梁棟 劉光亮 王永 馬興華 石屹 王樹(shù)聲 王程棟

摘 ?要：為了解干旱脅迫對(duì)煙草不同部位細(xì)胞程序化死亡的影響，以中煙100（不耐旱）和農(nóng)大202（耐旱）為材料，采用2.5% PEG-6000模擬干旱，分析了不同耐旱性材料表型差異，用DNA Ladder法、TUNEL法測(cè)定煙草不同部位細(xì)胞程序化死亡發(fā)生的時(shí)間及程度差異。結(jié)果表明：（1）干旱脅迫下，農(nóng)大202和中煙100的生物量、根長(zhǎng)、根直徑均較對(duì)照下降，其中中煙100下降幅度更大且與對(duì)照達(dá)到極顯著差異;（2）中煙100在干旱脅迫第3天，各部位均已發(fā)生PCD，但是不同部位對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)不同，葉片、側(cè)根的PCD發(fā)生程度相近，根尖細(xì)胞發(fā)生程度明顯高于葉片及側(cè)根;（3）根據(jù)定位觀察可知側(cè)根皮層細(xì)胞以及遠(yuǎn)離葉脈的細(xì)胞較早發(fā)生PCD;（4）煙草的耐旱性越強(qiáng)，PCD發(fā)生較遲，發(fā)生程度也越弱。綜上所述，干旱脅迫下煙草不同部位細(xì)胞發(fā)生PCD的時(shí)間和特征是有差異的，耐旱性不同的品種發(fā)生PCD的時(shí)間也是有差異的。

關(guān)鍵詞：煙草;干旱脅迫;細(xì)胞程序化死亡

Abstract： To understand the effects of drought stress on programmed cell death in different parts of tobacco plants， using Zhongyan 100 （not drought-tolerant） and Nongda 202 （drought-tolerant） as materials， 2.5% PEG-6000 was used to simulate drought stress in analyzing phenotypic difference between plants with different drought tolerance. DNA Ladder method and TUNEL method were used to determine the time and degree of programmed cell death in different parts of tobacco plants. The results showed that： （1） Under drought stress， the biomass， root length and root diameter of Nongda202 and Zhongyan100 decreased compared with the control. The decrease range of Zhongyan100 was larger and the difference with the control was extremely significant. （2） On the third day of drought treatment， PCD had occurred in all parts of Zhongyan 100 plants， but the response of different parts to drought stress was different. The degree of PCD in leaves and lateral roots was similar， and the degree of PCD in root tip cells was significantly higher than that in leaves and lateral roots. （3） According to the localization observation， cells of the lateral root cortex and cells far away from the veins developed PCD earlier. （4） Tobacco plants with higher drought tolerance showed later occurrence of PCD and weaker degree of occurrence. In summary， the time and characteristics of PCD in cells of different parts of tobacco plants under drought stress are different， and the time of PCD in plants with different drought tolerance is also different.

Keywords： tobacco; drought stress; programmed cell death

干旱對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成巨大威脅，有研究表明其對(duì)作物造成的減產(chǎn)量可超過(guò)其他自然逆境減產(chǎn)量之和[1]，并且干旱在我國(guó)各個(gè)煙草種植大省中普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響了我國(guó)煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)。研究干旱脅迫對(duì)煙草不同部位細(xì)胞程序化死亡（PCD）的影響，對(duì)于了解細(xì)胞程序化死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)而探究植物對(duì)干旱逆境的響應(yīng)具有重要意義。

細(xì)胞的死亡在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都普遍存在。一般把細(xì)胞的死亡分為2種類型：壞死（necrosis）和細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）[2]。壞死（necrosis）是一種被動(dòng)的非正常死亡方式，指受到來(lái)自外界環(huán)境的強(qiáng)烈刺激，從而造成細(xì)胞膜通透性增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核染色質(zhì)不規(guī)則移位，進(jìn)而產(chǎn)生線粒體及核腫脹，溶酶體破壞，細(xì)胞膜破裂，胞漿外溢等現(xiàn)象[3]。細(xì)胞程序化死亡（PCD）是細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中或在某些環(huán)境因素作用下發(fā)生的，受基因調(diào)控的、主動(dòng)的、有序的死亡方式[4]。檢測(cè)細(xì)胞發(fā)生PCD的方式有很多。如細(xì)胞外形褶皺，細(xì)胞核變小，核形態(tài)發(fā)生改變呈新月?tīng)頪5]等形態(tài)特征可以作為判斷細(xì)胞發(fā)生PCD的依據(jù)。植物細(xì)胞發(fā)生PCD時(shí)，鈣-鎂依賴的核酸內(nèi)切酶可切割細(xì)胞核DNA在核小體間斷裂形成具有180～200 bp及其倍數(shù)的DNA片段，從而在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)特殊的DNA Ladder條帶[6]。此外，通過(guò)TUNEL（熒光）的方法，經(jīng)熒光素標(biāo)記后的發(fā)生PCD的細(xì)胞，細(xì)胞核在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，而正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞因DNA斷裂很少，幾乎沒(méi)有熒光[7]。

PCD在植物體中起著十分重要的作用，植物從胚胎發(fā)育到器官的形成都伴隨PCD現(xiàn)象的發(fā)生[8]。已有研究表明，病原物侵染[9]、干旱脅迫[10]、澇害[11]和重金屬脅迫[12]等都會(huì)引起植物的PCD反應(yīng)，植物通過(guò)這種反應(yīng)來(lái)減輕逆境對(duì)植物體的傷害，增強(qiáng)對(duì)植物的適應(yīng)性，提高生存能力。脅迫與PCD的發(fā)生密切相關(guān)，持續(xù)的脅迫會(huì)使烤煙葉肉細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)、多酚物質(zhì)含量及PAL和PPO活性發(fā)生重大變化，進(jìn)而影響煙株的生長(zhǎng)[13-14]。目前大多數(shù)研究都集中在對(duì)細(xì)胞程序化死亡的相關(guān)基因功能鑒定、特征產(chǎn)物分析、形態(tài)學(xué)、生理生化特征的描述等，而對(duì)于植物不同部位細(xì)胞的PCD反應(yīng)程度以及反應(yīng)時(shí)間差異的研究較少。因此，本研究以抗旱性不同的兩個(gè)煙草品種為材料，采用水培試驗(yàn)?zāi)M干旱，檢測(cè)不同時(shí)間下煙草不同部位的PCD的特征，以探討不同部位PCD響應(yīng)之間的差異，為煙草逆境生長(zhǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

煙草品種中煙100及農(nóng)大202由國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)煙草種質(zhì)資源子平臺(tái)（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所）提供。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[15-16]，對(duì)5個(gè)烤煙品種苗期水分脅迫下各種生理指標(biāo)和光合特性變化進(jìn)行測(cè)定，按抗旱能力差異分類后將中煙100定義為不耐旱品種，而將農(nóng)大202定義為耐旱品種。

1.2 ?研究地點(diǎn)與方法

1.2.1 ?試驗(yàn)地點(diǎn) ?中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨試驗(yàn)基地。

1.2.2 ?試驗(yàn)處理 ?將中煙100及農(nóng)大202的種子消毒后播種到基質(zhì)（泥炭和蛭石比例為1∶1）中。4葉1心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗，移栽于含1/4 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（pH 5.5）的周轉(zhuǎn)箱（7 L）水培處理，每個(gè)周轉(zhuǎn)箱里面培養(yǎng)10株煙苗，緩苗3 d后開(kāi)始處理：對(duì)照處理和2.5% PEG-6000處理（滲透勢(shì)約為–0.08 Mpa，相當(dāng)于中度干旱）[15]。

1.2.3 ?取樣方法與測(cè)定項(xiàng)目 ?干旱脅迫第9天，兩個(gè)品種的表型已經(jīng)具有明顯差異，即采收試驗(yàn)材料并測(cè)定生物量及根系形態(tài)。對(duì)中煙100和農(nóng)大202脅迫處理后第0、3、6、9天葉片、側(cè)根以及根尖進(jìn)行DNA Ladder檢測(cè)。對(duì)中煙100脅迫處理后第0、3、6、9天，農(nóng)大202處理后第9天的葉片、側(cè)根以及根尖進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，分析各部位的PCD特征隨干旱脅迫時(shí)間變化規(guī)律及兩種耐旱性品種間的差異。

生物量測(cè)定：采樣分地上部和根系，于105 ℃烘箱中烘24 h至恒質(zhì)量后稱量。

總根長(zhǎng)、根系總體積和根系平均直徑的測(cè)定：根系形態(tài)參數(shù)采用LA1600+根系掃描儀成像。測(cè)定總根長(zhǎng)，根系總體積和根系平均直徑。

DNA Ladder檢測(cè)：檢測(cè)參照衛(wèi)星[17]的方法。

TUNEL（熒光）檢測(cè)：參照寧順斌等[18]的方法，略有改動(dòng)，用DAPI染液替代PI染液，藍(lán)光激發(fā)波長(zhǎng)330～380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm，綠色熒光激發(fā)光波長(zhǎng)465～495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～555 nm。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?干旱脅迫對(duì)耐旱性不同的煙草品種苗期生長(zhǎng)的影響

2.1.1 ?生物量 ?如表1所示，脅迫第9天，兩個(gè)煙草品種的生長(zhǎng)有明顯差異。與對(duì)照相比，農(nóng)大202地上部的生物量下降9.6%，無(wú)顯著差異，而根系生物量下降12.9%，差異達(dá)到顯著水平;而中煙100的地上部的生物量和根系生物量分別下降71.4%和67.0%，差異均達(dá)到極顯著水平。

2.1.2 ?根系形態(tài) ?由表1可以看出，脅迫第9天，農(nóng)大202和中煙100的總根長(zhǎng)均較對(duì)照低，中煙100較對(duì)照低60.3%，差異達(dá)到極顯著水平，而農(nóng)大202低12.2%，差異未到達(dá)顯著水平。對(duì)于根系平均直徑來(lái)說(shuō)，中煙100較對(duì)照低16.6%，差異達(dá)到極顯著水平，而農(nóng)大202無(wú)顯著差異。與對(duì)照相比，中煙100和農(nóng)大202的根系體積均降低，農(nóng)大202降低16.9%，差異達(dá)顯著水平，而中煙100降低73.3%，差異達(dá)到極顯著水平。且在相同處理下，農(nóng)大202的根體積均高于中煙100。

2.2 ?干旱脅迫對(duì)煙草不同部位細(xì)胞程序化死亡的影響

2.2.1 ?DNA Ladder檢測(cè)結(jié)果 ?由圖1所示，在2.5%的PEG-6000處理前，中煙100以及農(nóng)大202煙草的葉片、側(cè)根以及根尖均未觀察到明顯的DNA片段化現(xiàn)象。隨著時(shí)間變化，脅迫第3～9天，中煙100的側(cè)根、根尖和葉片均出現(xiàn)了明顯的DNA片段，說(shuō)明干旱脅迫可誘導(dǎo)中煙100葉片、側(cè)根、根尖部位的PCD。但在相同處理?xiàng)l件下，農(nóng)大202煙草的葉片、側(cè)根以及根尖部位未觀察到明顯的DNA片段化現(xiàn)象。

2.2.2 ?TUNEL檢測(cè)結(jié)果 ?利用TUNEL（熒光）法對(duì)干旱脅迫處理的中煙100第0、3、6、9天以及農(nóng)大202第9天的葉片、側(cè)根和根尖進(jìn)行顯色及定位，結(jié)果如圖2-5所示，中煙100各部位在第0天未有明顯的綠色熒光，即各部位未發(fā)生PCD。在脅迫處理第3天，葉片、側(cè)根以及根尖均呈TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)，能觀察到明顯的綠色熒光，表明各部位均已經(jīng)發(fā)生PCD，而根尖的PCD程度最高，葉片、側(cè)根的PCD程度相近。脅迫處理第6天的檢測(cè)結(jié)果與第3天類似，而在第9天，各部位發(fā)生PCD的強(qiáng)度已經(jīng)沒(méi)有明顯的差別。

通過(guò)對(duì)材料進(jìn)行定位，可以觀察到，中煙100葉片在第3天和第6天，少量葉肉細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光現(xiàn)象，表明已開(kāi)始發(fā)生PCD。在第9天，PCD發(fā)生程度最高，而且遠(yuǎn)離葉脈的細(xì)胞發(fā)生明顯的PCD，靠近葉脈的細(xì)胞未發(fā)生明顯的PCD。就側(cè)根而言，側(cè)根皮層細(xì)胞先發(fā)生PCD，最后逐漸向內(nèi)部擴(kuò)展，處理第9天，側(cè)根內(nèi)皮層、中柱鞘等細(xì)胞也開(kāi)始出現(xiàn)明顯的綠色熒光，并且可以看出細(xì)胞核變小等明顯的PCD特征。而根尖細(xì)胞在脅迫處理第3天，已經(jīng)發(fā)生明顯的PCD。第6天時(shí)已經(jīng)能觀察到細(xì)胞外形皺折等現(xiàn)象，整個(gè)根尖的PCD程度不斷加深。

由圖6可知，農(nóng)大202在處理9天后，葉片和側(cè)根的皮層及內(nèi)皮層中可以觀察到輕度的綠色熒光，表明該部位有少量細(xì)胞發(fā)生了PCD。其根尖細(xì)胞能觀察到明顯的綠色熒光，并有細(xì)胞外形皺折等明顯的PCD特征，表明根尖發(fā)生PCD程度較深。

3 ?討 ?論

根系是植物吸收水分的主要器官，對(duì)外界脅迫十分敏感，感知干旱脅迫后，根系形態(tài)特征會(huì)發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性變化，不同抗旱能力的植物會(huì)表現(xiàn)出不同的特征[19]?？偢L(zhǎng)可以反映根系的數(shù)量變化，而根體積是體現(xiàn)植物根系空間分布的指標(biāo)之一[20]。有研究證明，干旱脅迫可以降低冬小麥幼苗的總根數(shù)、根系總長(zhǎng)、根系體積和根系干質(zhì)量，限制根系的生長(zhǎng)[21]。本研究結(jié)果表明，不耐旱煙草品種中煙100在干旱脅迫處理后，總根長(zhǎng)、根系平均直徑、根系體積下降幅度大，最終影響地上部生長(zhǎng);而耐旱品種農(nóng)大202在脅迫條件下，總根長(zhǎng)和根系平均直徑變化不明顯，根系總體積下降幅度較低，能維持與對(duì)照處理相當(dāng)?shù)牡厣喜可锪俊?/p>

細(xì)胞發(fā)生PCD是抵御干旱的一種結(jié)果，是植物應(yīng)對(duì)逆境的一種響應(yīng)[22]。植物在干旱脅迫初期，基因會(huì)調(diào)控一部分細(xì)胞發(fā)生PCD，隨著逆境時(shí)間的增長(zhǎng)，植物細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而影響表型變化。植物細(xì)胞發(fā)生PCD后引起的生理和代謝變化有很多，干旱脅迫與PCD的發(fā)生有密切的聯(lián)系。有學(xué)者[10]通過(guò)研究半夏倒苗現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)干旱處理2 d細(xì)胞就開(kāi)始發(fā)生PCD，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，半夏莖的葉綠素含量及水勢(shì)不斷下降，相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖和MDA的含量則不斷升高，進(jìn)而誘導(dǎo)半夏倒苗。另外，根據(jù)胡慶輝[23]的研究，干旱脅迫下，SOD、CAT活性均呈先上升再下降的趨勢(shì)，POD活性和丙二醛含量逐漸增加，在干旱脅迫初期，保護(hù)酶SOD、POD和CAT活性升高，能及時(shí)清除過(guò)量的ROS，使脅迫的傷害保持在可控范圍內(nèi)。但是隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，體內(nèi)活性氧過(guò)多累積，超出保護(hù)性酶的清除能力，氧化平衡遭破壞，CAT、SOD活性均出現(xiàn)下降，特別是CAT活性降幅較大，膜脂過(guò)氧化損傷嚴(yán)重，膜系統(tǒng)受到損傷，使H2O2等凋亡誘導(dǎo)因子大量積累，促使葉肉細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生。

只有當(dāng)存在一定比例的凋亡細(xì)胞的時(shí)候，才能檢測(cè)到“DNA Ladder”，但是一般情況下可將“DNA Ladder”的形成認(rèn)為是判斷凋亡發(fā)生的一個(gè)重要而且典型的指標(biāo)[24]。而TUNEL法是一種靈敏度較高的植物PCD檢測(cè)方法[25]，不僅特異性強(qiáng)，靈敏度高，還可以對(duì)PCD細(xì)胞進(jìn)行定性與定量分析，甚至能檢出早期未發(fā)生典型變化的PCD細(xì)胞[26]。所以本研究綜合這兩種PCD檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

從本研究結(jié)果來(lái)看，煙草不同部位對(duì)干旱脅迫誘導(dǎo)的PCD的感知與響應(yīng)并不同步。通過(guò)對(duì)不同處理時(shí)間的中煙100各部位中進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)脅迫處理第3天，根尖PCD的響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于其他兩個(gè)部位。衛(wèi)星[17]檢測(cè)了水曲柳不同級(jí)側(cè)根的根皮層薄壁細(xì)胞和根尖細(xì)胞的PCD特征，發(fā)現(xiàn)不同級(jí)側(cè)根的PCD特征是有差異的，這也從側(cè)面反映出了植物干旱脅迫時(shí)不同部位所發(fā)生PCD的響應(yīng)是不同的。從DNA Ladder的結(jié)果來(lái)看，在脅迫處理3天，側(cè)根、葉片和根尖均已出現(xiàn)明顯的DNA條帶，表明中煙100第3天已開(kāi)始出現(xiàn)PCD，從TUNEL法的檢測(cè)結(jié)果也印證了此結(jié)果。

另外，通過(guò)對(duì)材料進(jìn)行TUNEL（熒光）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不耐旱性品種中煙100不同部位發(fā)生PCD的細(xì)胞是有規(guī)律的。干旱脅迫處理后，遠(yuǎn)離葉脈的細(xì)胞先發(fā)生PCD，而葉脈附近細(xì)胞的PCD現(xiàn)象不明顯。就側(cè)根而言，側(cè)根皮層細(xì)胞更容易誘導(dǎo)成PCD，最后逐漸向內(nèi)部擴(kuò)展。對(duì)煙草葉片的PCD檢測(cè)結(jié)果與CAO[27]等的報(bào)道相一致，其中的原因可能是正常的葉脈有利于細(xì)胞死亡后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)出，這可能是植物體的一種自我保護(hù)機(jī)制。SCHIEFIELBEIN[28]發(fā)現(xiàn)，為保護(hù)根尖生長(zhǎng)，根冠細(xì)胞和皮層細(xì)胞可能接受某些“信號(hào)”來(lái)誘導(dǎo)PCD的發(fā)生。這與本研究中觀察到的干旱脅迫早期，側(cè)根皮層細(xì)胞先發(fā)生PCD的結(jié)果相一致，其他學(xué)者[29]也有類似發(fā)現(xiàn)。本研究觀察到了根尖細(xì)胞在干旱脅迫后細(xì)胞外形皺折等現(xiàn)象，這與MATSUMOTO[30]描述的根尖細(xì)胞在脅迫后發(fā)生PCD的特征相同。ZHAN[31]發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下花生根尖分生組織區(qū)附近細(xì)胞更易誘發(fā)PCD，這與本研究中所觀察到的結(jié)果相一致，這可能是因?yàn)樵诓煌{迫下，植物具有相同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)誘導(dǎo)PCD。從不同部位呈現(xiàn)的細(xì)胞程序化死亡特征的發(fā)生程度來(lái)看，控制這些細(xì)胞的死亡程序也應(yīng)是不同的，很有可能是因?yàn)槊{迫下不同部位信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不同。

在脅迫處理第9天，農(nóng)大202各部位的DNA Ladder檢測(cè)結(jié)果與TUNEL檢測(cè)結(jié)果相矛盾，這是因?yàn)镈NA條帶的形成需要較多發(fā)生PCD的細(xì)胞，而TUNEL法靈敏度較高。而中煙100在水分脅迫處理后形成明顯的DNA片段，各部位TUNEL熒光強(qiáng)度很高，可以看出耐旱性越弱，其PCD響應(yīng)較快，并且響應(yīng)強(qiáng)度較高。此外，脅迫第9天，農(nóng)大202的根尖也有明顯的綠色熒光現(xiàn)象，而側(cè)根和葉片未能看到綠色熒光，這也從側(cè)面反映出根尖在干旱脅迫下響應(yīng)較快。

4 ?結(jié) ?論

（1）在干旱脅迫早期，相對(duì)于不耐旱品種，耐旱品種總根長(zhǎng)和根系平均直徑下降不明顯，發(fā)生PCD較遲，側(cè)根、根尖和葉片PCD程度也較低。耐旱煙草品種在應(yīng)對(duì)逆境時(shí)，PCD響應(yīng)較慢的原因需要更深入的研究。

（2）根尖細(xì)胞PCD發(fā)生程度強(qiáng)于側(cè)根與葉片，而隨處理時(shí)間增長(zhǎng)各部位PCD的發(fā)生程度已無(wú)明顯差別。就不同部位的細(xì)胞而言，側(cè)根皮層細(xì)胞以及遠(yuǎn)離葉脈的細(xì)胞發(fā)生PCD的時(shí)間較早。煙草不同部位細(xì)胞是如何感知并迅速產(chǎn)生信號(hào)物質(zhì)向上傳遞來(lái)影響細(xì)胞發(fā)生PCD的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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