甄軍波，劉 迪，宋世佳，劉琳琳，蔡 肖，張 曦，李海山，遲吉娜

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050051)

胚胎發(fā)育晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant proteins, LEA)最早在棉花中發(fā)現(xiàn)，是在棉花種子成熟后期大量積累的一類親水蛋白，在水稻、大麥、小麥、玉米和擬南芥等植物中均有LEA家族基因的報(bào)道。根據(jù)LEA家族基因氨基酸的序列特征，可以將LEA蛋白家族分為LEA1、LEA2、LEA3、LEA4、LEA5、LEA6、SMPS和dehydrins 8個(gè)亞組，每一個(gè)亞組都具有獨(dú)特的氨基酸保守區(qū)域[1]。研究表明，LEA家族基因不僅存在于植物的種子中，在幼苗、芽和根等部位也能檢測到該基因家族的存在[2-6]。同時(shí)，在細(xì)菌和無脊椎動(dòng)物中也檢測到了LEA蛋白的存在。LEA家族基因廣泛參與植物生長發(fā)育、形態(tài)建成和衰老等生物學(xué)過程，在高鹽、干旱等非生物脅迫下，LEA蛋白還能夠?qū)χ仓昶鸬疥P(guān)鍵的保護(hù)作用[6-7]。Wang等[8]從丹參中分離得到LEA2家族的SmLEA2基因，該基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因丹參的耐旱性和耐鹽性。Lü等[9]從百慕大草中克隆得到了2個(gè)dehydrins亞家族基因，CdDHN4-L和CdDHN4-S，2個(gè)基因編碼的氨基酸序列相差1個(gè)φ片段，均能夠顯著提高擬南芥對于高鹽脅迫的抗性以及大腸桿菌對于高鹽和極端溫度的耐性，并且轉(zhuǎn)CdDHN4-L比轉(zhuǎn)CdDHN4-S的效果更加明顯。LEA蛋白家族在植物應(yīng)答生物脅迫中也發(fā)揮重要作用，玉米LEA3亞組成員在煙草中過表達(dá)后，提高了對假單胞致病菌的耐性[10]，在大腸桿菌中過表達(dá)擬南芥LEA2和LEA4亞組成員能顯著抑制細(xì)菌的生長[11]。

研究人員最早從棉花中發(fā)現(xiàn)LEA蛋白家族，并對LEA基因家族的序列特征和表達(dá)模式進(jìn)行了初步的研究[4, 12-14]。Luo等[15-16]從棉花中分離得到LEA4亞組的D113基因的啟動(dòng)子片段，啟動(dòng)子序列中含有與LEA蛋白特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，并能夠受ABA、高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。劉峰等[17]從棉花新陸早33中分離得到了D34基因啟動(dòng)子的同源序列，并驗(yàn)證了其表達(dá)模式。Magwanga等[6]利用公布的棉花基因組數(shù)據(jù)，分別從陸地棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉中分離得到242，136和142個(gè)LEA家族基因，并將這些家族成員分為8個(gè)亞組，大多數(shù)LEA家族成員與棉花耐旱性有關(guān)，LEA基因家族成員在耐旱材料夏威夷棉中的表達(dá)量明顯高于干旱敏感的陸地棉材料。Magwanga等[18]的研究表明，陸地棉LEA2家族成員，CotAD_20020、CotAD_21924和CotAD_59405能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長和耐旱性?？梢姡藁ㄖ蠰EA基因家族在棉花逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。本研究從棉花均一化cDNA文庫中篩選得到2個(gè)棉花LEA家族的基因，命名為GhLEA和GhLEAG1，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和非生物脅迫條件下的表達(dá)模式分析，旨在為進(jìn)一步研究棉花LEA家族基因的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試陸地棉品種冀228為生物技術(shù)課題組保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理方法 參照Zhang等[19]、甄軍波等[20-21]的方法種植冀228水培苗，并對幼苗進(jìn)行NaCl處理(150 mmol/L)、ABA(100 μmol/L)處理和17% PEG6000處理，對照和脅迫處理的根、莖和葉分別于脅迫處理后0，1，2，3，6，24 h取樣；纖維取樣：棉花開花后8DPA、12DPA、16DPA、20DPA、24DPA、30DPA和35DPA樣品分別取樣。所有樣品均液氮速凍，用于RNA提取。

1.2.2 棉花RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 采用天根試劑盒(DP441)提取棉花RNA；采用TaKaRa (RR0037A)試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.3 LEA基因的克隆和序列分析 在對文庫測序結(jié)果的分析過程中，從中篩選得到59號和378號2個(gè)克隆，用ORFfinder 對59號和378號克隆包含完整的開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測，利用BlastX進(jìn)行基因的同源性比對，用ClustalX和MEGA 4.0進(jìn)行序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DANMAN預(yù)測蛋白理化性質(zhì)，NetPhos 3.1預(yù)測氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)，SOMPA和Phyre2分別預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，MEME預(yù)測氨基酸序列的保守motif，并用TBtools繪制motif組成圖[21]。

1.2.4 棉花LEA基因表達(dá)分析 用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)LEA基因的熒光定量PCR引物(表1)，選取Histone3為內(nèi)參基因，qRT-PCR反應(yīng)參照TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行溶解曲線分析，采用Bio-rad熒光定量PCR儀，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。用Bio-Rad CFX Manager(2-ΔΔCT法)和Origin 6.0分析處理試驗(yàn)結(jié)果[21]。

表1 試驗(yàn)中所用的引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花LEA基因的克隆和序列分析

通過對本研究室前期構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行分析，59號克隆和378號克隆均包含一個(gè)完整的開放閱讀框。PCR擴(kuò)增2個(gè)基因的全長，與cDNA文庫測序結(jié)果完全一致。在NCBI網(wǎng)站，利用BlastX程序進(jìn)行分析比對，59號克隆和378號克隆分別編碼一個(gè)棉花胚胎發(fā)育晚期富集蛋白家族基因成員，根據(jù)比對結(jié)果，將其命名為GhLEA和GhLEAG1，登錄號分別為KF906314和KF906316。GhLEA全長948 bp，編碼315個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)4.4，分子質(zhì)量為35 ku，GhLEAG1全長756 bp，編碼251個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)10.76，分子質(zhì)量27 ku，2個(gè)基因DNA序列相似度為36.93%，氨基酸序列相似度為10.44%。

2.2 棉花GhLEA和GhLEAG1基因進(jìn)化樹及保守基序分析

選取GhLEA、GhLEAG1、SmLEA(AAU29064.3)、SmLEA2(HQ676610)和部分?jǐn)M南芥LEA家族成員構(gòu)建了氨基酸序列進(jìn)化樹(圖1)，結(jié)果表明，GhLEA、SmLEA和SmLEA2同屬于LEA2家族，GhLEA和SmLEA2具有更近的親緣關(guān)系，其與At2G44060和SmLEA2的motif組成模式一致，均包含了motif1/2/6/7，motif6在LEA2家族中高度保守。GhLEAG1與擬南芥LEA3家族的成員劃分在一個(gè)亞組，但分支成員之間的motif組成不完全相同，GhLEAG1由motif3/9組成，AT3G53770和AT4G15910由motif3/10組成，GhLEA5-D、AT4G02380和AT1G02820則由motif3/8組成，可見motif3在LEA3家族成員中高度保守。

A.棉花GhLEA、GhLEAG1和部分?jǐn)M南芥LEA氨基酸序列進(jìn)化樹分析; B.棉花GhLEA、GhLEAG1和部分?jǐn)M南芥LEA蛋白保守基序組成。 A. Phylogenetic tree analysis of GhLEA, GhLEAG1 and closely related Arabidopsis LEA proteins; B. Motif analysis of GhLEA, GhLEAG1 and closely related Arabidopsis LEA proteins.

2.3 棉花LEA基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

參考甄軍波等[21]的方法，利用NetPhos分析GhLEA和GhLEAG1的磷酸化位點(diǎn)(圖2)，GhLEA肽鏈具有較多的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)較少，GhLEAG1肽鏈中蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)明顯增多，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)較少。用SOPM法分析GhLEA蛋白的二級結(jié)構(gòu)，GhLEA蛋白包括22.22%的α-螺旋，25.71%的延伸鏈，6.03%的β-轉(zhuǎn)角和46.03%的無規(guī)則卷曲，GhLEAG1蛋白包括18.33%的α-螺旋，33.07%的延伸鏈，3.59%的β-轉(zhuǎn)角和45.02%的無規(guī)則卷曲，通過預(yù)測2個(gè)蛋白的三級結(jié)構(gòu)可以看出(圖3)，兩者在三級結(jié)構(gòu)上也存在明顯的差別。

2.4 棉花LEA基因表達(dá)模式分析

分別研究了GhLEA和GhLEAG12個(gè)基因在纖維中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，GhLEA在棉纖維發(fā)育20DPA時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，同時(shí)，在根、莖和葉片中，GhLEA在根中的表達(dá)量最高，在葉片中的表達(dá)量最低(圖4-A)。GhLEAG1在棉纖維中的表達(dá)量峰值同樣出現(xiàn)在20DPA，在莖中的表達(dá)量最高(圖4-B)。GhLEA可能只在棉纖維發(fā)育時(shí)期中的伸長期發(fā)揮作用，而GhLEAG1在伸長期及次生壁加厚期均可能發(fā)揮比較重要的作用。

A.GhLEA; B.GhLEAG1。

A.GhLEA三維結(jié)構(gòu); B.GhLEAG1三維結(jié)構(gòu)。 A.Predicted 3D structure of GhLEA; B. Predicted 3D structure of GhLEAG1.

誤差線上的不同大寫字母表示0.01水平差異顯著(P<0.01)。 A. GhLEA基因在不同組織中的表達(dá)模式; B.GhLEAG1基因在不同組織中的表達(dá)模式。 Bars superscripted by different capital letters mean significant difference(P<0.01). A.Tissue expression analysis of GhLEA; B.Tissue expression analysis of GhLEAG1.

分別驗(yàn)證了GhLEA和GhLEAG1在NaCl、PEG和ABA非生物脅迫條件下的表達(dá)模式。在NaCl處理?xiàng)l件下，GhLEA在根、莖和葉片中的表達(dá)量均有升高，在莖和葉片中的表達(dá)量峰值現(xiàn)在處理后3 h，在根中的表達(dá)量峰值則出現(xiàn)在處理后6 h。在PEG處理?xiàng)l件下，GhLEA在根的表達(dá)量逐漸下降，在莖中的表達(dá)量呈先降后升的趨勢，在處理后6 h表達(dá)量達(dá)到最低，24 h后表達(dá)量恢復(fù)至對照水平。葉片中的表達(dá)量則呈上升趨勢，峰值出現(xiàn)在處理后3 h。在棉花幼苗受到ABA處理?xiàng)l件下，GhLEA的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在處理后3 h(圖5-A)。通過圖5-B可以看出，GhLEAG1的表達(dá)模式同GhLEA具有明顯的區(qū)別。在高鹽脅迫條件下，GhLEAG1在根中的表達(dá)量迅速下降，在莖中的表達(dá)量則是輕微的波動(dòng)，而在葉片中的表達(dá)量則是顯著提高，并且在處理后3 h達(dá)到峰值。在受到PEG處理時(shí)，GhLEAG1在根中的表達(dá)量同樣是迅速下降，在莖中的表達(dá)量在6 h開始下降，在葉片中的表達(dá)量則出現(xiàn)在處理后6 h達(dá)到峰值。GhLEAG1同樣受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量在處理后6 h達(dá)到峰值。

誤差線上的不同大寫字母表示0.01水平差異顯著(P<0.01)。A.GhLEA基因表達(dá)模式分析; B.GhLEAG1基因表達(dá)模式分析。 Bars superscripted by different capital letters mean significant difference(P<0.01).A. Expression analysis of GhLEA; B.Expression analysis of GhLEAG1.

3 討論

棉花中前期已經(jīng)報(bào)道了GhD-7、GhD11、GhD-19、GhD-29、GhLEA14-A、GhLEA5-D、GhLEAD-113、GhLEAD-34等8個(gè)LEA蛋白家族成員，根據(jù)其氨基酸序列的相似度和motif組成，這8個(gè)家族成員分別屬于LEA1-5及Dehydrin家族成員[8]。陸地棉LEA2蛋白家族成員最多，有157個(gè)家族成員，根據(jù)其序列和motif結(jié)構(gòu)組成可以將其分為6個(gè)亞組[18]。

本研究從棉花均一化cDNA文庫中的2個(gè)LEA蛋白家族成員GhLEA和GhLEAG1，分別編碼315，251個(gè)氨基酸，與棉花中已報(bào)道的8個(gè)LEA蛋白家族成員分析比對，GhLEA和GhLEAG1屬于新的LEA家族成員。研究結(jié)果表明，GhLEA屬于棉花LEA2中的一員，GhLEAG1則屬于LEA3亞組，qRT-PCR結(jié)果表明，兩者在棉花纖維、根、莖和葉片中均有表達(dá)，兩者均受高鹽、PEG和ABA等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但是GhLEA和GhLEAG1可能在棉纖維發(fā)育的伸長期和次生壁加厚期分別發(fā)揮作用，兩者在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上也具有比較明顯的差異。Gao等[22]研究結(jié)果表明，即使在同一個(gè)亞組中，不同成員由于其motif組成及表達(dá)模式的差異，在功能上也會(huì)有所差異。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，GhLEA與丹參SmLEA和SmLEA2具有較近的親緣關(guān)系，都屬于LEA2家族成員，但是由于SmLEA由motif4/5/6組成，GhLEA、SmLEA2和SmLEA分別在不同的分支上。Hundertmark和Hincha[3]研究表明，At2G44060能夠受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。Wang等[8]和Wu等[23]的研究結(jié)果也表明，SmLEA和SmLEA2均能夠提高大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因丹參的耐鹽性，但是其組織部位表達(dá)特異性存在差異，可能與其motif組成有關(guān)。GhLEA也能受到高鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，且GhLEA與At2G44060和SmLEA2的motif組成模式完全一致，推測其可能與SmLEA2具有相似的功能。植物L(fēng)EA3家族成員也可能參與生物和非生物脅迫應(yīng)答[5]。GhLEAG1則屬于棉花LEA3家族，與棉花中已經(jīng)克隆的GhLEA5-D同在一個(gè)亞組，但是motif組成模式具有一定的差別，可能屬于LEA3亞家族中的一個(gè)小分支，與GhLEA5-D等基因發(fā)揮不同的作用。