劉洋 梁磊 趙建榮

囊腫性腎病(cystic fibrosis disease)是指腎臟出現(xiàn)單個或多個囊腫的一大組疾病，其中單純性腎囊腫最常見，其次是多囊腎病(polycystic kidney disease,PKD)。囊腫性腎病根據(jù)遺傳與否，分為遺傳性和非遺傳性兩大類；前者包括常染色體顯性、隱性和X-連鎖遺傳三種[1]。常染色體隱性遺傳多囊腎病(ARPKD)是以腎小管囊腫(集合管系統(tǒng)為主)形成為特征，最終導(dǎo)致終末期腎病[2]。ARPKD是一種罕見的遺傳性疾病，其發(fā)病率為1∶40 000～1∶20 000，主要為胎兒和嬰兒，是圍產(chǎn)期死亡的常見原因之一[3]。新生兒時期，死亡風險相對較高，許多嬰兒因呼吸衰竭而死亡。隨著孩子年齡的增長，會出現(xiàn)進行性腎臟病，肝臟纖維化及繼發(fā)性門脈高壓[4]。ARPKD是導(dǎo)致兒童透析依賴和兒童腎、肝或肝腎聯(lián)合移植(KTx,LTx,CLKTx)的主要原因之一[5]。研究表明ARPKD是由多囊腎肝疾病1(PKHD1)基因或DAZ相互作用蛋白1樣基因(DZIP1L)突變引起[6,7]。罕見病的概念在我國出現(xiàn)的時間并不長，因其特殊和罕見，臨床醫(yī)生也常因認識不足而出現(xiàn)誤診或漏診。雖然從單種疾病來看，每個罕見病的發(fā)病率都較低，但由于疾病種類眾多,目前患患者數(shù)不斷增長。雖然我國臨床對于遺傳性腎臟疾病的診斷提高到分子遺傳學(xué)水平，提前到產(chǎn)前診斷階段，但仍面臨眾多問題。本文主要圍繞ARPKD突變基因及相關(guān)基因測序進行綜述，希望對臨床工作有所幫助。

1 發(fā)病機制

1.1 PKHD1 ARPKD主要由PKHD1的突變引起。2002年兩個獨立的研究組分別采用不同的方法定位克隆了ARPKD的致病基因；并命名為PKHD1基因；PKHD1是一個大而復(fù)雜的基因，具有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄譜，可能產(chǎn)生多種蛋白亞型。其位于6p12染色體上，包含470 kb以上的基因組序列。其最長的閱讀框(ORF)由66個外顯子組成，可偏碼一個大的單通道跨膜蛋白-纖維素蛋白(fibrocystin)。盡管fibrocystin在ARPKD表型形成中的確切作用尚未清楚，但其在初級纖毛的定位及其與陽離子通道polycystin-2的相互作用表明其參與信號傳導(dǎo)，這一通路的破壞會引起相應(yīng)器官中管狀結(jié)構(gòu)形態(tài)及穩(wěn)定性的缺陷。纖毛是一種以微管為基礎(chǔ)的細胞器，從大多數(shù)脊椎動物細胞的表面伸出，起著化學(xué)、機械感覺和液體運輸?shù)淖饔谩４送?，一些證據(jù)顯示，fibrocystin與鈣離子(Ca2+)調(diào)節(jié)的親環(huán)配體的相互作用提示其可能也參與了Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[8]。它主要表達于腎臟(多集中在腎小管和腎小管增厚環(huán))、肝臟(膽管上皮)和胰腺[9,10]。囊性腎病是一些綜合征性纖毛病的特征之一，起因是原發(fā)性纖毛功能障礙[11]。此外，ARPKD所致的膽管上皮細胞原纖毛的缺陷在肝臟中也能夠誘發(fā)膽管板畸形，進而影響膽管的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致膽道系統(tǒng)的囊性病變、炎性病變和纖維化[12]。多種基于PKHD1的ARPKD模型已被描述，主要是通過基因靶向方法在小鼠中產(chǎn)生的。雖然在所有這些小鼠模型中都存在ARPKD的肝臟表型，但腎臟表型通常不存在，而且出現(xiàn)時是一種輕度、緩慢進展的病變，多累及近端小管而非集合管。一些模型也有嚴重的胰腺導(dǎo)管表型，而在ARPKD患者中，具有臨床意義的胰腺疾病相當罕見。這些動物模型中輕度腎表型的機制尚不清楚。然而，由于遺傳背景似乎對腎臟病理學(xué)有重要影響，遺傳修飾物可能調(diào)節(jié)腎臟疾病。PCK大鼠由于PKHD1的自發(fā)突變而產(chǎn)生，其肝臟表型與ARPKD非常相似，而該模型中緩慢進展的腎囊性病變與ADPKD的腎囊性病變相比，更接近ARPKD。將PCK大鼠的PKHD1突變導(dǎo)入到不同的背景中，可以改善腎臟的表型，但不能改善肝臟的表型，這再次表明遺傳因素調(diào)節(jié)了腎囊性表型的嚴重程度。有研究共檢測到128個基因突變;55.5%的突變是截斷型的，包括分幀、小缺失、插入、重復(fù)、無義和帶外顯子跳躍的剪接突變，42.2%是錯義突變[12]。目前許多不同的PKHD1已經(jīng)在整個基因組中被報道，這些突變的組合決定了ARPKD患者的表型，且表型的嚴重程度可能取決于沿著纖維胞漿蛋白的氨基酸取代的位置。到目前為止，在ARPKD/PKHD1 Aachen數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)描述了748個PKHD1基因變體[13],如此高數(shù)量的新變異導(dǎo)致了基因型與表型的相關(guān)性問題。由于復(fù)合雜合子多個等位基因的高發(fā)生率，建立PKHD1的基因型-表型相關(guān)性具有很大難度，因此目前基因型-表型相關(guān)性關(guān)注的是突變類型，而不是突變的特定位點。且兩個截斷突變的患者具有致命的表型，并表現(xiàn)出圍生兒或新生兒死亡率；而至少一個錯義基因存在的患者受影響較小，更有可能在新生兒期存活，這表明許多錯義突變是產(chǎn)生部分功能蛋白的半等位基因[14-16]。完整的纖維囊蛋白的臨界量似乎是正常功能所必需的，但顯然不能被替代的亞型所補償，這可能是由下游的ATG密碼子重新啟動翻譯所產(chǎn)生的。相反，錯義突變和小的框內(nèi)缺失可能對蛋白質(zhì)功能有更多的可變影響[17]。表型的多樣性還反映了不同的PKHD1錯義突變可能在多大程度上損害突變蛋白的功能和(或)豐度。Burhan等[18]在沙特患者的外顯子和側(cè)翼區(qū)域研究中，證實了ARPKD(PKHD1)基因中，由于氨基酸取代而導(dǎo)致的致病變異。

1.2 DZIP1L 最近在中度ARPKD的臨床過程中， DZIP1L的突變已被報道。Lu等[7]在來自4個家庭的7例患者中發(fā)現(xiàn)了纖毛相關(guān)基因 DZIP1L的純合突變。在兩個不相干的同源多血統(tǒng)中，通過連鎖分析和測序排除已知的PKD基因突變，共發(fā)現(xiàn)5例兒童患ARPKD。并通過分析父母及所有受影響兒童的DNA中進行全基因組的SNP，發(fā)現(xiàn)了一個重疊的純合峰，這表明在染色體3p22上存在區(qū)域為7.5 Mb的新的疾病位點。DZIP1L編碼睫狀體蛋白(DAZ相互作用蛋白1)，與其他PKD蛋白共同定位于中心粒以及基體遠端。DZIP1L基因包含基因組中53個堿基對，包含16個外顯子，編碼767個氨基酸的蛋白質(zhì)。與PKHD1相比，DZIP1L突變引起的ARPKD相對較罕見，可能與PKHD1相對于DZIP1L更大有關(guān)。此外，有數(shù)據(jù)表明，DPIP1L n端區(qū)域的基因更容易突變[19]。初級纖毛是Hedgehog基因(Hh)信號傳導(dǎo)所必需的微管狀細胞器，由一個基底體、一個纖毛軸突和一個位于前兩個結(jié)構(gòu)之間的腔室組成，稱為過渡區(qū)(TZ)。TZ是控制纖毛蛋白組成的“看門人”，但其在纖毛芽形成中的作用尚不清楚。Wang等[20]證實了Hh信號通路需要 DZIP1L，其與基礎(chǔ)體附屬物蛋白和Rpgrip1l(TZ蛋白)共同定位。Dzip1l的缺失會導(dǎo)致體內(nèi)纖毛形成減少和畸形纖毛。相關(guān)實驗?zāi)Ｐ椭杏^察到在表型變異ARPKD中,Dzip11小鼠(由N-ethyl-N-nitrosourea-induced誘變篩選識別且包含一個無義突變Dzip1l)顯示許多胚胎形態(tài)缺陷,包括肢體和顱面缺陷等。通過將Dzip1lwpy/wpy小鼠與一個外系雜交，改善了顱面表型，這表明至少在人類ARPKD表型上的一些差異可能是由于遺傳背景影響所致。在Dzip1l胚胎中檢測到與Hedgehog信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因表達的組織特異性變化，如肢體的基因表達變化與polydactyly一致[7]?？傊?，這些數(shù)據(jù)提供了ARPKD不是一種同質(zhì)性疾病的結(jié)論性證據(jù)，并證實DZIP1L是其發(fā)病機制中的第二個基因。

2 基因咨詢

ARPKD基因變異位點可散在分布于整個 PKHDl基因片段上，由于檢測手段和研究人群的不同， PKHDl基因變異的檢出率為42%～87%[21]。大多數(shù)家庭都有自己的突變，因此在ARPKD患者中由于私人突變而觀察到可變表型，基于基因的診斷仍然很困難。但是，檢測出更多與疾病分離的突變將改進基于基因的診斷。目前靶向外顯子組測序已成功用于識別導(dǎo)致孟德爾疾病的基因[22]。分子遺傳學(xué)檢測方法包括單基因檢測、多基因面板、外顯子測序和基因組測序[23]。

單基因檢測：首先對基因進行序列分析；如果只發(fā)現(xiàn)一個或未發(fā)現(xiàn)致病變異，則進行基因定位的刪除、重復(fù)分析；多基因面板：許多遺傳疾病和表型是異質(zhì)的,即>1個基因的致病變異可以導(dǎo)致1個表現(xiàn)型或1個遺傳疾病。在下一代測序發(fā)展之前，檢測1個以上基因唯一經(jīng)濟有效的方法是序列單基因檢測(即測序)，這種方法昂貴且耗時；隨著多基因板的發(fā)展及廣泛應(yīng)用，可以同時檢測2～150個基因。多基因面板中使用的方法可能包括序列分析、刪除/重復(fù)分析、其他非基于序列的測試[24]。

更全面的基因檢測包括外顯子測序和基因組測序。外顯子測序旨在分析基因組中編碼蛋白質(zhì)的核基因序列?；蚪M測序旨在識別所有編碼和非編碼的細胞核DNA序列。雖然基因組測定可以識別編碼區(qū)外的突變，但通常無法確認這些變異的致病性[24]。目前,PKHD1 基因的突變檢測存在 3 個限制因素:基因很大、存在很多的突變雜合子以及存在不同的轉(zhuǎn)錄本。PKHD1 的突變散布于整個基因。在突變譜方面,大約 45%的是使多肽鏈提前終止的無義突變。突變的類型比突變的位點更能反應(yīng)預(yù)后,無義突變比錯義突變預(yù)后差,凡一對等位基因都攜帶無義突變的患兒均在圍產(chǎn)期或新生兒期死亡。發(fā)病率低和突變基因的不同組合使研究 ARPKD 的基因型和表型聯(lián)系比較困難,還需要更多的病例和更好的檢測方法進行系統(tǒng)的分析。有文獻報道，應(yīng)用PCR擴增、DNA直接測序等技術(shù)手段對引產(chǎn)胎兒PKHD1基因進行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該引產(chǎn)胎兒第17號外顯子c．1587T>C(p.N529N)變異與第32號外顯子c.3785C>T(p.A1262V)變異[25]。這兩種變異在國外一些研究中被認為是多態(tài)性位點(polymorphism，SNP)，但仍具有可疑致病性。且17號外顯子發(fā)生同義突變，其編碼蛋白質(zhì)未發(fā)生改變；而32號外顯子發(fā)生錯義突變，從而使纖囊素蛋白多肽鏈的第1 262號氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，不排除這種突變引起纖囊素蛋白功能改變，但缺乏來自表達譜的直接證據(jù)，因此本課題組認為由于剪接異常導(dǎo)致蛋白功能缺陷，最終導(dǎo)致疾病的比例可能比已知更高，傳統(tǒng)的外顯子組測序/基因組測序等DNA檢測在這一類變異的檢測中可能會有大量的漏檢，尤其是對于編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域的變異來說。外顯子捕獲測序可以得到序列變異的信息，而轉(zhuǎn)錄組測序不僅可以獲得已知序列的變異信息和新的轉(zhuǎn)錄本信息(針對從頭拼接)，還可以得到表達譜信息。除此以外，轉(zhuǎn)錄組測序還能夠分析mRNA的可變剪接，而外顯子捕獲測序的樣品來源是基因組，不能進行mRNA的可變剪接分析，只能得到外顯子上的序列變化。雖然已經(jīng)報道過有關(guān) PKHD1 的多個可選剪接的轉(zhuǎn)錄，然而這些亞型的確切功能和臨床意義尚不清楚，有待于進一步研究。

為了提高ARPKD的總體診斷率，使ARPKD盡快進入下一批罕見病目錄，本課題組考慮到全轉(zhuǎn)錄組測序可進行全基因組水平的基因表達差異研究，具有定量更準確、可重復(fù)性更高、檢測范圍更廣、分析更可靠等特點，除了分析基因表達水平，全轉(zhuǎn)錄組測序還能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、SNP、剪接變體，并提供等位基因特異的基因表達，計劃在外顯子組測序的基礎(chǔ)上進行全轉(zhuǎn)錄組測序，希望通過全轉(zhuǎn)錄組測序提高常染色體隱性遺傳多囊性腎臟疾病的整體診斷率，并希望通過與數(shù)據(jù)庫中的表達譜進行結(jié)果比對分析，進一步鑒定出新的致病變異，利用分析框架集中發(fā)掘患者獨特的轉(zhuǎn)錄水平變化。Daniel MacArthur領(lǐng)導(dǎo)的團隊第一個利用全轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)進行孟德爾遺傳疾病的基因診斷隊列研究。研究團隊對那些未確診的罕見遺傳病患者的骨骼肌活檢樣本進行RNA-seq，以探索使用DNA-seq不易鑒定出的新型致病突變，例如致病性剪接位點變異。這項研究是迄今為止最大的一項針對未確診疾病患者進行轉(zhuǎn)錄組測序以確定遺傳疾病相關(guān)未知突變的研究。研究結(jié)果表明RNA-seq能夠幫助鑒定許多DNA-seq中未能鑒定的剪接變異，首次證明了遺傳疾病中RNA-seq在臨床診斷中也具有重要的意義。有研究發(fā)表了RNA測序應(yīng)用的最新研究成果，RNA測序數(shù)據(jù)有助于發(fā)現(xiàn)罕見的基因變異，同時，研究團隊開發(fā)了一種新的方法-表達變異分析(ANEVA)，能夠通過分析兩個等位基因的表達失衡來診斷罕見疾病。且該研究團隊展示了將新方法應(yīng)用于70位孟德爾肌肉疾病患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，不僅幫助確定了病例中確切的致病基因變異，并確診了數(shù)個潛在的新病例[26]。可見，RNA-Seq 正在革命性的影響轉(zhuǎn)錄組研究，這是一種高度靈敏而準確地在轉(zhuǎn)錄組層面衡量表達的工具，它可以在不同的疾病狀態(tài)下、不同療法的響應(yīng)下、不同的環(huán)境條件下以及范圍更廣泛的其他研究中對以前未檢測到的變化提供一種可見性。RNA-Seq 允許研究人員在一次實驗中同時檢測已知和新發(fā)的信息，包括轉(zhuǎn)錄本亞型、基因融合、單核苷酸變異、等位基因特異性基因表達以及目前通過先驗知識尚不能明確的其他功能信息。

3 臨床表現(xiàn)

ARPKD通常又被稱為嬰兒性多囊腎病，屬于肝腎纖維囊性疾??； 以隱性遺傳方式遺傳，雜合子攜帶率為1∶70[20]。其發(fā)病時間不定，可以出現(xiàn)在圍生期、新生兒期、嬰兒期、青少年甚至成年期，男女發(fā)病率相等，不同種族間無明顯差異。50%的患病胎兒因羊水過少導(dǎo)致肺發(fā)育不全而在圍產(chǎn)期死亡，此期主要為腎損害。大多數(shù)患有ARPKD的個體在新生兒期出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，可表現(xiàn)為腎臟體積增大、高血壓和不同程度的腎功能障礙；嬰兒和兒童期高血壓多見，常伴有心肌肥大、充血性心力衰竭；渡過嬰兒期的患者預(yù)后相對較好[27,28]。APPKD腎衰竭進展相對緩慢，15歲之前20%～45%進展至終末期腎衰竭，25歲以前比列達70%；患兒常伴有生長緩慢、貧血及腎性貧血；隨著年齡增長，肝臟癥狀及體征顯現(xiàn)明顯，包括肝纖維化、肝內(nèi)膽管擴張以及引起的門靜脈高壓，可有胃腸道出血、門靜脈血栓、脾大等，但肝功受累較罕見[29]。囊腫的發(fā)生和發(fā)展需要上皮細胞的增殖、上皮液的分泌和細胞外基質(zhì)的重建。ARPKD 中器官受累程度的變化尚未得到合理的解釋，但被普遍認可。在兩種主要的囊性腎病中，ARPKD通常在圍產(chǎn)期被診斷，而常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)被稱為成人型多囊腎病。ADPKD也是一種多系統(tǒng)進行性囊性疾病，器官(如肝臟、精囊、胰腺、蛛網(wǎng)膜)有囊腫及非囊性病變(如顱內(nèi)動脈瘤、水腫、主動脈根部擴張、胸主動脈剝離、二尖瓣脫垂、結(jié)腸憩室、腹壁疝)。ADPKD患者臨床表現(xiàn)通常在30歲左右出現(xiàn)，常見高血壓，伴有或不伴有腎源性疼痛或血尿或其他囊腫相關(guān)的并發(fā)癥，如感染或破裂。其中，腎結(jié)石是一種已知的ADPKD并發(fā)癥，它的發(fā)病率很高。腎小管性酸中毒等醫(yī)學(xué)腎病在這一人群中也很常見。大約45%的患者可能發(fā)展為終末期腎病，這將導(dǎo)致他們依賴血液透析或腎移植。ARPKD與ADPKD形成囊腫的某些大體特征不同，以此進行鑒別。在胎兒宮內(nèi)生活的前3個月，ARPKD囊腫起源于近端小管，但出生時它們僅局限于集合管，與腎元保持連續(xù)性。相反，ADPKD囊腫可能起源于腎元的任何部分，盡管來自遠端腎元和集合管的囊腫通常占優(yōu)勢。ARPKD 通常在子宮內(nèi)或出生時被診斷出來，并且表型差異很大，新生兒在年齡和初始臨床癥狀表現(xiàn)方面存在顯著差異，包括腎臟和膽管異常的相對水平。此外先天性肝纖維化(CHF)是ARPKD中一個不變的發(fā)現(xiàn)，而在ADPKD中很少觀察到。在許多其他疾病中，病理表現(xiàn)中都有腎囊腫是，而這些與ARPKD的不同之處在于，腎囊腫僅代表該綜合征的多種發(fā)育異常的一個組成部分。

4 治療

ARPKD治療取決于臨床表現(xiàn)的嚴重程度和涉及器官：包括呼吸功能監(jiān)測、腎功能檢查、肝功能檢查、嬰兒生長評估、血壓監(jiān)測和對癥治療。雙器官移植(肝和腎)取決于門脈高壓的嚴重程度和終末期腎臟疾病，在相當數(shù)量的病例中顯示了有希望的結(jié)果；同時遺傳咨詢對患者和家庭都是至關(guān)重要的。由羊水過少引起的肺發(fā)育不全在許多受影響的嬰兒中發(fā)生。這些嬰兒中約有30%在新生兒期或出生后1年內(nèi)死于呼吸功能不全或疊加性肺部感染。通過新生兒呼吸支持和腎臟替代治療，這些嬰兒的長期存活率提高到80%以上。新生兒多囊腎病是本年齡段慢性腎臟疾病(CKD)的主要病因之一。由于文獻中可獲得的研究較少，所以在這個年齡段中CKD的發(fā)病率很難確定。因此，Wedekin等[30]報告說，在研究的地理區(qū)域，新生嬰兒的發(fā)病率為萬分之一。文獻中可獲得的大多數(shù)研究涉及終末期腎病的發(fā)病率和病因?qū)W，0～2歲的報道發(fā)病率為每百萬同齡健康嬰兒7.1例?；谒羞@些事實，對所有出生第1個月的新生兒進行超聲篩查，將有助于確定該病的實際發(fā)病率，并預(yù)防其與其他嚴重疾病類似的進一步并發(fā)癥。一項對來自40個不同國家的264例患者的研究表明，13%的新生兒終末期腎病病例是由囊性腎病、腎臟和尿道的先天性異常(55%)、皮質(zhì)壞死(11%)和先天性腎病綜合征(6%)引起的[31]。隨著腎臟替代治療和腎臟移植的進展，提高了長期存活率，臨床肝膽疾病很可能成為ARPKD自然史的一個主要特征。抗高血壓治療明顯改善ARPKD患者預(yù)后。因此，它可以被認為是ARPKD的一個管理選項。高血壓常見于嬰幼兒及以后的兒童期ARPKD，它可能是唯一的癥狀。高血壓也見于腎功能正常的患者，幾乎所有ARPKD患兒都有高血壓表現(xiàn)。如果不能有效地治療高血壓，就可能發(fā)生心動過速或充血性心臟病。ARPKD中高血壓的發(fā)病機制尚不清楚。此外，繼發(fā)性動脈性高血壓可能是其他原因的結(jié)果，包括不同的危及生命的中毒，因此對兒童進行鑒別診斷至關(guān)重要[32]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑是這類高血壓的一線治療藥物，盡管與鈣通道阻滯劑、利尿劑和-受體阻滯劑一起的研究還很少。目前抗高血壓治療是改善ARPKD患者重要預(yù)后的一種共識。此外，由于無法濃縮和稀釋尿液而導(dǎo)致的電解質(zhì)異常，這在早期、嚴重的ARPKD表現(xiàn)中非常常見，應(yīng)予以預(yù)測和治療。堅定的營養(yǎng)計劃和酸中毒的糾正對優(yōu)化線性腎臟生長是很重要的。如果發(fā)生腎生長損害，可考慮用生長激素治療[33]。

ARPKD是一種嚴重的疾病，死亡率很高。隨著新生兒時期的治療進展，患者的生存機會增加。研究證實其預(yù)后比預(yù)想的好，度過嬰兒期的患者預(yù)后相對較好，50%～80%的患者可存活15年。然而，由于廣泛的相關(guān)并發(fā)癥，這種情況的預(yù)后仍是不可預(yù)測的。ARPKD目前尚缺乏根治的有效措施，多以對癥治療為主。我們希望通過患者基因組的高通量靶向分析幫助疾病進行準確遺傳診斷，同時避免誤診，給臨床醫(yī)生和研究人員能夠更好地解釋已識別的變異，提高常染色體隱性遺傳多囊腎患者的診斷。