張賀博 劉曉亮 趙彥艷

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，遼寧沈陽 110001

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，全世界約有7000 萬人患有癲癇，其反復(fù)發(fā)作的特征對患者和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。雖然人們在癲癇發(fā)病機(jī)制方面做了大量的研究工作，但由于病因復(fù)雜，迄今為止癲癇發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）作為生物體內(nèi)內(nèi)源性蛋白降解重要途徑之一，其功能失調(diào)與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。本文就UPP 在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用展開綜述。

1 UPP 的組成

UPP 由泛素、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3、26S 蛋白酶體以及去泛素化酶（DUBs）組成。泛素是含有76 個氨基酸殘基的小分子蛋白質(zhì)，因其廣泛分布于各種真核細(xì)胞及組織中而得名。E1是一種廣泛表達(dá)的多肽，其結(jié)構(gòu)和功能非常保守。E2結(jié)構(gòu)域中央是決定E2 活性的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基可以識別不同的E3 結(jié)構(gòu)域。在人類基因組E3 大約有600 多種，其在特異性識別底物中最為重要。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鑒定的E3 可分為4 種類型[2]：含有HECT 結(jié)構(gòu)域的E3、 含有RING 結(jié)構(gòu)域的E3、 含有U-box 結(jié)構(gòu)域的E3 和含有PHD 類E3。26S 蛋白酶體是UPP 中降解蛋白質(zhì)的核心構(gòu)成，由1 個20S 核心蛋白酶和2 個19S 調(diào)節(jié)顆粒組成。19S 調(diào)節(jié)顆粒識別泛素化的靶蛋白使其去泛素化，并將去泛素的靶蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到20S 核心蛋白酶腔內(nèi)蛋白水解位點(diǎn)，最終在這些位點(diǎn)上目標(biāo)蛋白被降解和回收[3]。DUB 是一種從底物蛋白中去除泛素或泛素樣分子并分解多泛素鏈的蛋白酶，在不同的細(xì)胞環(huán)境中調(diào)節(jié)UPP 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解[4]。

2 泛素化修飾過程

泛素化修飾是由E1、E2 和E3 三種酶協(xié)同作用介導(dǎo)泛素分子在底物蛋白上形成泛素鏈[5]。首先E1水解一分子的ATP 并將一個泛素分子腺苷酰化，E1 活性中心的半胱氨酸殘基與泛素的C 端甘氨酸殘基形成硫酯鍵，游離的泛素分子被活化；隨后活化的泛素被轉(zhuǎn)移到E2 的半胱氨酸殘基上，E2 將泛素轉(zhuǎn)移給泛素-蛋白連接酶E3；E3 直接或間接與底物蛋白結(jié)合，促使泛素C 端的羧基與底物蛋白的賴氨酸殘基ε 氨基基團(tuán)上形成異肽鍵，或者連接有泛素的E2 與E3結(jié)合，E2 將泛素轉(zhuǎn)移到蛋白底物上，完成泛素化修飾[6]。泛素化修飾的蛋白可經(jīng)由26S 蛋白酶體特異性降解，或者改變蛋白質(zhì)的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理生化過程[7]。

3 UPP 與離子通道

許多影響中樞神經(jīng)興奮性的離子通道蛋白都受UPP 的調(diào)節(jié)，如鈉離子通道（Navs）、鉀離子通道（Kvs）等電壓門控離子通道，以及AMPA 受體和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體等配體門控離子通道。由于離子通道穩(wěn)態(tài)在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性中的重要作用，神經(jīng)元中UPP 受損可能導(dǎo)致癲癇的發(fā)生[8]。

3.1 Nedd4-2 與Navs

在癲癇的遺傳學(xué)研究中證實(shí)，編碼電壓門控的Navs 蛋白的基因突變是特發(fā)性癲癇發(fā)生常見的原因。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Nav1 表達(dá)的亞型（Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8）通道蛋白的C 端都具有PY 模序，這給泛素E3 連接酶Nedd4-2 提供了一個相互作用的位點(diǎn)。SCN1A 基因編碼人類Nav1.1 通道，在大腦皮質(zhì)及海馬表達(dá)最為豐富。Escayg 等[9]證實(shí)SCN1A 的突變可以破壞與Nedd4-2 的結(jié)合，從而阻止了Nedd4-2 對其進(jìn)行泛素化，導(dǎo)致大腦神經(jīng)元中Nav1.1 通道功能獲得，影響神經(jīng)元的興奮性，最終參與癲癇的發(fā)生。Nav1.2（SCN2A）和Nav1.3（SCN3A）主要存在于神經(jīng)元軸突處，Nav1.2 的功能障礙與良性家族性新生兒-嬰兒驚厥有密切聯(lián)系。Rougier 等[10]通過在HEK293 細(xì)胞以及非洲爪蟾卵細(xì)胞中過表達(dá)Nedd4-2，發(fā)現(xiàn)Nav1.2 和Nav1.3 的泛素化程度增強(qiáng)，并導(dǎo)致隨后質(zhì)膜上離子通道水平的下調(diào)。但突變的SCN2A 與SCN3A 是否影響Nedd4-2 泛素化修飾，目前還不清楚。SCN8A 編碼Nav1.6 通道，對中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元興奮性至關(guān)重要。O′Brien 研究團(tuán)隊(duì)[11]通過構(gòu)建條件性SCN8A 敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元持續(xù)電流和再發(fā)電流減少，降低了突變小鼠的神經(jīng)元興奮性。Nedd4-2 包含WW1 和WW4 結(jié)構(gòu)域，它們與Nav1.6 的C 端的Pro-Ser-Tyr1945 基序相互作用。Gasser 等[12]共表達(dá)Nav1.6 和Nedd4-2，研究發(fā)現(xiàn)Nedd4-2 可以顯著降低Nav1.6 峰值電流，并且該降低依賴于Nav1.6 的C 端Pro-Ser-Tyr 基序和L1 端的Pro-Gly-Ser-Pro 基序。另外有研究指出，DUB 家族成員中的泛素特異性蛋白酶（USP）增強(qiáng)了Nedd4-2 的磷酸化水平，并且進(jìn)一步激活了Navs，使癲癇的發(fā)生更頻繁，神經(jīng)元的丟失也更明顯[13]。

3.2 CRL4A 與Kvs

Kvs 是分布最廣、 類型最多的一類離子通道，在真核細(xì)胞中主要參與細(xì)胞膜靜息電位的形成以及動作電位的復(fù)極化的調(diào)節(jié)，因此在神經(jīng)元和肌肉電興奮性方面發(fā)揮重要作用。Kvs 是由2 個α 亞基和2 個β亞基組成的四聚體，α 亞基組成通道孔，β 亞基維持鉀通道正常生理學(xué)特性。目前已發(fā)現(xiàn)與癲癇相關(guān)的Kvs 基因包括KCNA2、KCNC1、KCNT1 以及KCNQ 家族等，Kvs 基因的突變與癲癇的發(fā)生存在重要聯(lián)系。CRL4A 是一種E3，其屬于RING 家族一員。CRL4A通過適配器蛋白CRBN 構(gòu)成E3 泛素連接酶復(fù)合體，與Kvs 相互作用，小分子藥物沙利度胺，可通過直接與CRBN 結(jié)合抑制CRL4A 連接酶底物特異性[14]。Liu等[15]研究表明，E3 連接酶抑制劑處理小鼠癲癇易感性增加，而Kvs 抑制劑處理可以減輕癲癇的發(fā)作；CRL4A 可以對Kvs 進(jìn)行泛素化并將其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，利用沙利度胺抑制CRL4A 活性，細(xì)胞膜Kvs 蛋白升高，神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)；DDB1 作為CRL4A 亞基，對其條件性基因敲除的小鼠進(jìn)行癲癇誘導(dǎo)，與野生型小鼠相比癲癇敏感性增強(qiáng)。該研究提示CRL4A 介導(dǎo)的Kvs 泛素化修飾和CRL4A 活性在癲癇的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。由于Kvs 的功能與癲癇之間存在廣泛的相關(guān)性，可預(yù)測CRL4A 可以成為提高癲癇發(fā)作閾值和降低癲癇發(fā)作敏感性的靶點(diǎn)[16-18]。Klassen 等[19]通過對特發(fā)性癲癇患者的樣本進(jìn)行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)Kvs存在突變，但是這些突變是否會影響CRL4A 介導(dǎo)的Kvs 泛素化，有待進(jìn)一步的研究。

3.3 Nedd4 家族與谷氨酸門控離子通道

Nedd4 家族是含有HECT 結(jié)構(gòu)域的E3。氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR）是突觸后谷氨酸門控離子通道，介導(dǎo)哺乳動物大腦中快速興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。Nedd4-1 是第一個被證明與AMPAR 的亞基GluA1 在神經(jīng)元中相互作用并促進(jìn)泛素化的E3 連接酶。Schwarz 等[20]發(fā)現(xiàn)Nedd4-1 過表達(dá)使AMPAR 的表達(dá)降低。Scudder 等[21]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)缺乏C2 結(jié)構(gòu)域的Nedd4-1，不再引起AMPAR 表達(dá)降低。隨后Jewett 等[22]發(fā)現(xiàn)Nedd4-2 基因敲除可使AMPAR 的亞基GluA1 的泛素化水平下降，神經(jīng)元活性升高，并證實(shí)GluA1 是Nedd4-2 的新底物。Zhu 等[23]通過構(gòu)建腦組織條件敲除Nedd4-2 小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠皮層神經(jīng)元過度活躍；通過GluA1 亞基泛素化增強(qiáng)海仁酸誘發(fā)癲癇的易感性；三種癲癇相關(guān)的Nedd4-2 錯義突變均破壞了GluA1 的泛素化；降低GluA1 的表達(dá)水平能夠糾正Nedd4-2 功能不足引起的癲癇易感性。Zhu 等[24]最新研究表明，缺乏C2 結(jié)構(gòu)域的Nedd4-2 對GluA1 泛素化活性降低； 缺乏C2的Nedd4-2 抑制興奮性突觸強(qiáng)度。上述研究表明，Nedd4-1 與Nedd4-2 通過調(diào)節(jié)AMPAR 的亞基Glu-A1 泛素化，參與癲癇的發(fā)生。Kim 等[25]發(fā)現(xiàn)吡哆醛-5’-磷酸酶可以在Nedd4-2 的絲氨酸s448 位點(diǎn)去磷酸化，并加速Nedd4-2 的泛素化；在吡哆醛-5’-磷酸酶敲除鼠中，Nedd4-2 表達(dá)增加，并通過泛素化Glu-A1，減少GluA1 的細(xì)胞膜表面表達(dá)以抑制其功能；過表達(dá)吡哆醛-5’-磷酸酶后，增加了Nedd4-2 泛素化并促進(jìn)癲癇發(fā)生進(jìn)展。上述研究表明，吡哆醛-5’-磷酸酶介導(dǎo)的Nedd4-2 的去磷酸化通過GluA1 泛素化調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。

NMDA 是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類谷氨酸門控性離子通道受體，參與興奮性突觸傳遞、神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性形成等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸主要以谷氨酸為遞質(zhì)，NMDA 受體表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致癲癇發(fā)作的一個重要因素[26]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸濃度升高，過度激活NMDA 受體，大量神經(jīng)元突觸后膜發(fā)生同步性去極化，神經(jīng)元產(chǎn)生持續(xù)的放電，最終導(dǎo)致癲癇的發(fā)作。Gautam 等[27]利用GST-Pull Down 和Co-IP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NMDA 受體亞基GluN2D和Nedd4 存在直接相互作用，Nedd4 的WW2 和WW3 結(jié)構(gòu)域與GluN2DC 端PPXY 基序相互結(jié)合，增強(qiáng)GluN2D 的泛素化水平并降低了含有GluN2D 亞基的NMDA 受體的反應(yīng)性。

4 小結(jié)

綜上所述，UPP 是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要途徑，其通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞表面電壓門控離子通道蛋白和配體門控離子通道蛋白泛素化水平，進(jìn)而影響神經(jīng)元的興奮性，最終參與癲癇的發(fā)生。癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，當(dāng)前研究主要是來自細(xì)胞和癲癇動物模型，可能需要大量的人類標(biāo)本實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。UPP 參與了癲癇發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)一步揭示UPP 更多的靶蛋白，并從各個環(huán)節(jié)完善具體作用機(jī)制，將來為探索以UPP為切入點(diǎn)的癲癇治療藥物提供線索。