劉雅蘭，張毓婷，顧 瓊，滕希峰，何 琳

1廣東藥科大學藥學院；2中山大學藥學院，廣州 510006；3廣東藥科大學醫(yī)藥化工學院 廣東省化妝品工程技術研究中心，中山 528458；4廣東藥科大學中藥學院 國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣州 510006

牛大力(MillettiaspeciosaChamp.)是豆科崖豆藤屬植物，別名血藤、豬腳笠、倒吊金鐘、山蓮藕、金鐘根、大力薯、美麗崖豆藤等，主要分布于我國的福建、廣西、廣東、貴州、海南等地[1,2]。牛大力作為傳統(tǒng)的藥食同源植物在民間的食用歷史悠久，主要用于腰肌勞損、肺虛咳嗽、風濕性關節(jié)炎、跌打損傷等疾病[3]。據(jù)報道，牛大力中化學成分包括異黃酮類、黃酮類、生物堿、香豆素和三萜等化合物[4- 6]。但牛大力根、莖和葉的化學成分有所不同，其中根部富含異黃酮類化合物，以高麗槐素為主[3]。近年來，因極高的經(jīng)濟及藥用價值，牛大力在兩廣地區(qū)及香港等地的使用量逐年增多，造成了牛大力資源的短缺[2]。因此，深入研究牛大力顯得十分必要。為了進一步研究其物質(zhì)基礎并尋找可能的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性成分，我們對產(chǎn)于廣西的牛大力干燥根部分進行了系統(tǒng)化學成分研究，從中提取分離到了11個化合物，分別鑒定為millettiaosa A(1)、高麗槐素(2)、medicarpin(3)、羽扇豆醇(4)、β- 谷甾醇亞油酸酯(5)、β- 谷甾醇(6)、單棕櫚酸甘油酯(7)、二十七烷酸甘油酯(8)、香草醛(9)、琥珀酸甲酯(10)和1- 辛醇(11)?；衔?和10為首次從崖豆藤屬中分離得到。同時測定了化合物1～11的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性。其中化合物2、3、4和6顯示出顯著的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性，其IC50分別為2.23、1.39、2.25和1.63 μM。其中化合物2為首次報道具有抑制破骨細胞產(chǎn)生活性。

1 儀器與材料

LC- MS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；1H NMR，13C NMR用Bruker Advance 500型或400型超導核磁共振儀(德國Bruker公司)測定，溶劑為CDCl3和CD3OD；柱層析填料：正相硅膠(200- 300目，青島海洋化工有限公司)，反相填充材料RP- 18(40- 75 μm，Biotage公司)，Sephadex LH- 20(瑞典GE healthcare)；GF254薄層層析正相硅膠板(青島海洋化工有限公司)；顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液；MEM-α培養(yǎng)基(美國Gibco)；胎牛血清(美國Hyclone)；青霉素和鏈霉素雙抗溶液(美國Hyclone)；巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,mcsf)；GST- rRANKL(中山大學藥學院藥物分子設計中心)；DMSO(上海翌圣生物科技)；MTT(上海翌圣生物科技)；4%多聚甲醛(安徽Biosharp)；TRAcP染色試劑盒(美國Sigma Aldrich)。

牛大力(M.speciosaChamp.)根部分于2017年11月采購于廣西南寧邕寧區(qū)那樓鎮(zhèn)屯吳農(nóng)科組，由廣東藥科大學中藥資源系滕希峰老師鑒定，標本存放于廣東藥科大學中藥學院。

2 提取與分離

將牛大力(M.speciosaChamp.)根部分10.5 kg，粉碎后稱重，加入適量95%乙醇，加熱回流提取，提取3次，每次2 h。過濾回收提取液并減壓濃縮得粗提物589.5 g。95%乙醇浸膏用水混懸后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，每種溶劑萃取三次，得到石油醚萃取物56.0 g，二氯甲烷萃取物20.0 g，乙酸乙酯萃取物40.7 g。

石油醚部分經(jīng)硅膠柱(200～300目)，以石油醚- 乙酸乙酯(V石油醚/V乙酸乙酯= 100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫，得到A1- A15十五個組分。A5經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物5(8 mg)。A9經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物6(39 mg)和7(6 mg)。二氯甲烷部分經(jīng)硅膠柱(200- 300目)，以二氯甲烷- 乙酸乙酯(V二氯甲烷/V乙酸乙酯=100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫，得到B1- B4四個組分。B1經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物9(4 mg)。B2經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物1(8 mg)。B3經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20 純化，得到化合物4(6 mg)。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱(200～300目)，以二氯甲烷- 甲醇(V二氯甲烷/V甲醇=100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫，得到C1- C4 四個組分。C1經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物8(7 mg)。 C2經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物3(5 mg)和11(4 mg)。C3經(jīng)反復硅膠柱層析，MCI和Sephadex LH- 20純化，得到化合物10(3 mg)和2(6 mg)。

3 波譜數(shù)據(jù)和結構鑒定

化合物1淡黃色無定形粉末；C17H14O5，ESI- MS：m/z321 [M + Na]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：7.36(1H，d，J=8.4 Hz，H- 1)，6.72(1H，s，H- 11)，6.55(1H，dd，J=8.3，2.6 Hz，H- 2)，6.43(1H，s，H- 8)，6.41(1H，d，J=2.6 Hz，H- 4)，5.90(2H，d，J=11.0 Hz，OCH2O)，5.47(1H，d，J=6.9 Hz，H- 6a)，4.22(1H，dd，J=11.1，5.1 Hz，H- 6)，3.63(1H，d，J=10.9 Hz，H- 6)，3.47(1H，m，H- 12a)，1.25(2H，m，H- 12)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：132.2(C- 1)，112.7(C- 1a)，109.9(C- 2)，157.3(C- 3)，103.8(C- 4)，156.8(C- 4a)，66.6(C- 6)，78.6(C- 6a)，154.4(C- 7a)，94.0(C- 8)，148.2(C- 9)，141.9(C- 10)，104.9(C- 11)，118.1(C- 11a)，101.4(OCH2O)，29.9(C- 12)，40.30(C- 12a)。以上數(shù)據(jù)和文獻[7]對照基本一致，故確定化合物為millettiaosa A。

圖1 化合物1～11的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1- 11

化合物2白色無定形粉末；C16H12O5，ESI- MS：m/z283.3 [M]+；1H NMR(CD3)2CO，400 Hz)δH：7.27(1H，s，H- 1)，6.86(1H，d，J= 8.4，2.5 Hz，H- 2)，6.52(1H，s，H- 7)，6.36(1H，s，H- 4)，6.32(1H，s，H- 10)，5.87(2H，d，J= 11.8 Hz，OCH2O)，5.46(1H，d，J= 6.8 Hz，H- 11a)，4.24(1H，d，J= 10.5，4.5 Hz，H- 6α)，3.59(1H，t，J= 10.5，9.5 Hz，H- 6β)，3.54(1H，m，H- 6a)；13C NMR(CD3)2CO，100 Hz)δC：133.1(C- 1)，110.5(C- 2)，159.8(C- 3)，104.0(C- 4)，157.8(C- 4a)，67.1(C- 6)，41.1(C- 6a)，119.6(C- 6b)，106.0(C- 7)，142.5(C- 8)，149.0(C- 9)，94.0(C- 10)，155.4(C- 10a)，79.5(C- 11a)，112.9(C- 11b)，102.2(OCH2O)。以上數(shù)據(jù)和文獻[8]對照基本一致，故確定化合物為高麗槐素。

化合物3黃色油狀物；C16H14O4，ESI- MS：m/z271 [M + H]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：7.38(1H，d，J=8.4 Hz，H- 1)，7.13(1H，d，J=8.8 Hz，H- 7)，6.56(1H，dd，J= 8.4，2.5 Hz，H- 2)，6.46(1H，dd，J= 5.6，2.4 Hz，H- 8)，6.46(1H，d，J= 2.4 Hz，H- 10)，6.42(1H，d，J= 2.5 Hz，H- 4)，5.49(1H，d，J= 6.7 Hz，H- 11a)，4.23(1H，dd，J= 10.8，4.8 Hz，H- 6β)，3.77(3H，s，9- OCH3)，3.61(1H，d，J= 10.8 Hz，H- 6α)，3.53(1H，ddd，J= 11.6，8.0，3.4 Hz，H- 6a)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：132.3(C- 1)，109.9(C- 2)，156.8(C- 3)，103.8(C- 4)，157.3(C- 4a)，66.7(C- 6)，39.7(C- 6a)，119.3(C- 6b)，124.9(C- 7)，106.5(C- 8)，161.3(C- 9)，97.1(C- 10)，160.8(C- 10a)，78.7(C- 11a)，112.7(C- 11b)，55.7(9- OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻[9]對照基本一致，故確定化合物為medicarpin。

化合物4白色粉末；C30H50O，ESI- MS：m/z426 [M]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：4.68(1H，s，H- 29)，4.57(1H，s，H- 29)，3.19(1H，dd，J=11.2，5.1 Hz，H- 3)，1.68(3H，s，30- CH3)，1.01(3H，s，26- CH3)，0.97(3H，s，23- CH3)，0.94(3H，s，27- CH3)，0.83(3H，s，25- CH3)，0.79(3H，s，28- CH3)，0.76(3H，s，24- CH3)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：38.8(C- 1)，27.6(C- 2)，79.2(C- 3)，39.0(C- 4)，55.4(C- 5)，18.5(C- 6)，34.4(C- 7)，41.0(C- 8)，50.6(C- 9)，37.3(C- 10)，21.1(C- 11)，22.9(C- 12)，38.2(C- 13)，43.0(C- 14)，25.3(C- 15)，35.7(C- 16)，43.2(C- 17)，48.4(C- 18)，48.1(C- 19)，151.1(C- 20)，29.9(C- 21)，40.2(C- 22)，28.1(C- 23)，15.5(C- 24)，16.3(C- 25)，16.1(C- 26)，14.7(C- 27)，18.2(C- 28)，109.5(C- 29)，19.5(C- 30)。以上數(shù)據(jù)和文獻[10]對照基本一致，故確定化合物為羽扇豆醇。

化合物5淡黃色油狀物；C47H80O2，ESI- MS：m/z677 [M + H]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：5.43(4H，m，H- 9′，10′，12′，13′)，4.61(1H，m，H- 3)，2.77(2H，t，J=6.7 Hz，H- 11′)，2.27(2H，t，J=7.4 Hz，H- 2′)，2.10(4H，m，H- 8′，14′)，1.68(m，- (CH2)n- )，1.02(3H，s，19- CH3)，0.91(3H，s，21- CH3)，0.89(3H，t，J=6.3 Hz，CH3)，0.85(3H，m，29- CH3)，0.84(3H，s，26- CH3)，0.80(3H，s，27- CH3)，0.68(3H，s，18- CH3)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：37.2(C- 1)，28.4(C- 2)，73.8(C- 3)，38.3(C- 4)，139.9(C- 5)，122.7(C- 6)，32.1(C- 7)，32.1(C- 8)，50.2(C- 9)，36.7(C- 10)，21.2(C- 11)，39.9(C- 12)，42.5(C- 13)，56.8(C- 14)，24.4(C- 15)，29.3(C- 16)，56.2(C- 17)，12.0(C- 18)，19.5(C- 19)，36.3(C- 20)，19.2(C- 21)，34.1(C- 22)，26.2(C- 23)，46.0(C- 24)，29.5(C- 25)，18.9(C- 26)，20.0(C- 27)，23.2(C- 28)，12.1(C- 29)，173.5(C- 1′)，34.9(C- 2′)，25.2(C- 3′)，29.8(C- 4′)，29.5(C- 5′)，32.0(C- 6′)，29.9(C- 7′)，27.4(C- 8′)，128.1(C- 9′)，130.4(C- 10′)，25.8(C- 11′)，130.2(C- 12′)，128.2(C- 13′)，28.0(C- 14′)，29.8(C- 15′)，31.7(C- 16′)，22.9(C- 17′)，14.3(C- 18′)。以上數(shù)據(jù)和文獻[11]對照基本一致，故確定化合物為β- 谷甾醇亞油酸酯。

化合物6無色針狀結晶；C29H50O，ESI- MS：m/z437.5 [M + Na]+；1H NMR(CDCl3，500 Hz)δH：5.35(1H，d，J= 5.4 Hz，H- 6)，3.59(1H，m，H- 3)，1.01(3H，s，19- CH3)，0.92(3H，d，J= 6.6 Hz，21- CH3)，0.84(3H，t，J=7.8 Hz，29- CH3)，0.81(3H，d，J=6.9 Hz，27- CH3)，0.68(3H，s，18- CH3)；13C NMR(CDCl3，125 Hz)δC：36.3(C- 1)，29.9(C- 2)，72.0(C- 3)，39.9(C- 4)，140.9(C- 5)，121.9(C- 6)，31.8(C- 7)，42.5(C- 8)，50.3(C- 9)，36.7(C- 10)，21.2(C- 11)，37.4(C- 12)，42.5(C- 13)，56.2(C- 14)，24.5(C- 15)，28.4(C- 16)，56.9(C- 17)，12.0(C- 18)，18.9(C- 19)，34.1(C- 20)，19.2(C- 21)，32.1(C- 22)，26.2(C- 23)，46.0(C- 24)，29.3(C- 25)，19.6(C- 26)，20.0(C- 27)，23.2(C- 28)，12.1(C- 29)。以上數(shù)據(jù)和文獻[12]對照基本一致，故確定化合物為β- 谷甾醇。

化合物7白色粉末；C19H38O4；ESI- MS：m/z353 [M + Na]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：4.24(1H，m，H- 1a)，4.16(1H，m，H- 1b)，3.96(1H，m，H- 2)，3.69(1H，dd，J=11.4，3.9 Hz，H- 3a)，3.59(1H，dd，J=11.5，5.8 Hz，H- 3b)，2.34(2H，t，J=7.6 Hz，H- 2′)，1.62(2H，d，J=7.3 Hz，H- 3′)，1.25(24H，s，H- 4′～15′)，0.87(3H，t，J=6.6 Hz，16′- CH3)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：65.3(C- 1)，70.4(C- 2)，63.5(C- 3)，174.5(C- 1′)，34.3(C- 2′)，32.1(C- 3′)，14.3(C- 16′)。以上數(shù)據(jù)和文獻[13]對照基本一致，故確定化合物為單棕櫚酸甘油酯。

化合物8白色粉末狀結晶；C30H60O4，ESI- MS：m/z507.7 [M + Na]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：4.23(2H，m，H- 1)，3.96(1H，m，H- 2)，3.70(1H，dd，J= 11.5，4.0 Hz，H- 3b)，3.60(1H，dd，J= 11.4，5.8 Hz，H- 3a)，2.35(2H，t，J=7.6 Hz，H- 2′)，1.69(2H，m，H- 3′)，1.25(46 H，m，H- 4′～H- 26′)，0.87(3H，t，J=6.6 Hz，27′- CH3)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：65.3(C- 1)，70.4(C- 2)，63.5(C- 3)，174.5(C- 1′)，34.3(C- 2′)，32.1(C- 3′)，29.9～29.8(C- 4′～C- 19′)，29.6(C- 20′)，29.5(C- 21′)，29.4(C- 22′)，29.3(C- 23′)，25.1(C- 24′)，22.8(C- 25′)，14.3(C- 27′)。以上數(shù)據(jù)和文獻[14]對照基本一致，故確定化合物為二十七烷酸甘油酯。

化合物9無色針狀結晶；C8H8O3，ESI- MS：m/z151 [M- H]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：9.83(1H，s，1- CHO)，7.43(1H，d，J=6.3 Hz，H- 6)，7.26(1H，s，H- 2)，7.04(1H，d，J=8.5 Hz，H- 5)，5.30(1H，s，4- OH)，3.97(3H，s，3- OCH3)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：130.0(C- 1)，108.9(C- 2)，147.3(C- 3)，151.8(C- 4)，114.5(C- 5)，127.7(C- 6)，191.1(CHO)，56.3(3- OCH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻[15]對照基本一致，故確定化合物為香草醛。

化合物10無色油狀物；C5H8O4，ESI- MS：m/z155 [M + Na]+；1H NMR(CDCl3，500 Hz)δH：3.70(3H，s，4- OCH3)，2.71(2H，m，H- 2)，2.66(2H，m，H- 3)；13C NMR(CDCl3，125 Hz)δC：177.3(COOH)，172.9(COO)，52.1(OCH3)，29.9(C- 2)，28.8(C- 3)。以上數(shù)據(jù)和文獻[16]對照基本一致，故確定化合物為琥珀酸甲酯。

化合物11白色油狀物；C8H18O，ESI- MS：m/z153.4 [M + Na]+；1H NMR(CDCl3，400 Hz)δH：3.66(2H，s，H- 1)，1.42(2H，s，H- 2)，1.25(n×CH2)，0.89(3H，t，J=6.4 Hz，8- CH3)；13C NMR(CDCl3，100 Hz)δC：77.4(C- 1)，32.1(C- 2)，30.5(C- 3)，29.9(C- 4)，29.5(n×CH2)，22.9(C- 7)，14.3(C- 8)。以上數(shù)據(jù)和文獻[17]對照基本一致，故確定化合物為1- 辛醇。

4 化合物的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性篩選

采用體外RANKL誘導分化的成熟的破骨細胞(osteoclast,OC)，評價11個化合物的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性。

分離正常C57BL/6J小鼠骨髓單核巨噬細胞(bone marrow macrophage,BMM)，將BMM細胞以6×104個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，細胞培養(yǎng)過夜后，用完全培養(yǎng)基配置待測化合物，所有化合物的終濃度均為10 μM，棄去板中原有的培養(yǎng)基，將配置好的化合物分別加入孔中。同時加入M- CSF和GST- rRANKL，使培養(yǎng)液中M- CSF和GST- rRANKL的終濃度分別為30和50 ng/mL。每兩天換藥一次，直至第4或第5天對照組出現(xiàn)明顯的細胞融合。棄去培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定30 min。之后用dd H2O輕輕洗三次，加入配好的TRAcP染液，37 ℃孵育30 min直至出現(xiàn)顏色。將板置于光學顯微鏡下觀察，將細胞核大于等于三個的融合細胞視作破骨細胞，計數(shù)，結果見圖2與圖3。用多功能酶標儀工作站檢測其在 540 nm 處的吸收強度。

活性測試結果發(fā)現(xiàn)化合物2、3、4和6具有顯著的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性，其IC50值分別為2.23、1.39、2.25和1.63 μM。

圖2 化合物1～11的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性Fig.2 Inhibitory effects of compounds 1- 11 on osteoclastic cell formation activity

圖3 破骨細胞的TRAcP染色圖片 Fig.3 Pictures of osteoclasts stained with TRAcP注：化合物2、3、4和6的濃度均為10 μM。Note:Concentrations of compounds 2,3,4 and 6 are all 10 μM.

5 結論

本研究從牛大力(M.speciosaChamp.)根的乙醇提物中分離鑒定了11個化合物，化合物5和10為首次從崖豆藤屬中分離得到。對分離到的11個化合物進行抑制破骨細胞產(chǎn)生活性研究，其中化合物2、3、4和6有顯著的抑制破骨細胞產(chǎn)生活性?；衔?是化合物6碳3位被亞油酸取代，未顯示抑制破骨細胞產(chǎn)生活性，說明3位長鏈脂肪酰基取代不利于抑制破骨細胞產(chǎn)生活性?；衔?為首次報道具有抑制破骨細胞產(chǎn)生活性。本研究，為牛大力在骨性疾病上的應用以及牛大力的進一步開發(fā)應用提供了依據(jù)。