徐 赫，潘麗娟，陳明娜，陳 娜，王 通，王 冕，禹山林，梁成偉，遲曉元*

(1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生是我國重要的油料作物[1]和經(jīng)濟作物[2]，廣泛栽培于北方地區(qū)?；ㄉ秃伙柡椭舅?0%以上(其中油酸41.2%，亞油酸37.6%)，還含有軟脂酸、硬脂酸和花生酸等飽和脂肪酸，是一種較易消化的植物油，但油脂儲藏過程發(fā)生酸敗會使品質(zhì)下降。令人欣喜的是近些年有研究發(fā)現(xiàn)[3]，油質(zhì)蛋白有增強產(chǎn)品穩(wěn)定性的作用。因此尋求優(yōu)質(zhì)油質(zhì)蛋白基因，延長產(chǎn)品貨架期，顯得尤為重要。

油質(zhì)蛋白是一種特殊的結(jié)構(gòu)蛋白，在種子中存在且高效表達[4]?？勺鳛橥庠吹鞍椎妮d體，將油質(zhì)基因與目的基因融合后經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因新型種子[5]，經(jīng)過研磨、離心等處理后獲得目的基因。這種目的基因即為油質(zhì)融合蛋白，此蛋白在營養(yǎng)成分及品質(zhì)上有了極大提高[6]。過去，人們對Oleosin基因在擬南芥[7]、玉米[8]、大豆[9]、向日葵[10]、油菜[11]等植物中的生物學功能作了大量研究，但是對于花生中Oleosin基因的研究卻相對較少[12]。

本文從花生中克隆獲得了3個新的油質(zhì)蛋白基因，分別命名為AhOleosin22a，AhOleosin22b，AhOleosin22c。其基因登錄號分別為KP109927，KP109928，KP109929。本文對該基因的表達特性進行了初步研究，為今后的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用品種花育33號。參照郝翠翠等[13]的方法進行品種取樣前處理。

1.2 總RNA提取與cDNA合成、目的基因的擴增

根據(jù)NCBI上搜索到的擬南芥的油質(zhì)蛋白序列，從花生cDNA文庫中找到了3個油質(zhì)蛋白基因全長序列：AhOleosin22a，AhOleosin22b，AhOleosin22c。引物序列為：AhOleosin22-F：5'-ATGGCTACTGCTACTGATCG-3'；AhOleosin22-R：5'-CTAGAGCTTTAAATTAATATTTTC-3'。參照陳娜等[14-15]的方法進行反轉(zhuǎn)錄。用cDNA作模板，通過PCR擴增得到目的基因。

1.3 氨基酸序列分析

ProtParam：蛋白的物理化學參數(shù)；TMHMM 2.0 Server：蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；SCRATCH Protein Predicter Tool：蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.4 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

為了研究Oleosin的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們從NCBI，phytozome，peanutbase數(shù)據(jù)庫下載了Oleosin的蛋白序列：擬南芥(Arabidopsisthaliana)，大豆(Glycinemax)，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，油菜(Brassicarapa)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)，狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)，相思豆(Abrusrecatorius)，花生野生種(Arachisipaensis)和(Arachisduranensis)。采用ClustalW軟件對搜索獲得的序列進行多序列比對分析[16]，采用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建。

1.5 熒光定量PCR

熒光定量采用Actin11作為內(nèi)參基因，3次重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)使用2-△△Cp方法分析[17]。采用如下引物：

qAhOleosin22-F: 5'-ACGGTACCATGGCTGAC

ATTCAACA-3'；

qAhOleosin22-R:5'-ATTCTGCAGTCAGGACG

ATGTTTTCTT-3'；

qACT11-F:5'-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3'；

qACT11-R:5'-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhOleosin22a，AhOleosin22b和AhOleosin22c基因克隆

AhOleosin22a基因全長為630bp，編碼210個氨基酸；AhOleosin22b基因全長為636bp，編碼212個氨基酸；AhOleosin22c基因全長582bp，編碼194個氨基酸(圖1，圖2和圖3)。

2.2 氨基酸序列分析

對AhOleosin22a，AhOleosin22b和AhOleosin22c基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析。AhOleosin22a蛋白的理論分子量為22.04 kD，理論等電點為6.06。AhOleosin22a包含的210個氨基酸殘基中，Ser(S)含量最高，占總氨基酸的13.8%，其次為Ala(A)和Thr(T)，分別占總氨基酸的11.9%和10.5%。帶負電的氨基酸有19個(Asp+Glu)，帶正電的氨基酸有17個(Arg+Lys)。親水指數(shù)為0.157，不穩(wěn)定系數(shù)48.49，屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AhOleosin22a有3個跨膜結(jié)構(gòu)，推測AhOleosin22a屬于跨膜類蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool結(jié)果顯示：AhOleosin22a含α-螺旋94個，占44.76%；α-延伸26個，占12.38%；無規(guī)則卷曲90個，占 42.86%。AhOleosin22b蛋白的理論分子量為22.09 kD，理論等電點為5.76。AhOleosin22b包含的212個氨基酸殘基中，Ser(S)含量最高，占總氨基酸的14.2%，其次為Ala(A)，Thr(T)分別占總氨基酸的12.3%，10.4%。帶負電的氨基酸有19個(Asp+Glu)，帶正電的氨基酸有16個(Arg+Lys)。親水指數(shù)為0.131，不穩(wěn)定系數(shù)是50.25，屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AhOleosin22b有3個跨膜結(jié)構(gòu)，推測AhOleosin22b屬于跨膜類蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool結(jié)果顯示：AhOleosin22b含α-螺旋98個，占46.23%；延伸鏈24個，占11.32%；無規(guī)則卷曲90個，占 42.45%。AhOleosin22c蛋白的理論分子量20.74kD，理論等電點為5.58。AhOleosin22c包含的194個氨基酸殘基中，Ser(S)含量最高，占總氨基酸的13.4%，其次為Ala(A)，Leu(L)分別占總氨基酸的12.9%，10.3%。帶負電的氨基酸17個(Asp+Glu)，帶正電的氨基酸12個(Arg+Lys)。親水指數(shù)0.021，不穩(wěn)定系數(shù)是53.51，屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AhOleosin22c有3個跨膜結(jié)構(gòu)，推測AhOleosin22c屬跨膜類蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool結(jié)果顯示：AhOleosin22c含α-螺旋95個，占48.97%；延伸鏈19個，占9.79%；無規(guī)則卷曲80個，占41.24%。

圖1 AhOleosin22a基因的核苷酸及氨基酸序列

圖2 AhOleosin22b基因的核苷酸及氨基酸序列

圖3 AhOleosin22c基因的核苷酸及氨基酸序列

多序列比對分析顯示，AhOleosin22a和AhOleosin22b與花生野生種(Arachisipaensis)序列相似性最高，均達到了100%，AhOleosin22a與相思豆(Abrusrecatorius)相似性最低(52.98%)，而AhOleosin22b與馬鈴薯(Solanum tuberosum)相似性最低(47.95%)。AhOleosin22c與花生栽培種(Arachisduranensis)序列相似性最高(99.45%)，與馬鈴薯(Solanumtuberosum)相似性最低(47.59%)。編碼蛋白與其他植物蛋白Oleosin22序列同源，因此可能有著共同的祖先[18](圖4)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖5所示，AhOleosin22a，AhOleosin22b和AhOleosin22c與野生種花生油質(zhì)蛋白基因聚在一起，大豆、狹葉羽扇豆、相思豆、擬南芥(NP_186806)油質(zhì)蛋白聚在一起，形成一個分支。而擬南芥(NP_198858)油質(zhì)蛋白基因與油菜、馬鈴薯、紫花苜蓿基因聚在一起，形成另外一個分支。

圖4 AhOleosin22蛋白與其他物種的油質(zhì)蛋白的氨基酸序列比對

圖5 植物Oleosin22基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 基因的表達特性分析

熒光定量PCR分析顯示(圖6)，AhOleosin22基因在種子中的表達量最高。在種子發(fā)育過程中，AhOleosin22基因表達量呈現(xiàn)下降的趨勢。

如圖7所示，在多種逆境和激素處理下，AhOleosin22基因的表達呈現(xiàn)不同的模式，表明它可能參與了花生逆境脅迫抗性的調(diào)節(jié)過程[18]。低溫和過氧化氫處理24 h時，基因表達量最高。高鹽和干旱處理后12 h時基因表達出現(xiàn)峰值。水楊酸和脫落酸處理12h時，基因的表達量遠高于其他時期，均為0 h對照的7倍。茉莉酸和乙烯利處理24 h時，基因表達量最高，分別為0 h對照的20倍和10倍。赤霉素處理8h，基因表達量達到最高，約為0 h對照的4倍。

圖6 AhOleosin22基因在花生不同組織和種子不同發(fā)育時期的表達分析

圖7 AhOleosin22基因在非生物逆境脅迫和激素處理下的表達分析

3 結(jié)論及討論

油質(zhì)蛋白是存在于某些植物脂質(zhì)貯存組織中的蛋白質(zhì)，和磷脂一起包圍在油質(zhì)體外面起到穩(wěn)定作用[19]?；ㄉ唾|(zhì)蛋白在花生中高水平積累且擁有表達外源蛋白較好的效果。

本文首先對AhOleosin22的基因與蛋白序列進行分析總結(jié)了很多理化參數(shù)，發(fā)現(xiàn)了該基因所編碼的蛋白以α-螺旋構(gòu)型為主，且有跨膜結(jié)構(gòu)，極有可能為跨膜蛋白。利用TMHMM 2.0 Server預(yù)測，其中AhOleosin22的3個跨膜區(qū)分別為26～48位、52～74位、81～103位?？缒さ鞍椎氖杷畢^(qū)往往也是其跨膜區(qū)，因此這三個區(qū)域擁有較強的疏水作用，疏水作用是油體穩(wěn)定的基礎(chǔ)[20]，也是解決油質(zhì)酸敗問題的研究方向。

其次，多序列分析與進化樹的構(gòu)建將該蛋白與其他物種的親緣性更好地定位，最后采用熒光定量將該基因在不同條件下進行表達，也十分直觀地表達了不同時間不同處理的結(jié)果差異是十分顯著的。本文的熒光定量實驗中發(fā)現(xiàn)該基因在種子中表達顯著，推測出油質(zhì)蛋白的啟動子可能具有較強的特異性，這與曹儀植、楊素鈾的結(jié)論相一致[21]。

這些發(fā)現(xiàn)與探索為油質(zhì)蛋白在基因工程的進一步研究提供了良好的理論基礎(chǔ)，為油質(zhì)蛋白在花生品質(zhì)的改良方向開辟了一片新天地。