路 琰，雷敏婷，葉金梅，雷臘梅，韓博平

(暨南大學生命科學技術學院生態(tài)學系，廣州 510632)

擬柱孢藻是熱帶和亞熱帶常見的水華藻類之一，具有較強的入侵能力和產(chǎn)毒能力. 產(chǎn)CYN的擬柱孢藻于1979年在澳大利亞Palm島首次被發(fā)現(xiàn)，致使148人中毒，引起嘔吐、厭食和肝腫大等癥狀[1]. 擬柱孢藻毒素是一類環(huán)胍類生物堿[2]，對小鼠具急性毒性，腹腔注射小鼠的LD50為2.1 mg/kg[2]. 研究表明，CYN具有肝毒性，神經(jīng)毒性和細胞毒性，能夠抑制谷胱甘肽、細胞色素P450和蛋白質的合成，是一種潛在的致癌物[3-5]. Humpage等[6]以 CYN 每日最低可見有害作用水平 30 μg/kg為基準，建議飲用水中的濃度限值為1 μg/L. 目前在澳大利亞[7]、新西蘭[8]、東亞、東南亞以及沙特阿拉伯[9-11]等地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)CYN的擬柱孢藻. Mihali 等首次在C.raciborskiiAWT205藻株中揭示了擬柱孢藻毒素合成酶基因簇的分子特征[12]. 該基因簇全長43 kb，共包含15個開放閱讀框：脒基轉移酶基因cyrA，PKS/NRPS基因cyrB、cyrC、cyrD、cyrF和cyrE，尿嘧啶環(huán)形成基因cyrG和cyrH，裁剪酶基因cyrI、cyrJ和cyrN，運輸基因cyrK，調控基因cyrO，轉座酶基因cyrL和cyrM. 而基于產(chǎn)毒基因的分子技術具有簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已廣泛應用于藍藻毒素的相關研究，在檢測擬柱孢藻的產(chǎn)毒潛能中也逐步得到應用[13].

研究認為擬柱孢藻的成功侵入性主要是由于其能夠耐受多種環(huán)境條件，如低光照，低溫和低營養(yǎng)可利用性[7]. 此外，Bonilla等也將其生態(tài)成功歸因于高的表型可塑性[14]，這種可塑性實際上來源于多個生態(tài)型(即藻株)的存在，而每個生態(tài)型都有自己的最佳生理需求[15]. 即使是分離自同一水體的兩株擬柱孢藻同樣在形態(tài)、藻絲體長度、生長、光照以及溫度和營養(yǎng)鹽等方面存在差異[16]. 擬柱孢藻的各個株系并不都產(chǎn)毒，產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒株系往往在形態(tài)上沒有差別，但兩者在遺傳特征和生理特性上差異較大，此外產(chǎn)毒藻株間也有毒性強弱和毒素種類不同之分[10,17-18]. 擬柱孢藻藻株間的差異反映了其高度適應性的策略，推測這也是擬柱孢藻能夠快速地理擴張的主要驅動力[7].

藍藻的分子生物學研究起始于1960s，并被廣泛應用于藍藻分子系統(tǒng)學的研究，隨后形成了一門新興學科藻類分子系統(tǒng)學. 運用于藍藻系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標記包括16S rDNA、16S～23S rRNA 基因間隔序列(ITS)和RNA聚合酶rpoC等[19]. 由此可見，系統(tǒng)進化樹是描述某物種進化歷史的重要形式. 關于擬柱孢藻的發(fā)生和擴散主要有兩種假說，第1種假說認為擬柱孢藻的擴散存在非洲和澳大利亞兩個擴散中心[20]；第2種假說則認為擬柱孢藻對溫帶地區(qū)的入侵不是來自于非洲或澳大利亞，而是每個大陸的溫暖避難區(qū)[21]，即擬柱孢藻是從較溫暖的避難地區(qū)向美洲和歐洲擴散[22]. 但最近有研究對上述兩個假說均提出質疑，Cirés等根據(jù)cpcBA-IGS和nifH基因共建系統(tǒng)進化樹，結果發(fā)現(xiàn)西班牙的藻株與美洲的擬柱孢藻藻株聚在一起，明顯與歐洲其他藻株分開[23]，而以前的研究一直認為西班牙藻株是歐洲-亞洲組的一部分，這表明現(xiàn)有的擬柱孢藻系統(tǒng)地理學和擴散途徑的假設還有待進一步驗證. Manthos等在對希臘的擬柱孢藻藻株進行了系統(tǒng)進化分析提出南美和非洲兩個輻射中心，南美輻射中心隨后向南美、突尼斯、希臘或西班牙擴張，非洲輻射中心導致了擬柱孢藻從非洲到澳大利亞，然后再向亞洲和歐洲的擴張[24]，它為擬柱孢藻的全球擴散提供了一種新的解釋.

我國是世界上水體富營養(yǎng)化最嚴重的國家之一，擬柱孢藻已在多個省份分布，如廣東省、福建省、云南省、湖北省、臺灣省、山東省和北京等[10-11,25-27]. 尤其在南亞熱帶地區(qū)，擬柱孢藻已逐漸取代微囊藻成為水體的優(yōu)勢種群[28]，但關于該地區(qū)擬柱孢藻產(chǎn)毒特征的研究幾乎空白. 本研究以從廣東省千燈湖分離的10株擬柱孢藻為材料，觀察了它們的基本形態(tài)特征，采用基于多個CYN毒素合成酶基因的PCR檢測和LC-MS/MS對藻株的產(chǎn)毒能力進行了聯(lián)合分析，并構建了rpoC1和nifH雙基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹. 本研究可初步了解南亞熱帶地區(qū)擬柱孢藻的產(chǎn)毒特征和進化起源，為擬柱孢藻水華的風險評估提供參考.

1 材料和方法

1.1 藻株的分離與形態(tài)觀察

千燈湖(23°2′59″N，113°8′29″E)位于廣東省佛山市，總庫容為5.6×105m3，平均水深2 m，屬于亞熱帶海洋性季風氣候，夏季高溫多雨，冬季溫和少雨，為小型景觀湖泊. 水樣于2017年9月-2018年2月期間每月采集一次，藻株的分離方法為使用玻璃毛細管在顯微鏡下吸取單根藻絲體，在無菌水滴中沖洗5～6次，轉移到含有1 mL WC培養(yǎng)基的24孔細胞培養(yǎng)板中. 培養(yǎng)溫度為25 ± 1℃，光照強度為35 μmol / (m2·s)，光周期為12 h∶12 h. 20 d左右使用OLYMPUS TH4-200倒置顯微鏡鏡檢，將分離成功的藻株轉移至50 mL 錐形瓶中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，共計分離出10株擬柱孢藻，命名為QDH1～QDH10.

為觀察10 株擬柱孢藻生長和形態(tài)差異，在50 mL Pyrex 玻璃管中加入35 mL藻液，每藻株設置3個重復, 使用TD-700 葉綠素熒光儀測定葉綠素a(Chl.a)濃度，培養(yǎng)至第15天時每個樣本取2 mL藻液用魯哥試劑固定，在10×40倍顯微鏡(ZEISS AX10)下，記錄50根藻絲的長度和寬度以及異形胞的形態(tài)、長度和寬度. 同時采用針對16S rDNA設計的藍藻特異性引物對27FW和809R(表1)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送往公司測序，獲得的序列采用BLAST進行相似性分析. 比生長速率μ(d-1)指在某一段時間間隔內(nèi)藻類的生長速率，計算公式[29]為：

μ=[ln(x2)-ln(x1)]/(t2-t1)

(1)

式中，x1為t1時的生物量，x2為t2時的生物量，此處均為Chl.a濃度，μg/L. 而t1、t2分別為擬柱孢藻指數(shù)生長期的第1天和第7天.

藻絲體的長寬比和比生長率差異采用多重比較分析(Least-significant difference，LSD). 所有統(tǒng)計分析和圖形繪制在SPSS 22.0和OriginPro 8.0軟件中完成.

1.2 產(chǎn)毒基因的PCR擴增

選取擬柱孢藻毒素合成酶基因簇中的cyrA、cyrB、cyrC、cyrJ、pks和ps共6個基因，表1列舉了6個基因的特異性引物序列和來源. 擬柱孢藻基因組DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)提取，PCR反應體系總體積為30 μL，包括:2×HieffTMPCR Master Mix 15 μL，引物各0.5 μL，DNA模板3 μL，用無菌水補充體積. PCR反應在UNOII Biometra PCR儀上進行，擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，SYRB染色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測，將有單一目標條帶的PCR產(chǎn)物送往公司測序，獲得的序列采用BLAST進行相似性分析.

表1 用于PCR擴增的16S rDNA、rpoC1、nifH基因和產(chǎn)毒基因的引物信息

1.3 CYN的LC-MS/MS分析

取2 mL新鮮培養(yǎng)的擬柱孢藻藻液，離心后去上清，將藻細胞浸于純凈水中，冰浴下用超聲波破碎儀破碎細胞，離心后收集上清，-20℃保存?zhèn)溆? 上清中CYN的分析采用 AB SCIEX API 3200TMLC/MS/MS系統(tǒng)，以純度為95%的CYN(Enzo life science)作為標準品. 采集軟件為Analyst 1.6.2，離子源為ESI源，采用多反應監(jiān)測(MRM)正離子模式，CYN的定量離子對為416.2/194.3和416.2/176.3，deoxy-CYN的離子對為400.2/194.3和400.2/176.3. 色譜柱為安捷倫Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)，柱溫為40℃，進樣量為20 μL. 液相色譜采用梯度模式洗脫，流速0.6 mL/min，流動相為5%的乙腈. 由于deoxy-CYN沒有市售的標準品，它的定量根據(jù)CYN的標準曲線來計算.

1.4 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

rpoC1基因是藍藻中編碼RNA聚合酶3個最大亞單位的基因，nifH基因是固氮酶基因，是目前擬柱孢藻系統(tǒng)進化研究中最常使用的基因序列. 用10株千燈湖擬柱孢藻的nifH和rpoC1序列與從 GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的同源序列構建系統(tǒng)樹，兩株念珠藻作為外類群，所用藻株的信息和來源見附表1. 采用MEAGE6.0對42株藻的nifH基因序列與rpoC1基因序列進行比對，刪除首尾多余序列，將截取出來的序列保存. 隨后手動將同一株藻的兩個基因序列在Notepad++文本軟件包中進行串聯(lián)，串聯(lián)序列長度為628 bp. 以串聯(lián)序列為材料利用iqtree軟件包構建系統(tǒng)發(fā)育樹，程序中的ModelFinder模塊自動計算出最大似然法(ML)的最佳擬合進化模型為GTR+F+G4模型. 系統(tǒng)樹各分支的置信度由重復抽樣法(Bootstrap)1000 次重復檢測. 同時使用MEGA6.0構建最大簡約(MP)進化樹，以確定進化樹的可靠性. 進化樹的編輯器使用iTOL的在線版本，鏈接為https://itol.embl.de/upload.cgi.

2 結果

2.1 擬柱孢藻的形態(tài)和生長特性

將測序所獲得的QDH系列藻株的16S rDNA基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的擬柱孢藻16S rDNA進行比對，序列相似性達到了99.6%，表明在千燈湖分離到的10株絲狀藻為擬柱孢藻. 數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，10株藻的登錄號為 MK617302～MK617311.

在正常的培養(yǎng)條件下，10株擬柱孢藻的藻絲體形態(tài)均為筆直型(圖1)，絲體長度范圍在41.0～77.7 μm間，寬度范圍在2.433～3.125 μm間，對10株藻株藻絲體的長寬比值做LSD分析(表2)，結果QDH9比值最大，為31.491±12.867，除與QDH2和QDH7無差異外與其他藻株差異顯著(P<0.05)，QDH4的比值最低，為16.251±6.287. 除QDH1藻株外，其他9株千燈湖擬柱孢藻均可產(chǎn)生端生異形胞，其形狀如水滴、圓柱或圓錐. 在培養(yǎng)過程中，厚壁孢子也可經(jīng)常觀察到，其位置主要有亞端生(如QDH3、QDH4、QDH7和QDH9)，雙生以及頂端生(QDH5為發(fā)育中的厚壁孢子).

擬柱孢藻QDH3在培養(yǎng)的第3天在玻璃管底部可見大量黃色沉淀，第6天已經(jīng)死亡. 其他9株藻在整個培養(yǎng)周期內(nèi)生長良好(圖2)，在實驗結束時，QDH1生物量最高，QDH8最低. 對9株藻第1～7天的比生長速率做LSD分析表明(表2)，其中QDH4比生長速率藻株最高，為0.174±0.009 d-1，除與QDH2無差異外與其他藻株均差異極顯著(P<0.001)，QDH7的比生長速率最低，為0.075±0.006 d-1，與其他藻株均差異極顯著(P<0.001).

2.2 擬柱孢藻產(chǎn)毒能力分析

10株擬柱孢藻均檢測到cyrB和cyrC基因，而ps和pks基因只在QDH7和QDH9藻株中檢出，僅QDH7藻株檢測出6個基因(表3). LC-MS/MS對毒素檢測的結果表明，QDH7藻株的毒素檢測為陽性，其他9株擬柱孢藻均沒有檢到擬柱孢藻毒素，QDH7藻株同時檢到CYN和deoxy-CYN兩種異構體，但異構體CYN濃度極低，deoxy-CYN濃度極高，可達1745.19 ng/mL(表3).

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

本研究利用40株(其中10株為本研究分離的藻株)來自不同大陸的擬柱孢藻和2株念珠藻(Nostoc)的雙基因(rpoC1和nifH)序列來構建最大似然進化樹(ML)與最大簡約進化樹(MP). 在 ML 進化樹上 (圖3)，來自不同地區(qū)的 40株擬柱孢藻聚類成4個類群：類群I只包含來自墨西哥的藻株，聚成了北美洲分支；類群Ⅱ包括了新西蘭的藻株，聚成了新西蘭分支；來自烏干達和塞內(nèi)加爾的藻株組成類群Ⅲ聚成了非洲分支；類群Ⅳ由來自中國的藻株和歐洲及澳大利亞藻株的組成，聚集成了澳大利亞/亞洲/歐洲分支，在該分支中中國藻株QDH8、QDH4、CHAB2380和CHAB358與來自德國、法國、澳大利亞的藻株聚集成一個亞類群.

圖1 千燈湖擬柱孢藻株的形態(tài)特征(放大倍數(shù)為10×40，a：厚壁孢子，h：異形胞)Fig.1 Morphological characteristics of Cylindrospermopsis raciborskii strains isolated from Qiandenghu Lake (The magnification is 10×40，a: akinete，h: heterocyst)

表2 10株擬柱孢藻的形態(tài)特征及比生長速率*

*藻絲體和異形胞長寬比值的檢驗水平為P<0.05，比生長速率的檢驗水平為P<0.001，表中a、b和c表示顯著性差異.

圖2 10株千燈湖擬柱孢藻的生長曲線Fig.2 Growth curves of ten strains of Cylindrospermopsis raciborskii from Qiandenghu Lake

表3 千燈湖10株擬柱孢藻的產(chǎn)毒基因和擬柱孢藻毒素分析*

*“+”代表陽性；“-”代表陰性.

圖3 基于41株擬柱孢藻和2株念珠藻的rpoC1和nifH基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(Nostoc sp. PCC6720和Nostoc punctiforme PCC73102為外類群，結點上分別為 ML 和 MP的Bootstrap值)Fig.3 Phylogenetic tree inferred from 41 strains of Cylindrospermopsis raciborskii using two concatenated genes (rpoC1 and nifH), with Nostoc sp. PCC6720 and Nostoc punctiforme PCC73102 as the outgroup, and the nodes were ML and MP Bootstrap values)

CHAB系列(除了CHAB482)藻株形成一個分支. CHAB482與QDH系列的其他藻株形成了一個亞類群. MP樹的分支情況與ML樹一致，也分為4個大類群，分別為：Ⅰ北美洲、Ⅱ新西蘭、Ⅲ非洲和Ⅳ澳大利亞/亞洲/歐洲，其中類群IV由兩個并系類群組成(圖未展示，Bootstrap值添加于ML樹中).

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)條件下，千燈湖10株擬柱孢藻在生長速度、藻絲體長寬、產(chǎn)毒能力、厚壁孢子和異形胞的形成上存在差異，這與前人的研究基本一致[16-17,34-35]. 如Willis 等從澳大利亞Wivenhoe湖采集的單個樣品中分離到24株擬柱孢藻，發(fā)現(xiàn)這些藻株在生長特性、毒素含量和形態(tài)等方面均存在差異[17]；隨后Miotto等從Peri Lagoon湖分離出兩株擬柱孢藻，研究顯示它們在溫度、光照、不同營養(yǎng)鹽下的形態(tài)、生長速度和毒素產(chǎn)量等方面存在差異[16]；Xiao等研究了藍藻對光照和溫度的耐受，發(fā)現(xiàn)擬柱孢藻的種內(nèi)差異甚至大于種間差異，表明擬柱孢藻具有高度的可塑性[35]. 另外，Yamamoto和Shiah的研究顯示同一池塘不同季節(jié)分離的擬柱孢藻在比生長速率和厚壁孢子的產(chǎn)生上差異顯著[34]；Miotto等同樣發(fā)現(xiàn)Peri Lagoon湖的擬柱孢藻幾乎全年都在浮游植物群落中保持優(yōu)勢地位，可能是因為不同生態(tài)型對環(huán)境的容忍度和偏好導致的[16]. 本研究分離的10株擬柱孢藻中，QDH1藻株即使在缺氮的條件依然不形成異形胞，但PCR擴增可檢測到nifH基因，其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他擬柱孢藻nifH基因的相似性達99.4%，這暗示著該藻株擁有固氮酶基因，但異形胞形成相關的基因存在缺失，已有研究表明異形胞的分化需要大量基因共同參與[36]. 從千燈湖分離的擬柱孢藻很容易產(chǎn)生厚壁孢子，其他學者的研究中也觀察到這種現(xiàn)象[34]，一般認為厚壁孢子的產(chǎn)生是擬柱孢藻適應不良環(huán)境的結果，這有利于該藻向溫帶地區(qū)入侵[20].

目前共發(fā)現(xiàn)了5種擬柱孢藻毒素的同分異構體. 擬柱孢藻毒素(CYN)最為常見[2]，其次為deoxy-CYN[37]，其他3種異構體則極少報道. 本研究中分離的千燈湖10藻株僅QDH7可產(chǎn)毒并且以deoxy-CYN異構體為主. 這與Jiang等的研究結果類似，他們發(fā)現(xiàn)從我國多個水體分離的擬柱孢藻中產(chǎn)毒藻株比例極低，其中有兩藻株只產(chǎn)生deoxy-CYN[10]，因此推測我國的擬柱孢藻產(chǎn)毒的主要類型為deoxy-CYN，其次為CYN.

擬柱孢藻毒素的合成需要多個基因的分工合作完成，具有完整Cyr基因簇的藻株被認為是區(qū)分具產(chǎn)毒潛能與非產(chǎn)毒潛能藻株最明顯的特征[12,18]. 在本研究中，只有QDH7藻株可完全檢出6個基因，其他9株擬柱孢藻只能檢出2～5個基因，經(jīng)LC-MS/MS檢測除QDH7外均不產(chǎn)毒，這種產(chǎn)毒基因檢測呈陽性但毒素分析為陰性的現(xiàn)象在前人的研究中比較常見[38-39]. 一些非產(chǎn)毒藻株出現(xiàn)部分產(chǎn)毒基因可能是因為產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒藍藻共存下水平基因轉移或插入/刪除所致[36,18,40-41]. Ballot等在多株非產(chǎn)毒束絲藻中檢到cyrA、cyrB和cyrC，認為cyrJ才能較好的指示毒性潛能[38]. 在我們的研究中，非產(chǎn)毒藻株QDH4和QDH9也有cyrJ基因，但是測序對比分析發(fā)現(xiàn)這兩株藻的cyrJ基因均缺失了6個堿基(未發(fā)表的結果)，而Jiang等發(fā)現(xiàn)cyrJ存在3種基因類型，可產(chǎn)生CYN的藻株cyrJ基因大多數(shù)屬于Jtype2a，而我們的QDH4和QDH9是屬于Jtype2c[10]，這種缺失是否影響到cyrJ的表達尚不清楚,因此cyrJ基因的指示作用還有待進一步考證.

在探討世界范圍內(nèi)擬柱孢藻的系統(tǒng)進化和起源時，有研究認為多個遺傳標記的共建樹比單個遺傳標記的區(qū)分能力更強大[22,42]；例如Haande等發(fā)現(xiàn)pc-IGS、nifH、ITS-L和rpoC1等單個基因建樹不能區(qū)分澳大利亞、非洲和歐洲的藻株，但4個遺傳標記共建樹能夠將非洲、澳大利亞、歐洲和美洲的藻株完全區(qū)分[22]，因此本研究選擇兩個遺傳標記基因nifH和rpoC1共建系統(tǒng)發(fā)育樹. 結果表明澳大利亞、亞洲和歐洲藻株具有更高的同源性，這與前人的研究結果基本一致[24,43-45]. 根據(jù)Padisák的研究，認為最近擬柱孢藻的入侵是由澳大利亞擴散至亞洲然后再擴散至歐洲，從本文構建的兩株雙基因系統(tǒng)進化樹來看，結果更接近Padisák的假說，推測中國的擬柱孢藻是來自于澳大利亞株系的擴散(圖3). 產(chǎn)毒藻株QDH7和其他幾株非產(chǎn)毒藻株聚集在一起，表明了它們具有高度的同源性，這表明常規(guī)的遺傳標記基因難以區(qū)分產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒株系[18].

4 結論

同一水體分離的擬柱孢藻株系在生長特性、形態(tài)特征和產(chǎn)毒能力上存在顯著差異，即具有多個生態(tài)型. 從10株擬柱孢藻產(chǎn)毒能力的結果可以看出，千燈湖中的擬柱孢藻以非產(chǎn)毒株占優(yōu)勢，產(chǎn)毒擬柱孢藻以產(chǎn)deoxy-CYN異構體為主. 系統(tǒng)進化分析表明，千燈湖的擬柱孢藻與中國其他地區(qū)，澳大利亞以及歐洲的藻株同源性較高，千燈湖產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株聚集在同一分支，基于nifH和rpoC1等常規(guī)遺傳標記基因構建的系統(tǒng)樹不能區(qū)分產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株.