劉慧茹，葉碧珍，魏轉(zhuǎn)弟

作者單位：東莞市中醫(yī)院皮膚科，廣東 東莞523000

長島型掌跖角化癥（Nagashima-type palmoplantar Keratosis，NPPK）是一種常染色體隱性遺傳病，男女發(fā)病率相似，臨床表現(xiàn)的特征為掌跖角化癥，該病于1977年首次在長島被報(bào)告［1］。其臨床特征包括手掌和腳掌上界限清楚的紅斑并輕中度角化過度；長島型掌跖角化癥通常在嬰幼兒期開始發(fā)病，表現(xiàn)為輕微的掌跖斑疹病，皮疹進(jìn)展慢［2］。

GJB2屬于β-族間隙連接蛋白家族，按蛋白分子量命名為Cx26。間隙連接蛋白與縫連接蛋白組成一個(gè)完整的縫隙連接通道，在細(xì)胞間信息傳導(dǎo)和物質(zhì)交換起重要作用。表皮的基底層含有增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞，分化產(chǎn)生的細(xì)胞可遷移到棘突和顆粒層［3］。角質(zhì)形成細(xì)胞具有許多細(xì)胞間連接，包括間隙連接［4］。β-族間隙連接蛋白突變可能誘導(dǎo)皮膚病發(fā)生，其中Cx26的GJB2突變會(huì)導(dǎo)致皮膚病綜合征，包括耳聾的掌跖角化?。≒PK），Vohwinkel綜合征（VS）和角膜炎魚鱗病耳聾綜合征（KID）［5-7］。Cx31（GJB3）和Cx30.3（GJB4）突變引起的皮膚病癥狀相似，主要表現(xiàn)為變異性紅皮膚角化癥（EKV）［8］。目前大量研究集中在間隙連接蛋白導(dǎo)致KID綜合征的作用機(jī)制，但對(duì)于與NPPK相關(guān)的突變鮮有研究。

本研究于2017年收集了家系的2例NPPK病人，對(duì)病人的外周血提取DNA，進(jìn)行SERPINB7基因外顯子8常見突變位點(diǎn)c.796C＞T（p.Arg266Ter）進(jìn)行測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)突變。因此，我們推測(cè)該家系病人可能是由于其他相關(guān)基因（GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1）突變引起。本研究擬通過鑒定NPPK的突變位點(diǎn)，闡明NPPK的發(fā)病機(jī)制，為NPPK的治療提供一定的理論依據(jù)。

表1 長島型掌跖角化癥（NPPK）中GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1基因PCR擴(kuò)增引物序列

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為收集的2例家系NPPK病人，分別于3歲和4歲開始發(fā)病，臨床表現(xiàn)為雙手掌、指背、足底、手腕、踝部、跟腱等對(duì)稱性紅斑、角化性斑丘疹、斑塊伴脫屑。組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮角化過度、顆粒層和棘層增厚，無表皮松解性角化過度的特點(diǎn)，真皮淺層少量毛細(xì)血管擴(kuò)張，少量炎癥細(xì)胞浸潤。該例病人的臨床及組織病理符合長島型掌跖角化癥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與sanger測(cè)序 收集NPPK病人外周血3～5 mL，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取血液DNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，保存-70℃?zhèn)溆?。從美國國家生物技術(shù)信息中心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 獲 得 GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1這5個(gè)基因的序列，設(shè)計(jì)引物（表1）。以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，在72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將獲得的5個(gè)基因的PCR產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行正反向引物測(cè)序。用Gene tool軟件將測(cè)定的序列與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，標(biāo) 準(zhǔn) 序 列 參 考 ：GJB2：NM_004004，GJB6：NM_001110219， GJB3： NM_001005752， GJB1： NM_000166，GJB4：NM_153212。

1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄及卵母細(xì)胞顯微注射 將Cx26和Cx31克隆到pCS2+表達(dá)載體中，用于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的功能研究［9］。通過定點(diǎn)誘變制備Cx26-S183F結(jié)構(gòu)體［10］，并將DNA結(jié)構(gòu)體克隆到pBlueScri1ptⅡ載體中并測(cè)序，然后亞克隆到pCS2+表達(dá)載體中。將定點(diǎn)誘變的結(jié)構(gòu)體使用SP6 mMessage mMachine體外轉(zhuǎn)錄試劑盒線性化并轉(zhuǎn)錄。從非洲爪蟾雌性中收集卵母細(xì)胞，并在改良的Barth（MB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)［11］，向卵母細(xì)胞注射10 ng反義非洲爪蟾Cx38寡核苷酸［12］，然后單獨(dú)或組合注射連接蛋白轉(zhuǎn)錄物，注入水的卵母細(xì)胞作為陰性對(duì)照。Cx31 RNA和其他cRNA都以相同的濃度注射。

1.2.3 記錄半通道電流 卵母細(xì)胞注射各種cRNA 24h后使用Gene Clamp 500放大器檢測(cè)其半通道電流。將卵母細(xì)胞培養(yǎng)在不添加Ca2+的MB培養(yǎng)基中，在室溫條件下進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。將電極拉至1～2 MΩ的電阻，電極內(nèi)灌注電極內(nèi)液。通過記錄半通道電流：鉗制電壓為-40 mV，電壓從-30 mV去極化至+40 mV，階躍10 mV每次持續(xù)5 s，從而獲得半通道電流-電壓（I-V）曲線。并在初始鉗制電壓-40 mV情況下，測(cè)量兩個(gè)細(xì)胞的電流變化來計(jì)算連接電導(dǎo)（Gj）。一個(gè)細(xì)胞受±20 mV的交變脈沖，在另一個(gè)細(xì)胞中記錄由電壓變化產(chǎn)生的電流，其大小與連接電流（Ij）相等，通過Ij除以電壓差計(jì)算電導(dǎo)率，即Gj＝Ij/（V1-V2）。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 卵母細(xì)胞如1.2.2做相同的處理，24 h后提取蛋白。在12%的SDS凝膠上電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉37℃封閉 1 h，用 CX26（GBJ2）或 Cx31（GBJ3）（ABCAM，Cambridge）的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。用GADPH（ABCAM，Cambridge）作為內(nèi)參。使用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析。

1.2.5 免疫共沉淀 卵母細(xì)胞如1.2.2做相同的處理，24 h后利用膜蛋白提取試劑盒提供的說明書提取膜蛋白。用PBS清洗兩遍珠子，用PBS將Protein A agarose配制成50%濃度，蛋白樣品中加入Protein A瓊脂糖珠去除非特異性蛋白。用Cx26抗體孵育，加入Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，樣品煮沸5 min變性。在SDS凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后使用Cx26或Cx31的抗體進(jìn)行WB檢測(cè)蛋白質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 11.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析One-Way ANOVA，并用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sanger測(cè)序篩選出GJB2突變引起NPPK GJB2基因核苷酸序列第584位堿基由C突變成T（c.548C＞T）發(fā)生了突變，導(dǎo)致編碼的蛋白第183位的絲氨酸被苯丙氨酸取代（p.Ser183Phe）。NPPK病人的父母均為GJB2p.Ser183Phe雜合子突變攜帶者，100個(gè)與該家族不相關(guān)的正常漢族人中沒有檢測(cè)到p.Ser183Phe突變位點(diǎn)。

2.2 Cx26突變體無功能且抑制野生型連接蛋白Cx31 已有研究證實(shí)Cx31突變體可引起嚴(yán)重的皮膚病，當(dāng)其與野生型Cx31共表達(dá)時(shí)，通道電導(dǎo)率降低，影響間隙連接通道的能力［13］。因此我們猜測(cè)Cx26突變體可能通過與Cx31互相作用從而出現(xiàn)NPPK。為證實(shí)這一點(diǎn)，Cx26-S183F及其他表皮連接蛋白在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)及Cx31在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)，檢測(cè)間隙連接電導(dǎo)Gj。用水注射的卵母細(xì)胞陰性對(duì)照組的電導(dǎo)幾乎可忽略（Gj＝0.18 μS），而只注射Cx26的細(xì)胞的平均Gj為8.6μS。在單獨(dú)注射Cx26-S183F的卵母細(xì)胞中測(cè)量的電導(dǎo)與陰性對(duì)照組細(xì)胞相同（Gj＝0.13μS），說明功能喪失。當(dāng)共同注射Cx26-S183F和Cx26時(shí)，平均電導(dǎo)為2.9 μS，顯著低于單獨(dú)注射Cx26的（P＜0.05，圖1A）。Cx26-S183F還顯示出對(duì)Cx31的反式顯性抑制，當(dāng)兩者都存在于卵母細(xì)胞中時(shí)，Cx26-S183F顯著抑制Cx31（Gj＝0.77 μS，P＜0.05，圖1B）。結(jié)果表明Cx26-S183F能有效抑制野生型Cx31，Cx26突變體與Cx31互作可能會(huì)產(chǎn)生NPPK。

圖1 檢測(cè)各處理組（注入水、Cx26、Cx26-S183F、Cx26-S183F+Cx26）卵母細(xì)胞的間隙連接的電導(dǎo)率：A為檢測(cè)野生型Cx26、Cx26突變體及Cx26-S183F+Cx26的電導(dǎo)率，B為檢測(cè)野生型Cx31、Cx31+Cx26及Cx31+Cx26-S183F的電導(dǎo)率

2.3 突變蛋白表達(dá)缺失不會(huì)引起電導(dǎo)率的降低用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)野生型和突變體連接蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，注射Cx31、Cx31+Cx26、Cx31+Cx26-S183F的處理組中均檢測(cè)到Cx31蛋白（31kDa）（圖2A），灰度值分析表明各處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。同理，在Cx26、Cx31+Cx26、Cx26-S183F、Cx26+Cx26-S183F及Cx31+Cx26-S183F處理組中均檢測(cè)到Cx26（26kDa）（圖2C），且表達(dá)量一致，定量分析顯示各處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2D）。說明Cx26-S183F突變體存在時(shí)功能活性的喪失與Cx31的翻譯效率無關(guān)。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)長島型掌跖角化癥（NPPK）突變體及野生型Cx31的表達(dá)水平：A為WB檢測(cè)各處理組中Cx31的表達(dá)情況；B為WB檢測(cè)各處理組中Cx26的表達(dá)情況；C為量化分析Cx31的蛋白表達(dá)量；D為量化分析Cx26的蛋白表達(dá)量

2.4 Cx26突變體與Cx31的互相作用 為了證實(shí)Cx26突變體和Cx31可能形成異型通道，我們對(duì)共表達(dá)Cx31和Cx26突變體的細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在Cx26相關(guān)樣品中檢測(cè)到Cx26蛋白，而在含有Cx31的樣品中均檢測(cè)到Cx31蛋白（圖3A和圖3B），說明細(xì)胞裂解液可進(jìn)行后續(xù)CO-IP實(shí)驗(yàn)。CO-IP顯示Cx26蛋白在野生型和突變體樣品中有表達(dá)，Cx26+Cx31樣品在31KDa出現(xiàn)較弱的條帶，說明野生型Cx26與Cx31結(jié)合較弱。共表達(dá)Cx31和Cx26-S183F樣品中蛋白的表達(dá)量較高，表明Cx26突變體蛋白與Cx31發(fā)生免疫共沉淀（圖3C）。

2.5 Cx26突變體不能形成功能性半通道 KID綜合征突變體單獨(dú)存在時(shí)通常形成活躍的半通道［14-16］，而NPPK突變是否會(huì)出現(xiàn)類似的情況，為證實(shí)這一結(jié)果，在單個(gè)卵母細(xì)胞中表達(dá)Cx26和Cx26-S183F來分析半通道活性。結(jié)果顯示，注射水的卵母細(xì)胞對(duì)照在所有電壓階段被限流（圖4A），Cx26半通道活性在去極化時(shí)出現(xiàn)外向電流（圖4B），與注射Cx26的細(xì)胞相比，Cx26-S183F的膜電流顯著地降低（圖4C）。以平均膜電流和膜電壓作圖，表達(dá)CX26的細(xì)胞出現(xiàn)較高的外向電流，并隨著去極化的增加而增加，在+60mV時(shí)，Cx26產(chǎn)生的電流顯著高于對(duì)照及Cx26-S183F突變體（P＜0.05，圖4D）。結(jié)果說明，注射突變體的細(xì)胞天然半通道活性喪失，Cx26-S183F與野生型Cx26的共表達(dá)導(dǎo)致半通道活性降低。

圖3 免疫共沉淀（CO-IP）檢測(cè)長島型掌跖角化癥（NPPK）中Cx26突變體與Cx31的互作情況：A和B分別為WB檢測(cè)細(xì)胞裂解液中Cx31、Cx26的表達(dá)情況；C為CO-IP檢測(cè)Cx26突變體與Cx的互相作用

圖4 膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)長島型掌跖角化癥（NPPK）野生型Cx26和突變體的膜電流：A為檢測(cè)注射水的對(duì)照組卵母細(xì)胞的電流，B為檢測(cè)單獨(dú)注射Cx26的卵母細(xì)胞的電流，C為檢測(cè)單獨(dú)注射Cx26突變體的卵母細(xì)胞的電流，D為半通道I-V曲線圖

2.6 Cx26突變體能增強(qiáng)Cx31半通道 CO-IP實(shí)驗(yàn)證明Cx31與異型半通道中的Cx26突變體結(jié)合，從而導(dǎo)致Cx26 NPPK突變體改變了Cx31的活性。因此驗(yàn)證了Cx26-S183F是否也會(huì)影響Cx31半通道活性。結(jié)果顯示，單獨(dú)注射Cx31的卵母細(xì)胞沒有半通道活性（圖5A），由Cx31和Cx26-S183F組成的異型半通道出現(xiàn)較高的電流（圖5B）。以電流和電壓作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在電壓的增加下，共表達(dá)Cx26-S183F和Cx31的細(xì)胞中的半通道活性顯著增加，說明具有半通道功能。Cx31和Cx26-S183F共表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生的電流在-30、-20、-10、0、10、20、30、40、50、60 mV分別達(dá)到 0.135、0.21、0.235、0.3、0.315、0.38、0.40、0.41、0.44、0.46 μA，顯著高于單獨(dú)表達(dá)Cx31的細(xì)胞產(chǎn)生的電流（P＝0.0316，圖5C）。這些結(jié)果說明，當(dāng)共表達(dá)形成異型連接子時(shí)，Cx31和Cx26突變體能夠形成功能性半通道。

圖5 膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)長島型掌跖角化癥（NPPK）Cx31和Cx26-S183F共表達(dá)時(shí)的膜電流：A為檢測(cè)單獨(dú)注射Cx31的卵母細(xì)胞的電流，B為檢測(cè)注射Cx26-S183F+Cx31的卵母細(xì)胞的電流，C為半通道I-V曲線圖

3 討論

NPPK由絲氨酸蛋白酶抑制劑B7（SERPINB7）基因突變引起。在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)序發(fā)現(xiàn)2例病人的NPPK并不是由SERPINB7突變引起，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)與NPPK發(fā)生相關(guān)的GJB2突變。

當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí)，Cx26-S183F不能形成功能性同源半通道或間隙連接，但與Cx31共表達(dá)后，降低了Cx31間隙連接的活性，并增加了半通道活性。Cx31和Cx26突變體的免疫共沉淀顯示形成異型連接子，Cx26突變體具有修飾Cx31半通道和縫隙連接的能力。

目前，大量研究表明間隙連接半通道在病理?xiàng)l件下能開放，為細(xì)胞間的物質(zhì)交換提供通路。間隙連接半通道過量或長時(shí)間的開放會(huì)導(dǎo)致離子調(diào)節(jié)的失常，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的變化和代謝產(chǎn)物丟失，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17］。不同間隙連接蛋白基因的突變可以導(dǎo)致同一種遺傳學(xué)疾病，已有研究發(fā)現(xiàn)，Cx26突變與Cx43互作會(huì)引起掌跖角化病［18］。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了Cx26-S183F與Cx31共表達(dá)會(huì)增強(qiáng)間隙連接半通道活性，從而引起NPPK。

Cx31在表皮上表達(dá)，而且Cx31突變會(huì)引起遺傳性皮膚病，被稱為變異性紅皮膚角化?。‥KV），其特征為軀干和四肢的皮膚過度角化，并伴有紅斑出現(xiàn)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，與Cx26突變相關(guān)的引起的皮膚病有KID綜合征、PPK、先天性耳聾伴發(fā)角質(zhì)厚皮病等［20-23］。目前為止關(guān)于Cx26突變引起皮膚病的機(jī)制有兩種：（1）抑制其他角質(zhì)形成細(xì)胞連接蛋白；（2）異常的半通道的形成。反式顯性負(fù)效應(yīng)作用會(huì)減少連接蛋白類型的數(shù)量從而影響表皮細(xì)胞間通訊，導(dǎo)致通道功能異常，而活躍的半通道會(huì)產(chǎn)生代謝物向細(xì)胞外釋放，可能對(duì)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡［24］。

在Cx26和Cx31突變引起皮膚病的病人中，觀察兩者之間的臨床特征存在相似性。四肢出現(xiàn)過度角化病變，這表明可能與NPPK出現(xiàn)的機(jī)制相似。除此之外，還有Cx26突變引起的Bart-Pumphrey綜合征KHLS也有相似的臨床癥狀，包括角化過度和白細(xì)胞減少癥［25］。盡管癥狀相似，但仍需要進(jìn)一步研究突變體確認(rèn)其相關(guān)機(jī)制，Cx31-G8V突變的表達(dá)導(dǎo)致半通道的形成，允許鈣離子流入細(xì)胞，從而造成KHLS［26］。有研究發(fā)現(xiàn)Cx30.3突變體會(huì)引起變異性紅皮膚角化?。‥KV），當(dāng)Cx31和Cx30.3-F137L共同轉(zhuǎn)染時(shí)，在細(xì)胞膜上檢測(cè)到與Cx31形成間隙連接，并能形成異聚體連接子［27］。最近的一項(xiàng)研究表明，造成KID形成的Cx26-S17F突變體存在的情況下，Cx31半通道活性增加［28］。這與我們的研究結(jié)果一致，Cx26-S183F不能單獨(dú)形成半通道或間隙連接，但在與Cx31共表達(dá)時(shí)可以增強(qiáng)半通道活性，從而引起NPPK。

這些研究結(jié)果表明Cx26在皮膚疾病中的重要性，并進(jìn)一步突出了Cx26突變體和Cx31互相作用在遺傳性皮膚病中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步治療皮膚病提供一定的理論基礎(chǔ)。