步將不同種類的庫蠓準(zhǔn)確區(qū)分，這與國(guó)外學(xué)者利用幾何形態(tài)學(xué)在庫蠓以及按蚊、實(shí)蠅等方面獲得的研究成果一致(Suetal., 2015; Giordanietal., 2017; Gómezetal., 2017; 李玲等，2017)。此外，聚類分析可初步用于種間親緣關(guān)系判定，如本研究6種庫蠓中日本庫蠓與其余5種庫蠓的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，光胸庫蠓和漸灰?guī)祗返挠H緣關(guān)系最近。因此，翅的幾何形態(tài)學(xué)能夠初步用于探討種間親緣關(guān)系，但由于自然界中存在普遍的協(xié)同進(jìn)化現(xiàn)象，其揭示的可能只是不同研究對(duì)象表型上的近似或差異，其結(jié)果能否準(zhǔn)確地反應(yīng)物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還需結(jié)合生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、分子等多種數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。

幾何形態(tài)學(xué)具有成本低、速度快、可重復(fù)性強(qiáng)、輸出結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于無法使用分子手段進(jìn)行檢測(cè)的老標(biāo)本或者蠓類這種制成玻片保存的標(biāo)本，該方法尤為適用。但是，任何方法都有其局限性，幾何形態(tài)學(xué)亦是如此，其可能存在人為誤差、選取特征片面、殘缺標(biāo)本無法檢測(cè)等。因此，在以后的研究中需要進(jìn)一步的探究以及開發(fā)更為合理有效的計(jì)算機(jī)運(yùn)行技術(shù)，使得該門技術(shù)更加科學(xué)、有效、直觀，在昆蟲學(xué)乃至其他學(xué)科的研究中發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值。