干細胞誘導分化和體細胞重編程過程中涉及大量的基因轉錄激活和沉默，以及表觀遺傳學調控。表觀遺傳調控包括DNA甲基化和組蛋白修飾等多種調控形式，是消除舊的細胞表型，建立新的基因表達模式的重要機制，在干細胞分化過程中受到嚴格的時間和空間調控。組蛋白乙?；揎検潜碛^遺傳調控的主要機制之一，組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）共同維持其動態(tài)平衡，主要發(fā)生在組蛋白H3、H4 N 端較為保守的賴氨酸位點。在干細胞分化過程中，許多基因啟動子和增強子上常同時發(fā)生H3K9和H3K14位點的乙酰化，染色質較為開放，基因轉錄活躍[1]。小分子化合物組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi）對干細胞的藥物干預，可以調節(jié)其乙?；揎椝剑行в绊懜杉毎只\，有助于建立特定細胞的誘導。

一、HDAC 家族和HDACi

真核細胞HDAC 目前已知有18種亞型，基于序列同源性可將其分為4類[2]：I類（HDAC 1，2，3，8）、Ⅱ類（IIa：HDAC 4，5，7，9，IIb：6，10）、Ⅲ類（SIRT 1-7）和Ⅳ類（HDAC 11）。除修飾組蛋白外，HDAC（尤其HDAC2）也可靶向其他非組蛋白底物來調控蛋白活性，影響一系列生物學進程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC 活性對于胚胎發(fā)育是必需的，不同的HDAC 分子有不同的生物學作用，參與不同組織器官的發(fā)育。敲除HDAC1 后的小鼠胚胎發(fā)育缺陷，于胚胎9.5 d 時死亡，HDAC2的完全敲除也將導致小鼠圍產期死亡[4]。

HDACi是靶向抑制HDAC的小分子化合物，根據結構的差異可歸為5類：Ⅰ異羥肟酸類（曲古抑素A、SAHA 等）、Ⅱ短鏈脂肪酸類（丙戊酸、丁酸鈉等）、Ⅲ苯甲酰胺類（MS-275等）、Ⅳ環(huán)肽類（FK228 等）和Ⅴ SIRT類抑制劑[5]。其中異羥肟酸類靶向Zn2+，可作用于所有Ⅰ類和Ⅱ類HDAC，屬非特異性HDACi；苯甲酰胺類、環(huán)肽類則對Ⅰ類HDAC的抑制活性較高，而Ⅱ類HDAC 選擇性抑制劑結構多樣，以選擇性HDAC6 抑制劑研究居多，如tubacin。

二、HDACi 在胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）自我更新維持中的應用

ESC是從胚泡內細胞團中分離培養(yǎng)的一類細胞，具有無限自我更新和多能性的特征，可誘導分化為內胚層、中胚層和外胚層來源的所有細胞。其多能性狀態(tài)的維持主要依賴于核心轉錄因子Oct4、Sox2和Nanog 以及信號通路LIF、Wnt和BMP4 構成的復雜調控網絡[6]。ESC 染色質較開放，組蛋白修飾豐富，對表觀遺傳變化敏感[7]。

多項研究表明ESC 對HDACi的反應具有劑量依賴和階段性的特點。在ESC 早期分化中，高劑量曲古抑素A（50 nmol/L）可上調BrachyuryT、Gata4和肌細胞增強因子2c 等中胚層標記基因的表達，同時伴隨多能性相關基因Sall4、Nanog、Klf4、Oct4和Sox2的表達下調，促進小鼠CGR8ESC 向中胚層譜系定向分化[8]。而在低劑量丁酸鈉（0.2～0.3 mmol/L）處理的人ESC 系H1 中，誘導中、內胚層分化的經典Wnt信號分子被抑制，包括Wnt3、Tcf3和Frzb等；維持ESC 干性的轉化生長因子-β 信號通路則被誘導激活，Nanog 水平也略有升高[9]?？傊?，低劑量的HDACi 支持ESC自我更新并發(fā)揮抗分化效應。在用丙戊酸和曲古抑素A 處理小鼠畸胎瘤細胞系F9和P19 時觀察到類似的階段性效應：分化程度較低的F9 細胞中多能性因子成纖維細胞生長因子4、Esrrb、Gdf3、Zic3、Klf2、Nr0b1和Rex1的表達降低，而在分化程度較高的P19 細胞中這些多能性因子則被丙戊酸和曲古抑素A 上調，表明HDACi 對ESC的影響取決于藥物劑量、細胞類型以及細胞所處的分化階段[10]。

三、HDACi 在干細胞定向分化中的應用

干細胞分化過程中細胞命運的決定由多能性基因和特定譜系分化基因共同協(xié)調，組蛋白乙?；揎検怯绊懠毎只癄顟B(tài)的重要機制，利用HDACi 在體外單獨或配合其他誘導劑處理干細胞，可修改細胞分化傾向，調控ESC 或成體干細胞向神經、心肌和造血等譜系的定向分化。

（一）成骨分化

在干細胞分化過程中，轉錄調控區(qū)域的乙酰化減少常導致基因表達的抑制，有研究表明，尼古丁對Sox9啟動子區(qū)域H3K9和H3K14位點乙?；囊种茣档蚐ox9的表達，抑制骨髓間充質干細胞的軟骨分化[11]。HDAC1和HDAC2是成骨分化的負性調控因子，在成骨分化過程中表達降低[12]。曲古抑素A、伏立諾他和MC1924（HDAC1 特異性抑制劑）等HDACi 可通過抑制HDAC1 活性，提高成骨分化重要的轉錄因子Runx2基因啟動子乙?；剑訠MP 信號通路依賴的方式促進大鼠脂肪干細胞向成骨分化[13-15]。

（二）平滑肌分化

Ⅱ類HDAC分子在肌肉等組織細胞分化中發(fā)揮重要作用。血小板衍生生長因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）是干細胞平滑肌分化的關鍵調控因子，研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB 通過轉錄激活調控HDAC7的表達，而PDGF-BB 誘導ESC 表達平滑肌特異基因則依賴HDAC7的激活[16]。曲古抑素A 既可降低HDAC7 活性，同時還抑制 PI3K/Akt、JNK、MAPK和Notch 等信號通路，抑制平滑肌分化[17]。

（三）心肌分化

ESC心肌分化受多種因素影響，包括各種信號分子（Wnt、Notch、轉化生長因子-β）、細胞內轉錄因子和激素等。其中Wnt 通路是心肌定向分化的重要機制之一，具有階段特異性和劑量依賴性的特點：在ESC 早期協(xié)同BMP 促進中胚層分化，晚期Wnt 信號的激活則抑制心肌發(fā)生[18]。表觀遺傳調控在心肌分化過程中也發(fā)揮重要作用，抑制HDAC1 活性后心肌標記基因表達上調，Ⅱ類HDAC 分子尤其HDAC4 則與肌細胞增強因子2c和異染色質蛋白1 相互作用以抑制心肌分化[19]。曲古抑素A 作為HDAC 泛抑制劑，一方面可通過抑制HDAC1的活性影響ESC 命運的層級特化，另一方面可上調Nkx2-5、肌細胞增強因子2c和α-actinin的表達，同時提高心臟特異性轉錄因子Gata4的乙?；?，誘導ESC 向心肌細胞的定向分化[20-21]。

（四）肝臟、胰腺分化

肝臟、胰腺等胚胎內胚層來源器官，其分化過程與心肌分化類似，由轉化生長因子-β、Wnt、成纖維細胞生長因子信號與表觀遺傳修飾共同參與調控。研究表明，HDAC1 通過抑制Sox9b 促進斑馬魚肝臟前體細胞向肝臟細胞分化，斑馬魚中敲除HDAC1，側板中胚層中肝臟特化因子prt/Wnt2bb表達降低，造成肝臟形態(tài)發(fā)生缺陷[22-23]。胰腺分化調節(jié)受HDAC1 與成纖維細胞生長因子信號相互作用影響[24]。丙戊酸可上調肝細胞特異性miRNA的表達，誘導人臍帶間充質干細胞向肝臟分化[25]。此外，丁酸鈉可改變ESC的表觀遺傳狀態(tài)，影響胰腺、肝臟分化的關鍵基因表達。有研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L 丁酸鈉處理3 d 可誘導小鼠ESC 系E14的ESC 向胰腺分化，而3 mmol/L 丁酸鈉處理7 d 則誘導肝細胞特異基因的表達[26]。但是，具體機制目前還不清楚。

（五）神經分化

HDAC活性在大腦發(fā)育過程中必不可少。敲除HDAC1和HDAC2的小鼠因腦結構解體死亡；HDAC4，5，7，9 在神經分化進程中表達上調，表明HDAC是神經分化和發(fā)育的重要調節(jié)因子[27]。最近還有研究發(fā)現(xiàn)HDAC8 可通過控制P19細胞中的擬胚體形成來調節(jié)神經分化[28]。此外，許多神經系統(tǒng)疾病都存在不同程度的組蛋白乙酰化失調。因此HDACi可用于治療神經發(fā)生相關疾?。ㄈ缯J知功能減退）；亦或利用HDACi 實現(xiàn)體外誘導神經分化，通過在體移植來治療阿爾茲海默癥、帕金森病和腦卒中等神經系統(tǒng)疾病。

Qiao等[29]表明HDACi 對神經分化具有雙重效應，且與組蛋白H3K9的乙?；矫芮邢嚓P。ESC 體外培養(yǎng)0～4 d 階段，H3K9ac 逐漸降低，多能性基因Oct4和Nanog關閉；4～8 d 時H3K9ac 則呈上升趨勢，伴有神經發(fā)育基因Pax6、Sox1和Otx2的上調。因此，在ESC 神經分化的不同階段，利用HDACi（丙戊酸、曲古抑素A）上調H3K9ac 水平，在上胚層分化起始階段可維持ESC的自我更新，在神經命運決定階段則促進分化。

（六）造血分化

造血分化需要HDAC1和HDAC2的活化，尤其HDAC1的表達水平將影響造血祖細胞的分化程序，HDACi被廣泛應用于血液系統(tǒng)惡性疾病的治療[30]。有趣的是，HDACi 在正常造血中也有多效性的作用。Bug 等[31]表明造血干細胞對HDACi的反應與其分化水平有關：HDACi 下調早期造血干細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21cip-1/waf-1的表達，促進造血干細胞增殖；晚期階段則誘導分化。在紅系細胞發(fā)育過程中也存在類似階段性效應，F(xiàn)K228（0.5 ng/ml）在白介素-3的存在下可促進人CD34+細胞（早期紅系前體細胞）分化為CD36+GPA-不成熟紅細胞；而在促紅細胞生成素或SCF+促紅細胞生成素存在的情況下則抑制CD36+GPAhigh（晚期紅系前體細胞）的分化，并誘導其凋亡[32]。

HDACi誘導干細胞分化的研究不少，在許多分化體系中也提示階段性效應的存在，究其原因或與不同分化階段細胞基因表達的時空特異性相關，亦或與干細胞的類型有關?？傊?，HDACi 誘導干細胞分化的具體機制及其中涉及到的效應分子還有待深入研究。

四、HDACi在體細胞重編程中的作用

2006年，日本京都大學Shinya Yamanaka 實驗室通過過表達4種轉錄因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，建立了誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）[33]。研究者利用體細胞重編程獲得的患者特異性iPSC，既不存在免疫排斥，也避免了倫理學上的問題，為再生醫(yī)學領域提供了新的視野。但后續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)原癌基因c-Myc的表達會導致細胞死亡，因此研究人員試圖尋找更安全、避免致癌基因引入的誘導程序。

有研究認為Oct4、Sox2和丙戊酸（替代致癌因子c-Myc和Klf4）便足以完成重編程，微列陣分析顯示丙戊酸上調了Rex3和Zfp7等ESC 特異基因的表達，將iPSC集落數(shù)量提高了50倍，且得到的iPSC與ESC有類似的形態(tài)和多能性，同時此組合還可抑制重編程誘導的衰老[34-35]。

體細胞核移植（somatic cell nuclear transplantation，SCNT）是將體細胞核移入去核卵母細胞中，經過重編程后形成新的胚胎并繼續(xù)發(fā)育，由此技術獲得的動物又稱克隆動物。曲古抑素A是第一個應用于SCNT的HDACi，也是許多物種胚胎的克隆促進劑：（1）通過調控供體細胞G0/G1期相關miRNA的表達提高克隆產量和質量；（2）抑制外源基因表達同時上調多能性相關基因；（3）挽救SCNT 中的異常基因印跡，促進克隆胚胎的發(fā)育[36-38]。此外，LAQ824 可通過上調H3K9和H4K12、下調5-mC 來調節(jié)基因表達，豬胚胎經100 nm LAQ824 處理24 h 后，囊胚形成率明顯提高[39]；CBHA 可促進發(fā)育相關基因如Oct4、Cdx2和印跡基因如Igf2的表達，提高乙酰化水平，使胚胎更早進入囊胚期（5 d），但不能提高胚胎全程發(fā)育能力[40]。

證據表明，iPSC 早期的表觀遺傳的變化對多能性誘導至關重要，供體細胞表觀遺傳缺陷導致的基因表達異常是目前SCNT 效率較低的主要原因[1,41-42]。于是有研究者嘗試聯(lián)用DNA甲基轉移酶抑制劑和HDACi，結果表明二者協(xié)同的克隆效率確實高于單獨用藥，提供了聯(lián)合用藥的思路[43-44]。

綜上所述，HDACi 在干細胞自我更新及定向分化中有著重要的調控作用，同時還參與體細胞重編程過程，這方面的研究極大豐富了人們對體內胚胎發(fā)育進程的認識，有助于體外控制干細胞向特定譜系的定向分化，提高誘導分化效率，改善組織再生療法策略，在干細胞治療領域有著廣闊的應用前景。但其中涉及到具體機制及生物學意義還有待深入闡明。