趙愛華 康萬里 王國治 高正倫 都偉欣 盧錦標(biāo) 沈小兵 蘇城 徐苗 鄭素華

重組結(jié)核分枝桿菌11 kDa(相對分子質(zhì)量為11 000)蛋白(簡稱“重組11 kDa蛋白”)是選擇卡介苗特異性丟失并與結(jié)核毒力相關(guān)的ESAT-6基因，經(jīng)大腸埃希菌表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌特異性的重組蛋白[1]。臨床前研究證實(shí)，該變態(tài)反應(yīng)原可有效鑒別結(jié)核分枝桿菌感染與卡介苗接種，以及龜-膿腫分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌感染，甚至可以鑒別結(jié)核分枝桿菌活菌感染和滅活結(jié)核分枝桿菌致敏的豚鼠，具有良好的安全性[2-3]。臨床研究顯示，重組11 kDa 蛋白安全性好，并與γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)檢測結(jié)果一致性良好[4-8]。將其作為新型結(jié)核變態(tài)反應(yīng)原，結(jié)合皮膚試驗(yàn)，有可能成為一種簡單便捷、特異性高的潛伏性結(jié)核感染篩查的體內(nèi)診斷試劑。本研究擬對重組11 kDa蛋白進(jìn)行兩方面評價，一是作為潛伏性結(jié)核感染篩查診斷試劑進(jìn)行評價，二是作為潛伏性結(jié)核感染與卡介苗接種鑒別診斷試劑進(jìn)行評價。在評價重組11 kDa蛋白時，同時進(jìn)行IGRA與結(jié)核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)皮膚試驗(yàn)的平行試驗(yàn)，比較其與兩種方法檢測結(jié)果的一致性，為臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

資料和方法

一、研究對象

由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院聯(lián)合北京市昌平區(qū)結(jié)核病防治所、北京市懷柔區(qū)結(jié)核病防治所和北京市大興區(qū)結(jié)核病防治所，在以上3個區(qū)的高校和工廠招募健康志愿者，招募時間為2014年7月至2016年3月。

納入條件：年滿18周歲，簽署知情同意書，身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前曾與肺結(jié)核患者，特別是排菌患者密切接觸；(2)患有各種重要臟器疾病、糖尿病、自身免疫疾病、器官移植術(shù)后、接受免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑治療、長期服用激素；(3)確定為人類免疫缺陷病毒感染或相關(guān)疾?。?4)患急性傳染病(如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎)、急性眼結(jié)膜炎、急性中耳炎、癲癇或精神疾病者；(5)肺內(nèi)、外結(jié)核病，呼吸道癥狀不適者；(6)正在參加其他臨床試驗(yàn)者，或在臨床試驗(yàn)前3個月參加過其他任何臨床試驗(yàn)者；(7)妊娠或哺乳期婦女；(8)過敏體質(zhì)者，如對2種以上藥品或食物有過敏史者，或?qū)Ρ驹噭┙M分有過敏者；(9)懷疑或確有藥品濫用、酗酒史；(10)知情退出者。經(jīng)過測量身高，以及進(jìn)行體質(zhì)量、脈搏、血壓、胸部X線攝影(簡稱“胸片”)、血常規(guī)、血生化(肝功能和腎功能)、尿常規(guī)檢查，各項指標(biāo)正常者入組，總計納入3001名。其中，男1611名，女1390；年齡18～65歲，中位年齡29歲。3001名志愿者中，記錄了2379名志愿者的卡痕信息，其中922例存在卡痕。

本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號為2013-16。

二、試劑

重組11 kDa蛋白、TB-PPD、皮內(nèi)注射用卡介苗和安慰劑由北京祥瑞生物制品有限公司提供。市售γ干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)試劑盒購自英國Oxford Immunotec有限公司。

三、研究方法

1. 皮膚試驗(yàn)：皮膚試驗(yàn)采用同體雙臂分別對受試者進(jìn)行重組11 kDa蛋白和TB-PPD皮膚試驗(yàn)。于受試者右側(cè)手臂掌側(cè)前1/3處皮內(nèi)注射0.1 ml 重組11 kDa蛋白(10 μg/ml)，同時于左側(cè)手臂相同位置注射0.1 ml TB-PPD(50 U/ml)，注射方法嚴(yán)格遵守《結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)使用指導(dǎo)手冊》[9]。分別于注射后24、48、72 h測量重組11 kDa蛋白及TB-PPD皮膚反應(yīng)的硬結(jié)和紅暈[記錄平均直徑，平均直徑=(最大橫徑+最大縱徑)/2]。試驗(yàn)結(jié)果以72 h為準(zhǔn)[9]，同時記錄局部水皰、壞死、淋巴管炎等情況。重組11 kDa蛋白皮膚試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：紅暈及硬結(jié)平均直徑≥5 mm為陽性；以及無論平均直徑大小，只要局部出現(xiàn)水皰、雙圈、壞死或淋巴結(jié)炎也為陽性；紅暈及硬結(jié)平均直徑<5 mm為陰性。TB-PPD皮膚試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)與上述判定方法相同。

2. IGRA：采用結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)試劑盒進(jìn)行檢測。所有試驗(yàn)對象在皮膚試驗(yàn)前均采集外周抗凝靜脈血不少于10 ml，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液制備外周血單個核細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞1.0×106個。按試劑盒操作說明加入刺激原。判定標(biāo)準(zhǔn)：空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個時，用測定孔A和(或)測定孔B斑點(diǎn)數(shù)減去空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)后結(jié)果≥6個；或空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個時，測定孔A和(或)測定孔B斑點(diǎn)數(shù)≥2倍的空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)，則判定為陽性。相反為陰性。

3. 卡介苗接種鑒別：在3001名志愿者中，3種檢測結(jié)果均為陰性的475名知情同意受試者，采用數(shù)字表法按隨機(jī)雙盲的原則，以2∶1的比例接種卡介苗和安慰劑，受試者首先進(jìn)行生命體征的測量(主要包括體溫、心率和血壓)，正常受試者接受疫苗/安慰劑接種后在現(xiàn)場觀察30 min，無異常反應(yīng)方可離開。接種安慰劑或卡介苗3個月(12周)后再次進(jìn)行平行對照試驗(yàn)。試驗(yàn)開始前再次對志愿者進(jìn)行脈搏、血壓、體溫、血常規(guī)、肝功能、腎功能、尿常規(guī)等檢查，然后進(jìn)行重組11 kDa蛋白和TB-PPD的同體雙臂皮試試驗(yàn)和IGRA檢測。分別于注射變態(tài)反應(yīng)原后24、48、72 h觀察皮膚試驗(yàn)局部反應(yīng)和全身反應(yīng)，并采用米尺測量皮膚硬結(jié)的橫徑和縱徑，計算每日硬結(jié)平均直徑。記錄所有的反應(yīng)，以72 h結(jié)果進(jìn)行判定。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Excel 2007軟件建立數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計分析采用SAS 8.2和Stata 14.0軟件。計數(shù)資料的統(tǒng)計描述以“百分率(%)”表示，組間陽性率的比較采用配對χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組間一致性的評價采用“一致率(%)”和“一階一致性系數(shù)(the first-order agreement coefficient，AC1)”。AC1值是評價校正機(jī)會一致性因素后的一致性程度，其應(yīng)用受結(jié)局分布情況影響程度較小，是評價診斷試驗(yàn)結(jié)局一致性更為穩(wěn)定的指標(biāo)；AC1值越大表示一致性程度越高，AC1值≥0.75表示一致性好[10-11]。一致率和AC1值的計算方法為：一致率(%)=兩種方法判定結(jié)果相同的例數(shù)/總例數(shù)×100%；AC1值=(觀察一致性-機(jī)會一致性)/(1-機(jī)會一致性)。

結(jié) 果

一、健康志愿者潛伏性結(jié)核感染篩查結(jié)果

3001名志愿者中，選用重組11 kDa 蛋白作為潛伏性結(jié)核感染篩查試劑，檢測陽性率為32.2%(966/3001)；體外IGRA檢測陽性率為34.4%(1033/3001)；TB-PPD檢測陽性率為47.7%(1430/3001)。IGRA檢測陽性率與重組11 kDa蛋白相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.787，P<0.001)；IGRA與重組11 kDa蛋白檢測一致率為93.4%(2804/3001)，AC1值為0.882(95%CI=0.866～0.898)，兩者具有較好的一致性。TB-PPD檢測陽性率高于重組11 kDa蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=182.146，P<0.001)；TB-PPD與重組11 kDa 蛋白檢測一致率為60.6%(1819/3001)，AC1值為0.243(95%CI=0.207～0.279)，兩者的一致性較差。

二、卡介苗接種鑒別結(jié)果

475名3種檢測方法均為陰性的志愿者中，326名參加了卡介苗接種鑒別評價，其中失訪8名，318名志愿者接種3個月(12周)后再次進(jìn)行平行對照試驗(yàn)；149名接種安慰劑，其中失訪2名，147名志愿者接種3個月(12周)后再次進(jìn)行平行對照試驗(yàn)。共計465名完成評價。

接種卡介苗的志愿者中，重組11 kDa蛋白作為潛伏性結(jié)核感染檢測試劑，檢測的陽性率為1.3%(4/318)；IGRA檢測的陽性率為3.1%(10/318)；TB-PPD檢測的陽性率為56.3%(179/318)。重組11 kDa蛋白檢測陽性率與IGRA相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.571，P=0.109)；一致率為95.6%(304/318)，AC1值為0.954(95%CI=0.929～0.979)，兩者具有較好的一致性。TB-PPD檢測的陽性率高于重組11 kDa蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=167.350，P<0.001)。重組11 kDa蛋白與TB-PPD一致率為42.5%(135/318)，AC1值為0.025(95%CI=-0.106～0.155)，兩者的一致性較差。

接種安慰劑的志愿者中，重組11 kDa 蛋白作為潛伏性結(jié)核感染篩查試劑，檢測的陽性率為4.1%(6/147)；IGRA檢測的陽性率為1.4%(2/147)；TB-PPD檢測的陽性率為17.7%(26/147)。重組11 kDa蛋白與IGRA陽性率的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.667，P=0.109)；重組11 kDa蛋白與IGRA的一致率為95.9%(141/147)，AC1值為0.957(95%CI=0.921～0.993)，兩者具有較好的一致性。TB-PPD檢測的陽性率高于重組11 kDa蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.385，P<0.001)；重組11 kDa蛋白與TB-PPD的一致率為82.3%(121/147)，AC1值為0.781(95%CI=0.690～0.871)，兩者具有較好的一致性。

討 論

潛伏性結(jié)核感染是指宿主感染結(jié)核分枝桿菌后對結(jié)核分枝桿菌抗原存在持續(xù)的免疫應(yīng)答，但無臨床活動性結(jié)核病證據(jù)的一種特殊狀態(tài)[12]。潛伏性結(jié)核感染者約有5%～10%的概率會發(fā)展為活動性結(jié)核病[13]，為了更好地抑制結(jié)核病，控制傳染源，對潛伏性結(jié)核感染的篩查十分必要。

結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)曾一度作為潛伏性結(jié)核感染的篩查方法，并據(jù)此估計了世界1/3的人口為潛伏性結(jié)核感染者[14]。但由于TB-PPD所含抗原成分復(fù)雜，與卡介苗及部分環(huán)境分枝桿菌存在交叉抗原，并不能有效區(qū)分卡介苗接種和結(jié)核感染，因此，在診斷潛伏性結(jié)核感染方面特異性較差。IGRA是近年發(fā)展起來的新型體外診斷方法，敏感度和特異度均較高，不受卡介苗接種及絕大部分非結(jié)核分枝桿菌的影響。但I(xiàn)GRA對實(shí)驗(yàn)技術(shù)和條件要求較高，且價格昂貴，難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測，WHO等國際組織并不推薦將IGRA作為中低收入國家潛伏性結(jié)核感染的篩查手段[15]。我國作為普遍接種卡介苗的國家，也是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，潛伏性結(jié)核感染人數(shù)巨大，需要簡便、特異和高通量的新型診斷方法。

為解決這一問題，選擇結(jié)核分枝桿菌中存在而卡介苗中丟失的ESAT-6基因，構(gòu)建重組11 kDa蛋白，采用皮膚試驗(yàn)方法，根據(jù)已感染結(jié)核分枝桿菌個體體內(nèi)存在致敏的T淋巴細(xì)胞，再次接觸結(jié)核分枝桿菌或微量的結(jié)核分枝桿菌特異蛋白時，會產(chǎn)生遲發(fā)型細(xì)胞過敏反應(yīng)，即Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的原理，通過變態(tài)反應(yīng)情況診斷機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌。

本研究將重組11 kDa蛋白用于健康人群潛伏性結(jié)核感染篩查的結(jié)果可見，其檢測陽性率與IGRA有較好的一致性。而與TB-PPD陽性率的一致性較差。而本研究中健康人群中至少有1/3已存在卡介苗接種過的卡痕，進(jìn)一步說明了TB-PPD特異度差的缺陷。

將重組11 kDa蛋白用于卡介苗接種者中，其陽性率與IGRA結(jié)果基本一致；而與TB-PPD陽性率一致性較差。而在安慰劑接種人群中，重組11 kDa蛋白檢測結(jié)果與IGRA結(jié)果及TB-PPD結(jié)果的一致性均較好。由于TB-PPD既能用于結(jié)核病的臨床診斷，又能用于卡介苗接種后機(jī)體免疫反應(yīng)的監(jiān)測，在該研究中，卡介苗接種后的人群在疫苗接種3個月后使用TB-PPD進(jìn)行結(jié)核感染的篩查，則大部分皮膚試驗(yàn)陽性人群應(yīng)為卡介苗接種后的陽性反應(yīng)，而非感染結(jié)核的陽性反應(yīng)，該結(jié)果也同時說明PPD無法區(qū)分卡介苗接種與結(jié)核感染，進(jìn)一步證明了TB-PPD用于結(jié)核感染檢測特異度差。

綜上所述，本研究證實(shí)了重組11 kDa蛋白能鑒別卡介苗接種與結(jié)核感染，能克服PPD特異度差的缺陷。檢測結(jié)果與IGRA有較好的一致性，同時又避免了IGRA的操作繁瑣、難以實(shí)現(xiàn)高通量和試劑價格昂貴的問題。重組11 kDa蛋白在操作方法上有PPD 的方便性，在檢測結(jié)果上有IGRA的特異性，結(jié)合了兩種試劑的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過大規(guī)模的臨床評價，將為潛伏性結(jié)核感染篩查提供一種準(zhǔn)確、簡便的候選篩查試劑。